第三章微生物育種

1、第三章：微生物育種第三章：微生物育種 微生物育種，無論從自然變異選擇還是人工誘變的選擇，都是微生物育種，無論從自然變異選擇還是人工誘變的選擇，都是 建立在遺傳和變異的基礎上的。建立在遺傳和變異的基礎上的。 工業(yè)微生物育種技術的發(fā)展，大致經歷了如下階段：工業(yè)微生物育種技術的發(fā)展，大致經歷了如下階段： 自然選育自然選育 微生物純種培養(yǎng)法發(fā)明之后，開始了微生物純種的自然選育。如微生物純種培養(yǎng)法發(fā)明之后，開始了微生物純種的自然選育。如 當時的酒精發(fā)酵當時的酒精發(fā)酵 ，純系良種的推廣，扭轉了酒精生產不穩(wěn)定的現(xiàn)象。這是最，純系良種的推廣，扭轉了酒精生產不穩(wěn)定的現(xiàn)象。這是最 早應用微生物遺傳學原理于微生物育

2、種實踐的一個實例。早應用微生物遺傳學原理于微生物育種實踐的一個實例。 誘變育種誘變育種 40Beadle和和Tatum“一個基因一種酶一個基因一種酶”學說的提出，意味著遺傳學說的提出，意味著遺傳 學從細胞水平發(fā)展到分子水平，促進了工業(yè)微生物育種技術的發(fā)展。如抗生學從細胞水平發(fā)展到分子水平，促進了工業(yè)微生物育種技術的發(fā)展。如抗生 素工業(yè)的興起。素工業(yè)的興起。 代謝控制育種代謝控制育種 以以50Glu發(fā)酵成功為標志，其優(yōu)勢在于以誘變育種為基礎，發(fā)酵成功為標志，其優(yōu)勢在于以誘變育種為基礎， 打破了微生物調節(jié)機制這一天然屏障，獲得各種解除或繞過了微生物正常代打破了微生物調節(jié)機制這一天然屏障，獲得各種解

3、除或繞過了微生物正常代 謝途徑的突變株，從而人為地積累有用產物。代謝控制育種謝途徑的突變株，從而人為地積累有用產物。代謝控制育種 的興起意味著誘的興起意味著誘 變育種發(fā)展到理性階段，導致了氨基酸、核苷酸及某些次生代謝產物的高產變育種發(fā)展到理性階段，導致了氨基酸、核苷酸及某些次生代謝產物的高產 菌株大批投入生產。菌株大批投入生產。 誘變育種是發(fā)酵工業(yè)育種的重要手段和技術，目前幾乎所誘變育種是發(fā)酵工業(yè)育種的重要手段和技術，目前幾乎所 有工業(yè)生產菌種都經過誘變處理。有工業(yè)生產菌種都經過誘變處理。 1、遺傳性狀穩(wěn)定、遺傳性狀穩(wěn)定 2、純凈無污染、純凈無污染 3、繁殖力強、生長速度快、短時間內能產生所需

4、產物、繁殖力強、生長速度快、短時間內能產生所需產物 4、能誘變產生遺傳性變異、能誘變產生遺傳性變異 5、產量高、收得率高、產量高、收得率高 從自然界分離的野生菌株，在產量或質量上均難適合工業(yè)從自然界分離的野生菌株，在產量或質量上均難適合工業(yè) 化生產的要求。理想的工業(yè)生產菌種必須具備：化生產的要求。理想的工業(yè)生產菌種必須具備： 微生物育種的途徑：誘變、雜交、基因工程微生物育種的途徑：誘變、雜交、基因工程 誘變育種：誘變育種：是以人工手段誘發(fā)微生物基因突變，改變其遺傳是以人工手段誘發(fā)微生物基因突變，改變其遺傳 結構和功能，從中篩選出產量高、性狀優(yōu)良的突變株，結構和功能，從中篩選出產量高、性狀優(yōu)良的

5、突變株， 并并 設計出適合該突變株最佳的培養(yǎng)基和條件，使其在最適的工設計出適合該突變株最佳的培養(yǎng)基和條件，使其在最適的工 藝條件下最有效地合成產物。藝條件下最有效地合成產物。 誘變育種有以下幾個優(yōu)點：誘變育種有以下幾個優(yōu)點：速度快，收效大、方法簡單。速度快，收效大、方法簡單。 第一節(jié)第一節(jié) 誘變育種誘變育種 分三個階段：分三個階段：菌種基因型改變，菌種基因型改變， 突變體篩選，產量評估突變體篩選，產量評估 誘變育種的三大要素：誘變育種的三大要素：誘變劑、誘變條件、篩選技術。誘變劑、誘變條件、篩選技術。 出發(fā)菌株的選擇與純化出發(fā)菌株的選擇與純化 單孢子（單細胞）懸液的制備單孢子（單細胞）懸液的制

6、備 誘變劑及誘變劑量的選擇誘變劑及誘變劑量的選擇 誘變處理方法誘變處理方法 高產菌株的分離高產菌株的分離 誘變育種的步驟誘變育種的步驟 對出發(fā)菌株的要求：對出發(fā)菌株的要求： (1)從自然界樣品中分離篩選出來的野生菌株，雖然產量從自然界樣品中分離篩選出來的野生菌株，雖然產量 較低，但對誘變因素敏感，變異幅度大，正突變率高；較低，但對誘變因素敏感，變異幅度大，正突變率高； (2)在生產中使用的，具有一定生產能力，并且在生產過在生產中使用的，具有一定生產能力，并且在生產過 程中經過自然選育的菌株；程中經過自然選育的菌株； (3)采用具有有利性狀的菌株，如生長速度快、營養(yǎng)要求采用具有有利性狀的菌株，如

