小鼠腹腔巨噬細(xì)胞準(zhǔn)備

1、peritoneal macrophage cell preparation 1. 小鼠頸椎脫臼處死， 75%酒精浸泡 3 分鐘，取出小鼠，置于無(wú)菌紙上，腹 面朝上； 2. 用鑷子提起小鼠下腹部皮膚，剪開(kāi)一小口，撕開(kāi)皮膚，完全暴露腹膜； 3. 10ml注射器裝上大號(hào)針頭，注入 6 ml Hanks液或 PBS，用鑷子提起腹 膜，向腹腔中注入 Hanks液，針尖朝上，避開(kāi)腸和脂肪，回抽腹腔液，不同方 向沖洗數(shù)次，吸出腹腔液； 4. 細(xì)胞懸液離心 200 g1分0 鐘，用 Hanks液洗一次，用 RPMI16405%小牛 血清懸起細(xì)胞， 2106細(xì)胞/ ml. 5. 細(xì)胞懸液置入培養(yǎng)瓶， 37度培

2、養(yǎng) 2 小時(shí)后，吸棄上清，用預(yù)熱培養(yǎng)基洗 二次，留下貼壁細(xì)胞； 6. 含 10 mM EDTA的 PBS加入培養(yǎng)瓶，覆蓋細(xì)胞， 37度孵育 20分鐘，用吸 管用力吹打下細(xì)胞，或用橡皮擦帚輕輕刮下細(xì)胞，即為腹腔巨噬細(xì)胞，純度一 般大于 90%，每只小鼠平均可得 2106腹腔巨噬細(xì)胞。 注: 1. 雌性小鼠 6-8 周最適用。雄性小鼠腸壁脂肪多。不利于腹腔液收集； 2. 在沖洗過(guò)程中應(yīng)小心，以免刺破血管或腸壁，血液流入腹腔液； 3. 吸出的腹腔液應(yīng)洗后再貼壁，否則有血漿膜形成，影響貼壁； 4. 貼壁巨噬細(xì)胞分離有較多方法，如利多卡因孵育，但大多不理想，故細(xì)胞 分離后應(yīng)用臺(tái)盼蘭染色檢測(cè)活力； 5.

3、橡皮擦帚可自制，用自行車氣門(mén)芯上的橡皮管套在預(yù)先折彎的滴管尖頭 上，滅菌后使用，較為實(shí)用； 1/ 4 6. 炎性巨噬細(xì)胞的制備可用 3%的脫水硫羥乙酸培養(yǎng)基 2ml，注入小鼠腹 腔，4 天后同法集腹腔細(xì)胞，每只小鼠腹腔細(xì)胞產(chǎn)量可以增加到3107細(xì)胞左 右。需指出的是炎性巨噬細(xì)胞的功能活性與正常腹腔巨噬細(xì)胞有很大差異。 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取的經(jīng)驗(yàn)方法總結(jié)如下： 第一： 用刺激物質(zhì)的方法，一般都是在實(shí)驗(yàn)前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉（應(yīng) 該現(xiàn)配現(xiàn)用，否則效果較差）每只 2ML。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將小鼠斷頭處死，置于 1%的 新潔爾滅或者 75%的乙醇溶液中浸泡 23MIN，消毒皮膚。于無(wú)菌環(huán)境下向腹 腔注入

4、 HANKS液 8ML，用手輕輕擠壓腹壁 20 次以上，吸出灌洗液。將灌洗液 離心 2000R/MIN，5MIN，棄去上清，用 HANKS洗滌 3 次，合并小鼠細(xì)胞，用含 15%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，記數(shù)，調(diào)整腹腔細(xì)胞濃度為 2*10*6/ML ，將腹腔細(xì)胞加入 24孔培養(yǎng)板中， 1ML/孔，于 37攝氏度， 5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 34 小時(shí)，使巨噬細(xì)胞貼壁，取出培養(yǎng)板，棄去上清夜，用 HANKS也反復(fù)吹洗培養(yǎng)孔 3 遍，除去非粘附細(xì)胞，即為巨噬細(xì)胞單層 .（炎性巨 噬細(xì)胞，即激活的巨噬細(xì)胞） 第二種： 不加刺激物質(zhì)的提取方法： 1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，拉頸處死小鼠，用 75