7、生長速度快、營養(yǎng)要求 低以及產孢子早而多的菌株；低以及產孢子早而多的菌株； 一、出發(fā)菌株一、出發(fā)菌株 (4)有些菌株在發(fā)生某一變異后會提高對其他誘變因素的敏感有些菌株在發(fā)生某一變異后會提高對其他誘變因素的敏感 性，故有時可考慮選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為出發(fā)菌株。性，故有時可考慮選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為出發(fā)菌株。 例如，在金霉素生產菌株中，曾發(fā)現(xiàn)以分泌黃色色素的菌株作出發(fā)菌株時，例如，在金霉素生產菌株中，曾發(fā)現(xiàn)以分泌黃色色素的菌株作出發(fā)菌株時， 只會使產量下降，而以失去色素的變異菌株作出發(fā)菌株時，則產量會不斷只會使產量下降，而以失去色素的變異菌株作出發(fā)菌株時，則產量會不斷 提高；提高； (

8、5)采用一類被稱為采用一類被稱為“增變菌株增變菌株”的變異菌株，它們對誘變劑的變異菌株，它們對誘變劑 的敏感性比原始菌株大為提高，更適宜作為出發(fā)菌株；的敏感性比原始菌株大為提高，更適宜作為出發(fā)菌株； (6)在選擇產核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時，應考慮能累積少在選擇產核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時，應考慮能累積少 量所需產物或其前體的菌株量所需產物或其前體的菌株; 而在選擇產抗生素的出發(fā)菌株而在選擇產抗生素的出發(fā)菌株 時，最好選擇已通過幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價都有一定程時，最好選擇已通過幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價都有一定程 度提高的菌株作為出發(fā)菌株度提高的菌株作為出發(fā)菌株。 連續(xù)誘變育種過程中如何選擇出

9、發(fā)菌株連續(xù)誘變育種過程中如何選擇出發(fā)菌株 突變株的產量是數量遺傳，只能逐步累加，一次性大幅度提高突變株的產量是數量遺傳，只能逐步累加，一次性大幅度提高 發(fā)酵水平不太容易。發(fā)酵水平不太容易。 在選擇出發(fā)菌株時，應挑選每代誘變處理后均有一些表型上改在選擇出發(fā)菌株時，應挑選每代誘變處理后均有一些表型上改 變的菌株，如發(fā)酵單位有一定程度的提高、形態(tài)上發(fā)生過一次變的菌株，如發(fā)酵單位有一定程度的提高、形態(tài)上發(fā)生過一次 變異或產生過回復突變的菌株等，以利于突變率的增加。變異或產生過回復突變的菌株等，以利于突變率的增加。 幾乎每代出發(fā)菌株分別在發(fā)酵單位、菌落大小、菌落結構或顏色、基質菌絲幾乎每代出發(fā)菌株分別在

10、發(fā)酵單位、菌落大小、菌落結構或顏色、基質菌絲 顏色、可溶性色素以及生長速度等表型發(fā)生過變異，繼續(xù)經誘變處理，產量顏色、可溶性色素以及生長速度等表型發(fā)生過變異，繼續(xù)經誘變處理，產量 又有顯著的提高。又有顯著的提高。 菌號菌號誘變代數誘變代數菌落大小菌落大小 /cm/cm 菌落表面菌落表面 結構結構 菌落顏色菌落顏色可溶性色可溶性色 素素 變株效價變株效價 提高提高/%/% 454145411 11.31.3平滑疏松平滑疏松龜背灰綠龜背灰綠赭石赭石100100 710467104610100.80.8平滑緊密平滑緊密白白火泥棕火泥棕20112011 B-53B-5311110.60.6平滑緊密平滑

11、緊密白白海螺橙海螺橙26422642 C-04C-04自然分離后自然分離后0.50.5平滑緊密平滑緊密白白淡可可棕淡可可棕35473547 D-756D-75613130.40.4平滑緊密平滑緊密白白魚鰓紅魚鰓紅69116911 表：灰黃霉素高產菌表：灰黃霉素高產菌D-756誘變系譜菌誘變系譜菌 株表型變異與產量遞增的關系株表型變異與產量遞增的關系 頭孢菌素頭孢菌素C產生菌產生菌C-20誘變系譜菌株表型變異與產量遞增關系誘變系譜菌株表型變異與產量遞增關系 菌株編號菌株編號抗生素產量抗生素產量 /%/% 表型特征表型特征 菌落直徑菌落直徑基質菌絲顏色基質菌絲顏色其他其他 C-1C-1100100

12、 組織松組織松, ,生長速度快生長速度快 C-2 UVC-2 UV213213 組織緊密組織緊密, ,生長速度慢生長速度慢 C-3 NMC-3 NM548548乳白乳白 生長速度快生長速度快 C-4 XC-4 X射線射線8298298-11.58-11.5檸檬黃檸檬黃 菌落表面不規(guī)則紋蜜集菌落表面不規(guī)則紋蜜集 C-7 UV+LC-7 UV+L112011207-87-8檸檬黃檸檬黃 沉沒培養(yǎng)形成菌團沉沒培養(yǎng)形成菌團 C-8 UVC-8 UV161016106-86-8檸檬黃檸檬黃 菌苔變厚菌苔變厚, ,紋變疏紋變疏 C-15 NTGC-15 NTG263026304-54-5鵝黃鵝黃 菌落邊緣

13、不規(guī)則菌落邊緣不規(guī)則, ,生長較慢生長較慢 C-17 EMSC-17 EMS302830284.5-5.24.5-5.2( (邊緣檸檬黃邊緣檸檬黃) ) 菌苔稍增厚菌苔稍增厚 C-19 NSC-19 NS322332238-98-9乳黃乳黃 菌苔厚菌苔厚, ,邊緣規(guī)則邊緣規(guī)則, ,放射紋疏放射紋疏 C-20 EMSC-20 EMS400040008-98-9粉玉色粉玉色 菌苔扁薄菌苔扁薄, ,邊齊邊齊, ,放射紋密放射紋密 這些表型上改變了的菌株，說明已動搖了遺傳穩(wěn)定性，繼續(xù)處理，對這些表型上改變了的菌株，說明已動搖了遺傳穩(wěn)定性，繼續(xù)處理，對 誘變劑的敏感性就提高了，因而容易發(fā)生變異，易于達到

14、育種目的誘變劑的敏感性就提高了，因而容易發(fā)生變異，易于達到育種目的 出發(fā)菌株的純化出發(fā)菌株的純化 純種分離方法，常用劃線分離法和稀釋平板法。純種分離方法，常用劃線分離法和稀釋平板法。 在誘變育種中，出發(fā)菌株的純化雖然是輔助手段，但在誘變育種中，出發(fā)菌株的純化雖然是輔助手段，但 它是不可缺少的技術步驟，例如前面的例子中，灰黃它是不可缺少的技術步驟，例如前面的例子中，灰黃 霉素變種霉素變種B-53，經自然分離，獲得的變株，經自然分離，獲得的變株C-04的產的產 量比前者顯著提高。量比前者顯著提高。 在誘變育種中，所處理的細胞必須是單細胞、均勻的懸在誘變育種中，所處理的細胞必須是單細胞、均勻的懸 液

15、狀態(tài)。這樣一方面分散狀態(tài)的細胞可以均勻地接觸誘變液狀態(tài)。這樣一方面分散狀態(tài)的細胞可以均勻地接觸誘變 劑，另一方面又可避免長出不純菌落。劑，另一方面又可避免長出不純菌落。 菌懸液是直接供誘變處理的，由出發(fā)菌株的孢子或菌體菌懸液是直接供誘變處理的，由出發(fā)菌株的孢子或菌體 細胞與生理鹽水或緩沖液制備而成，其質量將直接影響誘細胞與生理鹽水或緩沖液制備而成，其質量將直接影響誘 變效果。對菌懸液的制備有如下的要求：變效果。對菌懸液的制備有如下的要求： 二、單孢子（單細胞）懸液的制備二、單孢子（單細胞）懸液的制備 n供試菌株的孢子或菌體要年輕、健壯供試菌株的孢子或菌體要年輕、健壯 ： 供試細胞培養(yǎng)物要新鮮，

16、細胞生理活性方面既要同步，又要供試細胞培養(yǎng)物要新鮮，細胞生理活性方面既要同步，又要 處在最旺盛的對數期，這樣突變率高，重現(xiàn)性好。對細菌來處在最旺盛的對數期，這樣突變率高，重現(xiàn)性好。對細菌來 說，常常通過前培養(yǎng)達到要求。說，常常通過前培養(yǎng)達到要求。 通常絲狀菌菌株由于遺傳分離產生不純現(xiàn)象，一個多核細胞通常絲狀菌菌株由于遺傳分離產生不純現(xiàn)象，一個多核細胞 經誘變劑處理后，某個核發(fā)生有益的突變易被其他尚未突變經誘變劑處理后，某個核發(fā)生有益的突變易被其他尚未突變 的核競爭性地抑制，多核菌體會降低單位存活菌的突變率的核競爭性地抑制，多核菌體會降低單位存活菌的突變率 n制備菌懸液時，采取分散法，使細菌或孢

17、子團塊在培養(yǎng)制備菌懸液時，采取分散法，使細菌或孢子團塊在培養(yǎng) 液或懸浮液中充分分散，力求液或懸浮液中充分分散，力求90%以上為單孢子。并務必以上為單孢子。并務必 除去菌絲片段，因為一般菌絲是多核的。除去菌絲片段，因為一般菌絲是多核的。 n菌懸液的濃度，要求霉菌孢子濃度約為菌懸液的濃度，要求霉菌孢子濃度約為106mL-1，放線，放線 菌孢子濃度約為菌孢子濃度約為106-107mL-1。菌懸液的孢子或細菌數可。菌懸液的孢子或細菌數可 用平板計數、血球計數器計數和光密度法測定。用平板計數、血球計數器計數和光密度法測定。 n制備菌懸液通常采用生理鹽水。如果用化學誘變劑處理制備菌懸液通常采用生理鹽水。如

18、果用化學誘變劑處理 時，應采用相應的緩沖液配制，以防處理過程中時，應采用相應的緩沖液配制，以防處理過程中pH變化而變化而 影響誘變效果。影響誘變效果。 1、誘變劑種類選擇：、誘變劑種類選擇： 不同微生物對同一種誘變劑敏感性有很大區(qū)別，這不僅有不同微生物對同一種誘變劑敏感性有很大區(qū)別，這不僅有 細胞透性的差異，也與誘變劑進入細胞后相互作用不一致細胞透性的差異，也與誘變劑進入細胞后相互作用不一致 有關（修復機制）。有關（修復機制）。 u根據誘變劑作用機理，再結合菌種特性來選擇誘變劑種根據誘變劑作用機理，再結合菌種特性來選擇誘變劑種 類。類。例如，灰黃霉素野生菌使用氯化鋰、紫外線效果好；頭孢例如，灰

19、黃霉素野生菌使用氯化鋰、紫外線效果好；頭孢C產生產生 菌比較有效的誘變劑是紫外線、氯化鋰、甲基磺酸乙酯、博萊霉素；菌比較有效的誘變劑是紫外線、氯化鋰、甲基磺酸乙酯、博萊霉素； 青霉素生產菌以亞硝基胍、氮芥、乙烯亞胺等烷化劑更為適合。青霉素生產菌以亞硝基胍、氮芥、乙烯亞胺等烷化劑更為適合。 u對遺傳穩(wěn)定的出發(fā)菌株，最好采用以前未使用過的、突對遺傳穩(wěn)定的出發(fā)菌株，最好采用以前未使用過的、突 變譜較寬的、誘變率高的強誘變劑。變譜較寬的、誘變率高的強誘變劑。 u對遺傳不穩(wěn)定的出發(fā)菌株，采用溫和誘變劑。對遺傳不穩(wěn)定的出發(fā)菌株，采用溫和誘變劑。 u對誘變史較長的高產菌株，如多次使用某一誘變劑，可對誘變史較