5、%酒精消毒。 2 用帶 9 號(hào)針頭的 5ML 注射器腹腔注入含 75%小牛血清的 HANKS液 （ 5%NBSHBSS）輕柔腹部吸出腹腔液體（內(nèi)含腹腔細(xì)胞 0，反復(fù)抽吸幾次。 3 1500 R/MIN 離心 8MIN ，用 5%NBSHBSS洗 2 次。 4 將腹腔細(xì)胞用含 10%小牛血清 1640 液（ 10%NBS1640）配成 2*10#6/ML 加到 24孔平底培養(yǎng)板中， 1ML/孔， 5% CO2溫箱孵育 2H 5 每孔用 5%NBSHBSS洗 3 次，棄去未粘附細(xì)胞，貼壁細(xì)胞為巨噬細(xì)胞單 層 2/ 4 6 要注射，可用 6%淀粉肉湯注射，每次 1ml, 連續(xù)注射兩天，第三天即可提

6、取。 7用 FACS鑒定細(xì)胞純度為 70%左右，重復(fù) 9次，穩(wěn)定 見(jiàn)免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)該是這一本書(shū)， 2001 出版的 自己作這個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，考慮了方方面面的問(wèn)題。 1. 因?yàn)橐鬅o(wú)菌操作，所以取腹腔細(xì)胞的時(shí)候，盡量在無(wú)菌造作臺(tái)上進(jìn)行。 無(wú)菌操作臺(tái)事先要消毒。 2. 為避免交叉感染，每一只小鼠我只用一個(gè)針頭，為了節(jié)約我只買(mǎi)了4 個(gè)注 射器，只換針頭即可！ 3. 事先我也想到了，如果有的小鼠即便注射了 5%小牛血清 HANKS，在抽取 的時(shí)候也未必能抽出液體，因此事先準(zhǔn)備了開(kāi)腹的手術(shù)器材；刀子，鑷子等， 事先一定要高溫消毒。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，有的小鼠真的沒(méi)有取出液體，然后我就開(kāi) 腹腔了。這一步一定要注意

7、操作，要有無(wú)菌意識(shí)。 鑒定： Macrophages were indentified by the following features: i) adherence to culture plates; ii) morphological features resembling monuclear cells after Giemsa staing; iii) the capacity to take up carbon particles; ii) positive immunohistochemistry with antibady for CD68 1 腹腔分離出的細(xì)胞有兩種： 大的巨嗜細(xì)胞和小紅細(xì)胞。如果腹膜剪開(kāi)能不損傷大血管的話，紅細(xì)胞很 少，離心后可以看到白白的沉淀，否則有紅色沉淀。不過(guò)培養(yǎng)貼壁后，紅細(xì)胞 可以洗下來(lái)；或者 3 天后死亡。對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)影響。也就是說(shuō)不需要特意鑒定。 3/ 4 2 剛分離的巨噬細(xì)胞沒(méi)有變形，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，可以看到它們逐 漸變成多角形，體積比其他細(xì)胞大一些，具有貼壁的特征，胞質(zhì)有明顯的顆粒 狀物質(zhì)。 3 當(dāng)然進(jìn)一步的驗(yàn)證可以用瑞氏染液和姬姆薩染液來(lái)檢驗(yàn)。 4 表面標(biāo)志可以鑒定巨噬細(xì)胞的純度 ED1（CD68）大多數(shù)組織巨噬細(xì)胞上表達(dá) ; ED2（CD163）主要表達(dá)于 50腹膜巨噬細(xì)胞、部分脾巨噬細(xì)胞