20、長的高產菌株，如多次使用某一誘變劑，可 能出現(xiàn)能出現(xiàn)“鈍化鈍化”現(xiàn)象，此時則需改用另外的誘變劑?，F(xiàn)象，此時則需改用另外的誘變劑。 三、誘變劑及誘變劑量的選擇三、誘變劑及誘變劑量的選擇 2、最佳劑量的選擇：、最佳劑量的選擇： 經長期誘變后的高產菌株、遺傳性狀不太穩(wěn)定的菌株，宜經長期誘變后的高產菌株、遺傳性狀不太穩(wěn)定的菌株，宜 用較溫和的誘變劑和較低劑量處理。用較溫和的誘變劑和較低劑量處理。 要篩選具有特殊性狀的菌株、較大幅度提高產量的菌株，要篩選具有特殊性狀的菌株、較大幅度提高產量的菌株， 則用強誘變劑和高劑量處理。則用強誘變劑和高劑量處理。 對野生低產菌株，開始用高劑量，然后逐步用低劑量處理。

21、對野生低產菌株，開始用高劑量，然后逐步用低劑量處理。 對多核細胞菌株，用高劑量處理。對多核細胞菌株，用高劑量處理。 誘變處理方式：誘變處理方式： 單因子處理：是采用單一誘變劑處理（一般突變率低）單因子處理：是采用單一誘變劑處理（一般突變率低） 復合因子處理：是指采用兩種以上誘變因素處理（突變率高）復合因子處理：是指采用兩種以上誘變因素處理（突變率高） 分下列幾種情況：分下列幾種情況： 1、兩個以上因子同時處理、兩個以上因子同時處理 2、不同誘變劑交替處理、不同誘變劑交替處理 3、同一誘變劑連續(xù)重復使用、同一誘變劑連續(xù)重復使用 4、紫外線光復活交替處理、紫外線光復活交替處理 復合因子處理中，為了

22、提高誘變效果，在具體使用時還復合因子處理中，為了提高誘變效果，在具體使用時還 要注意誘變劑處理先后和協(xié)同效應問題。要注意誘變劑處理先后和協(xié)同效應問題。 四、誘變處理方式四、誘變處理方式 五、影響突變率的因素五、影響突變率的因素 n菌種遺傳特性菌種遺傳特性 n菌體細胞壁結構菌體細胞壁結構 n培養(yǎng)條件和環(huán)境條件培養(yǎng)條件和環(huán)境條件 誘變前預培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)（突變體的修復、表型遲誘變前預培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)（突變體的修復、表型遲 延）延） 溫度、溫度、pH、氧氣等外界條件的影響、氧氣等外界條件的影響 平皿密度效應平皿密度效應 微生物通過誘變處理后，群體中產生各種類型突變體，有微生物通過誘變處理后，群體中產

23、生各種類型突變體，有 正突變、負突變和未突變的菌株，需要經過分離和篩選，正突變、負突變和未突變的菌株，需要經過分離和篩選， 逐一挑選出來。逐一挑選出來。 隨機突變，定向篩選。篩選的條件決定了選育的方向，設隨機突變，定向篩選。篩選的條件決定了選育的方向，設 計一個好的篩選方案是誘變育種的重要前提。計一個好的篩選方案是誘變育種的重要前提。 對抗性突變株或營養(yǎng)缺陷突變株，可用選擇性培養(yǎng)基進行對抗性突變株或營養(yǎng)缺陷突變株，可用選擇性培養(yǎng)基進行 篩選，以利于突變株的生長。篩選，以利于突變株的生長。 對產量突變株，高產和負變菌株都能在同一培養(yǎng)條件下生對產量突變株，高產和負變菌株都能在同一培養(yǎng)條件下生 長，

24、所以難以分辨。需要做大量的、艱苦的工作，建立表長，所以難以分辨。需要做大量的、艱苦的工作，建立表 型變異與產量的關系。型變異與產量的關系。 六、突變體的分離和篩選六、突變體的分離和篩選 出發(fā)菌株出發(fā)菌株 誘變誘變 絕大多數個體死亡絕大多數個體死亡少數存活少數存活 少數突變少數突變 多數未變多數未變 多數負變多數負變少數正變少數正變 少數變幅大少數變幅大 多數變幅小多數變幅小 少數宜投產少數宜投產多數不宜投產多數不宜投產 存活率存活率 突變率突變率 正變率正變率 高產率高產率 投產率投產率 1.基本環(huán)節(jié)基本環(huán)節(jié) 第一代：出發(fā)菌株第一代：出發(fā)菌株 分離到平皿上（有時還結合指示劑，呈色劑或底物等）分

25、離到平皿上（有時還結合指示劑，呈色劑或底物等） 挑選菌落挑選菌落 200個個 初篩初篩 1瓶瓶/株株 3-5株（提供第二代誘變出發(fā)菌株）株（提供第二代誘變出發(fā)菌株） 誘變誘變 50株復篩株復篩 2.常規(guī)篩選程序常規(guī)篩選程序 第二代：出發(fā)菌株第二代：出發(fā)菌株4株株 分離到平皿上（有時還結合指示劑，呈色劑或底物等）分離到平皿上（有時還結合指示劑，呈色劑或底物等） 挑菌落挑菌落 初篩初篩 1瓶瓶/株株 3-5株（提供第三代誘變出發(fā)菌株）株（提供第三代誘變出發(fā)菌株） 誘變誘變 挑挑50株復篩株復篩 100100個個 100100個個 100100個個 100100個個 第一代：出發(fā)菌株第一代：出發(fā)菌株

26、 分離到平皿上分離到平皿上 打瓊脂塊挑菌落打瓊脂塊挑菌落1000-3000 塊塊 挑取挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落 選選3-5株（提供第二代誘變出發(fā)菌株）株（提供第二代誘變出發(fā)菌株） 誘變誘變 初篩：初篩：1-2瓶瓶/株株 置于檢定板上置于檢定板上 選選30-50個菌株個菌株 復篩復篩 3.簡便篩選程序簡便篩選程序 第二代：出發(fā)菌株第二代：出發(fā)菌株4株株 分離到平皿上分離到平皿上 打瓊脂塊打瓊脂塊 挑取挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落 選選3-5株（提供第三代誘變出發(fā)菌株）株（提供第三代誘變出發(fā)菌株） 誘變

27、誘變 初篩：初篩：1-2瓶瓶/株株 置于檢定板上置于檢定板上 選選30-50個菌株個菌株 復篩復篩 1000 塊塊 1000 塊塊 1000 塊塊 1000 塊塊 第二節(jié)第二節(jié) 營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選 營養(yǎng)缺陷型：營養(yǎng)缺陷型：野生菌株經過人工誘變或自然突變失去合成某野生菌株經過人工誘變或自然突變失去合成某 種營養(yǎng)（氨基酸、維生素、核酸等）的能力，只有在基本培種營養(yǎng)（氨基酸、維生素、核酸等）的能力，只有在基本培 養(yǎng)基中補充所缺乏的營養(yǎng)因子才能生長，稱為營養(yǎng)缺陷型。養(yǎng)基中補充所缺乏的營養(yǎng)因子才能生長，稱為營養(yǎng)缺陷型。 營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出是通過一系列培養(yǎng)基來實現(xiàn)的。營養(yǎng)缺陷型菌株

28、的檢出是通過一系列培養(yǎng)基來實現(xiàn)的。 基本培養(yǎng)基（基本培養(yǎng)基（MM）：）：能維持野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基。能維持野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基。 補充培養(yǎng)基（補充培養(yǎng)基（SM）：）：為了鑒別某種缺陷型菌株，在基本培養(yǎng)為了鑒別某種缺陷型菌株，在基本培養(yǎng) 基中加入該菌株不能合成的營養(yǎng)因子，稱補充培養(yǎng)基?；屑尤朐摼瓴荒芎铣傻臓I養(yǎng)因子，稱補充培養(yǎng)基。 完全培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基（CM）：）：能滿足各種缺陷型菌株生長的培養(yǎng)基。能滿足各種缺陷型菌株生長的培養(yǎng)基。 營養(yǎng)缺陷型的誘變方法和所用的誘變因子與普通誘變育營養(yǎng)缺陷型的誘變方法和所用的誘變因子與普通誘變育 種基本相同，只是由于營養(yǎng)缺陷型屬于單一基因突變，各

29、種種基本相同，只是由于營養(yǎng)缺陷型屬于單一基因突變，各種 誘變劑的功能不同，有的不宜作為營養(yǎng)缺陷型誘變劑。如：誘變劑的功能不同，有的不宜作為營養(yǎng)缺陷型誘變劑。如： 電離輻射易引起染色體巨大損傷電離輻射易引起染色體巨大損傷 。 用于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型的誘變劑有亞硝基胍，紫外線、亞硝用于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型的誘變劑有亞硝基胍，紫外線、亞硝 酸等。其中亞硝基胍誘發(fā)頻率極高，一般可達酸等。其中亞硝基胍誘發(fā)頻率極高，一般可達10以上。以上。 一、營養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選一、營養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選 一般包括：誘發(fā)突變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型、鑒別一般包括：誘發(fā)突變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型、鑒別 缺陷種類

30、等缺陷種類等4個步驟。個步驟。 （一）營養(yǎng)缺陷型的誘發(fā)（一）營養(yǎng)缺陷型的誘發(fā) 在誘變后的存活菌體中營養(yǎng)缺陷型菌株的數量很少，在誘變后的存活菌體中營養(yǎng)缺陷型菌株的數量很少， 一般僅占存活菌體的百分之幾或千分之幾，而野生型細胞一般僅占存活菌體的百分之幾或千分之幾，而野生型細胞 卻大量存在，因而要采取一些措施，盡量淘汰野生型細胞，卻大量存在，因而要采取一些措施，盡量淘汰野生型細胞， 使缺陷型菌株得以富集，以利于檢出。常用的方法有抗生使缺陷型菌株得以富集，以利于檢出。常用的方法有抗生 素法和菌絲過濾法素法和菌絲過濾法 （二）淘汰野生型菌株（二）淘汰野生型菌株 1.抗生素法抗生素法 常用于細菌和酵母菌營

31、養(yǎng)缺陷型菌株的富集，前者用青常用于細菌和酵母菌營養(yǎng)缺陷型菌株的富集，前者用青 霉素法，后者用制霉菌素法。霉素法，后者用制霉菌素法。 青霉素法的原理為：青霉素法的原理為：細菌細胞壁的主要成分為肽聚糖類，細菌細胞壁的主要成分為肽聚糖類， 而青霉素能抑制細胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完而青霉素能抑制細胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完 整的細胞壁。處在生長繁殖過程的細菌對青霉素十分敏感，整的細胞壁。處在生長繁殖過程的細菌對青霉素十分敏感， 因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處于休止狀態(tài)的細因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處于休止狀態(tài)的細 菌。菌。 制霉菌素法原理：制霉菌素法原理：制霉菌素作用于

32、真菌細胞膜上的甾醇，制霉菌素作用于真菌細胞膜上的甾醇， 引起細胞膜的損傷，殺死生長繁殖過程的真菌，起到富集引起細胞膜的損傷，殺死生長繁殖過程的真菌，起到富集 營養(yǎng)缺陷型菌株的作用。營養(yǎng)缺陷型菌株的作用。 (1)將誘變處理后的菌體用完全培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)將誘變處理后的菌體用完全培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)2-3代以結代以結 束表型延遲現(xiàn)象，達到穩(wěn)定的表型和生理狀況。束表型延遲現(xiàn)象，達到穩(wěn)定的表型和生理狀況。 (2)將經完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌體進行離心、洗滌，轉移到將經完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌體進行離心、洗滌，轉移到 基本培養(yǎng)中進行饑餓培養(yǎng)基本培養(yǎng)中進行饑餓培養(yǎng)4-6h，以消耗從完全培養(yǎng)基中攝，以消耗從完全培養(yǎng)基中攝 取

33、并儲存在體內的氮素營養(yǎng)，使其停止生長，防止被以后取并儲存在體內的氮素營養(yǎng)，使其停止生長，防止被以后 加入的青霉素殺死。加入的青霉素殺死。 (3)再轉移到含無機氮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)再轉移到含無機氮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4h，使野生型細，使野生型細 胞剛剛進入對數期，加入一定濃度的青霉素（革蘭陰性菌胞剛剛進入對數期，加入一定濃度的青霉素（革蘭陰性菌 約約600-1000gmL，革蘭陽性菌約，革蘭陽性菌約 50gmL） 青霉素淘汰細菌野生型細菌的方法和步驟：青霉素淘汰細菌野生型細菌的方法和步驟： (4)經涂抹培養(yǎng)后，統(tǒng)計完全培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基平皿上菌經涂抹培養(yǎng)后，統(tǒng)計完全培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基平皿上菌 落的差數

34、，確定哪一種青霉素濃度的樣品中含缺陷型數量落的差數，確定哪一種青霉素濃度的樣品中含缺陷型數量 最大，則可從該試樣中進一步分離營養(yǎng)缺陷型。最大，則可從該試樣中進一步分離營養(yǎng)缺陷型。 由于青霉素的加入，致使大量野生型細胞壁瓦解、死亡，由于青霉素的加入，致使大量野生型細胞壁瓦解、死亡， 釋放出細胞內的許多物質，其中有的被缺陷型菌株作為營養(yǎng)利釋放出細胞內的許多物質，其中有的被缺陷型菌株作為營養(yǎng)利 用而生長繁殖，最終也被青霉素破壞，造成缺陷型篩選率大為用而生長繁殖，最終也被青霉素破壞，造成缺陷型篩選率大為 下降。下降。 為防止這一情況發(fā)生，可在基本培養(yǎng)基中加入為防止這一情況發(fā)生，可在基本培養(yǎng)基中加入 2

35、0蔗糖蔗糖 以提高滲透壓。阻止細胞原生質體破裂外滲，使缺陷型菌株免以提高滲透壓。阻止細胞原生質體破裂外滲，使缺陷型菌株免 遭殺傷。再把培養(yǎng)物移入到不含青霉素的低滲溶液中，稀釋，遭殺傷。再把培養(yǎng)物移入到不含青霉素的低滲溶液中，稀釋， 涂皿分離。涂皿分離。 2菌絲過濾法菌絲過濾法 真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本培養(yǎng)基中真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本培養(yǎng)基中 能萌發(fā)長成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā)。能萌發(fā)長成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā)。 把誘變處理后的孢子移入到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)把誘變處理后的孢子移入到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)1Oh 左右，使野生型孢子萌發(fā)的菌絲剛剛肉

36、眼可見，用滅菌的左右，使野生型孢子萌發(fā)的菌絲剛剛肉眼可見，用滅菌的 脫脂棉、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔脫脂棉、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3-4h 過濾一次，重復過濾一次，重復3-4次，最大限度地除去野生型細胞。然后次，最大限度地除去野生型細胞。然后 稀釋，涂皿分離。稀釋，涂皿分離。 3高溫差別殺菌法高溫差別殺菌法 利用芽孢菌類的芽孢和營養(yǎng)體對熱敏感性的差異，讓利用芽孢菌類的芽孢和營養(yǎng)體對熱敏感性的差異，讓 誘變后的細菌形成芽孢，然后把處在芽孢階段的細菌轉移誘變后的細菌形成芽孢，然后把處在芽孢階段的細菌轉移 到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一定時間，野生型芽孢萌發(fā)，到基本培養(yǎng)液中

37、，振蕩培養(yǎng)一定時間，野生型芽孢萌發(fā)， 而營養(yǎng)缺陷型芽孢不能萌發(fā)。而營養(yǎng)缺陷型芽孢不能萌發(fā)。 此時將培養(yǎng)物加熱到此時將培養(yǎng)物加熱到80，維持一定時間，野生型細，維持一定時間，野生型細 胞大部分被殺死，缺陷型則得以保留，起到了濃縮作用。胞大部分被殺死，缺陷型則得以保留，起到了濃縮作用。 1點植對照法點植對照法 誘變后的孢子或菌體，經富集培養(yǎng)，涂布分離在完全培誘變后的孢子或菌體，經富集培養(yǎng)，涂布分離在完全培 養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，待菌落孢子成熟后，用滅菌的牙簽養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，待菌落孢子成熟后，用滅菌的牙簽 或接種針把每個菌落上的孢子或菌體分別接到基本培養(yǎng)基或接種針把每個菌落上的孢子或菌體分別接到基

38、本培養(yǎng)基 和完全培養(yǎng)基平板上的相應位置，每皿約點接和完全培養(yǎng)基平板上的相應位置，每皿約點接 3040點，點， 同時培養(yǎng)，然后觀察對比菌落生長情況。同時培養(yǎng)，然后觀察對比菌落生長情況。 (三三)營養(yǎng)缺陷型的檢出營養(yǎng)缺陷型的檢出 誘變后的微生物群體，濃縮后野生型細胞和營養(yǎng)缺陷型細誘變后的微生物群體，濃縮后野生型細胞和營養(yǎng)缺陷型細 胞數量比例發(fā)生了很大變化，但終究還是個混合體，要設胞數量比例發(fā)生了很大變化，但終究還是個混合體，要設 法把缺陷型從群體中分離檢出，有關方法介紹如下：法把缺陷型從群體中分離檢出，有關方法介紹如下： 如果基本培養(yǎng)基上不生長而完全培養(yǎng)基相應位置上生長的如果基本培養(yǎng)基上不生長而完

39、全培養(yǎng)基相應位置上生長的 菌落，可能為營養(yǎng)缺陷型。挑取孢子或菌體分別移接到基菌落，可能為營養(yǎng)缺陷型。挑取孢子或菌體分別移接到基 本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基斜面上，進一步復證。該法可靠性本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基斜面上，進一步復證。該法可靠性 強，但工作量很大。強，但工作量很大。 CM MMCM 2.影印法影印法 經富集后的孢子經富集后的孢子 或菌體分離在完全或菌體分離在完全 培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌 落成熟落成熟(稱母皿稱母皿)， 用滅菌后的特制用滅菌后的特制 “絲絨印模絲絨印?！痹谀冈谀?皿平板的菌落上輕皿平板的菌落上輕 輕一印，再轉印到輕一印，再轉印到 方位相同的另一基方位相同的另一基 本培養(yǎng)

40、基和完全培本培養(yǎng)基和完全培 養(yǎng)基的平板上。培養(yǎng)基的平板上。培 養(yǎng)后觀察比較菌落養(yǎng)后觀察比較菌落 生長情況生長情況。 采用影印法檢出霉菌營養(yǎng)缺陷型時，要注意兩點：采用影印法檢出霉菌營養(yǎng)缺陷型時，要注意兩點： 第一，防止菌落擴散和蔓延，可以在培養(yǎng)基中加入第一，防止菌落擴散和蔓延，可以在培養(yǎng)基中加入0.5左左 右的脫氧膽酸鈉，或在基本培養(yǎng)基中用山梨糖作為碳源，右的脫氧膽酸鈉，或在基本培養(yǎng)基中用山梨糖作為碳源， 再加入適量蔗糖使菌落長得小而緊密；再加入適量蔗糖使菌落長得小而緊密； 第二，為了克服孢子擴散而帶來不純現(xiàn)象，在操作方法上第二，為了克服孢子擴散而帶來不純現(xiàn)象，在操作方法上 可作如下改進：可作如

41、下改進： 當誘變后分離在完全培養(yǎng)基上的菌落尚未形成孢子之前，用一張當誘變后分離在完全培養(yǎng)基上的菌落尚未形成孢子之前，用一張 滅菌的薄紙覆蓋瓊脂平板上，繼續(xù)培養(yǎng)，待菌落的菌絲長到紙上后，滅菌的薄紙覆蓋瓊脂平板上，繼續(xù)培養(yǎng)，待菌落的菌絲長到紙上后， 把紙轉移到基本培養(yǎng)基平板上。此時薄紙上的菌絲向基本培養(yǎng)基表面把紙轉移到基本培養(yǎng)基平板上。此時薄紙上的菌絲向基本培養(yǎng)基表面 生長，便在相應位置上長出菌落。該法也有不足之處，薄紙易帶有完生長，便在相應位置上長出菌落。該法也有不足之處，薄紙易帶有完 全培養(yǎng)基成分，會把部分營養(yǎng)帶到基本培養(yǎng)基中，易造成誤差，故要全培養(yǎng)基成分，會把部分營養(yǎng)帶到基本培養(yǎng)基中，易造成

42、誤差，故要 進行幾個平皿的重復試驗。進行幾個平皿的重復試驗。 本法適用于細菌、酵母菌，其次對小型菌落的放線菌和霉菌也適本法適用于細菌、酵母菌，其次對小型菌落的放線菌和霉菌也適 用。用。 3夾層法夾層法 先在培養(yǎng)皿底部倒入一層基本培養(yǎng)基，凝固后，倒入含有先在培養(yǎng)皿底部倒入一層基本培養(yǎng)基，凝固后，倒入含有 菌體細胞的基本培養(yǎng)基，待凝固后，繼續(xù)加第三層基本培養(yǎng)菌體細胞的基本培養(yǎng)基，待凝固后，繼續(xù)加第三層基本培養(yǎng) 基。培養(yǎng)后平板上首先出現(xiàn)的菌落，為野生型菌落。此時在基。培養(yǎng)后平板上首先出現(xiàn)的菌落，為野生型菌落。此時在 平皿底部做好顏色標記。接著加上一層完全培養(yǎng)基，經培養(yǎng)，平皿底部做好顏色標記。接著加上

43、一層完全培養(yǎng)基，經培養(yǎng)， 如果在基本培養(yǎng)基上不長而在完全培養(yǎng)基上生長的小型菌落，如果在基本培養(yǎng)基上不長而在完全培養(yǎng)基上生長的小型菌落， 可能是營養(yǎng)缺陷型?？赡苁菭I養(yǎng)缺陷型。 4.限量補充培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法 該法有兩種情況，如果試驗的目的僅是檢出營養(yǎng)缺陷型該法有兩種情況，如果試驗的目的僅是檢出營養(yǎng)缺陷型 菌株，則其方法是將富集培養(yǎng)后的細胞接種到含有菌株，則其方法是將富集培養(yǎng)后的細胞接種到含有0.01 蛋白胨的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，野生型細胞迅速地長成蛋白胨的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，野生型細胞迅速地長成 大菌落，在平皿底部作好顏色標記，而生長緩慢的小菌落大菌落，在平皿底部作好顏色標記，而生長緩慢的

44、小菌落 可能是缺陷型，此稱限量培養(yǎng)；可能是缺陷型，此稱限量培養(yǎng)； 如果試驗目的是要定向篩選某種特定的缺陷型，則可在基如果試驗目的是要定向篩選某種特定的缺陷型，則可在基 本培養(yǎng)基中加入某種單一的氨基酸、維生素或堿基等物質，本培養(yǎng)基中加入某種單一的氨基酸、維生素或堿基等物質， 稱為補充培養(yǎng)。補充這些物質的數量可根據已有缺陷型進稱為補充培養(yǎng)。補充這些物質的數量可根據已有缺陷型進 行測定后加以確定。行測定后加以確定。 通過營養(yǎng)缺陷型檢出，僅僅了解突變體屬于營養(yǎng)缺陷型通過營養(yǎng)缺陷型檢出，僅僅了解突變體屬于營養(yǎng)缺陷型 菌株，只有通過鑒別測定，才能確定菌株屬于哪一類營養(yǎng)菌株，只有通過鑒別測定，才能確定菌株屬

45、于哪一類營養(yǎng) 缺陷型（如氨基酸、維生素類、堿基類）或更具體的是缺缺陷型（如氨基酸、維生素類、堿基類）或更具體的是缺 陷哪一種營養(yǎng)因子（缺哪種氨基酸或哪種維生素陷哪一種營養(yǎng)因子（缺哪種氨基酸或哪種維生素)。 所以缺陷型菌株的鑒定，實際上就是測定營養(yǎng)缺陷菌株所所以缺陷型菌株的鑒定，實際上就是測定營養(yǎng)缺陷菌株所 需的生長因子種類。需的生長因子種類。 (四四) 營養(yǎng)缺陷型的鑒定營養(yǎng)缺陷型的鑒定 1.鑒定方法鑒定方法 營養(yǎng)缺陷型的鑒定方法可分成兩大類：一種方法是在一個營養(yǎng)缺陷型的鑒定方法可分成兩大類：一種方法是在一個 子皿中加入一種營養(yǎng)物質以測定多株缺陷型菌株子皿中加入一種營養(yǎng)物質以測定多株缺陷型菌株(

46、1050 株株)對該生長因子的需求情況。對該生長因子的需求情況。 第二種方法是在同一平皿上測定一種缺陷型菌株對許多種第二種方法是在同一平皿上測定一種缺陷型菌株對許多種 生長因子的需求情況，稱為生長譜法。生長因子的需求情況，稱為生長譜法。 2.營養(yǎng)缺陷型鑒定步驟：營養(yǎng)缺陷型鑒定步驟： 測定缺陷型菌株所需生長因子的類別測定缺陷型菌株所需生長因子的類別 具體測缺陷該類別物質中的哪種生長因子具體測缺陷該類別物質中的哪種生長因子 用單一生長因子進行復證試驗。用單一生長因子進行復證試驗。 氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸類。氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸類。 酵母浸出液，其中氨基

47、酸、維生素、嘌呤、嘧啶均具有。酵母浸出液，其中氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶均具有。 維生素混合物，代表維生素類。維生素混合物，代表維生素類。 核酸堿基混合液或酵母核酸核酸堿基混合液或酵母核酸(0.1堿水解物堿水解物)，代表嘌呤、嘧啶類。，代表嘌呤、嘧啶類。 通常分別用以下物質來代表氨基酸、維生素、核酸堿基：通常分別用以下物質來代表氨基酸、維生素、核酸堿基： (1)缺陷型類別的測定缺陷型類別的測定 先選擇缺陷型菌株所需用的類別代表物質：先選擇缺陷型菌株所需用的類別代表物質： 用于營養(yǎng)缺陷型測定的氨基酸有用于營養(yǎng)缺陷型測定的氨基酸有 21種。一般用種。一般用L-型氨基酸，型氨基酸， 而而DL-型氨基

48、酸雖然也可以使用，但要增加型氨基酸雖然也可以使用，但要增加1倍的濃度。倍的濃度。D- 型氨基酸由于微生物難以吸收利用，不能使用。型氨基酸由于微生物難以吸收利用，不能使用。 用于鑒別缺陷型菌株的維生素約有用于鑒別缺陷型菌株的維生素約有15種。種。 核酸堿基有核酸堿基有7種，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、種，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、 尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶。尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶。 要鑒定單缺氨基酸或維生素的營養(yǎng)缺陷型，較為簡便的方要鑒定單缺氨基酸或維生素的營養(yǎng)缺陷型，較為簡便的方 法是分組測定法。把法是分組測定法。把21種氨基酸，組合種氨基酸，組合6組，每組，每6種不同

49、氨種不同氨 基酸歸為一組。基酸歸為一組。 (2) 缺陷型所需生長因子的測定缺陷型所需生長因子的測定 組別組別 一一17891011 二二2712131415 三三3812161718 四四4913161920 五五51014171921 六六61115182021 組合生長因子組合生長因子 生長因子的配制方法：生長因子的配制方法： 把同一組的氨基酸粉末混合置于潔凈的瓶中，加入滅菌的把同一組的氨基酸粉末混合置于潔凈的瓶中，加入滅菌的 蒸餾水，充分溶解，置冰箱保存。蒸餾水，充分溶解，置冰箱保存。 配制濃度：配制濃度：用于放線菌測定的氨基酸約用于放線菌測定的氨基酸約1mgmL 用于霉菌測定的約用于霉

50、菌測定的約10mgmL 維生素一般維生素一般0.1mgmL 生物素、維生素生物素、維生素B12約約0.01mgmL 測定方法：測定方法：缺陷型菌株和基本培養(yǎng)基混合制成平板，把缺陷型菌株和基本培養(yǎng)基混合制成平板，把 6 組生長因子直接點加于同一瓊脂平板上，或用濾紙片沾取組生長因子直接點加于同一瓊脂平板上，或用濾紙片沾取 后覆于瓊脂平板上，培養(yǎng)后，觀察哪一組或哪兩個組區(qū)產后覆于瓊脂平板上，培養(yǎng)后，觀察哪一組或哪兩個組區(qū)產 生混濁生長圈，即可確定該菌株缺陷的生長因子。生混濁生長圈，即可確定該菌株缺陷的生長因子。 1、生產上：微生物育種，協(xié)助解除代謝反饋調控機制，達到、生產上：微生物育種，協(xié)助解除代謝

51、反饋調控機制，達到 大量積累中間產物或某種終產物的目的大量積累中間產物或某種終產物的目的 天冬氨酸天冬氨酸-半醛半醛 二氨基庚二酸二氨基庚二酸 賴氨酸賴氨酸 高絲氨酸高絲氨酸 甲硫氨酸甲硫氨酸 蘇氨酸蘇氨酸 2、作為雜交育種、重組育種的遺傳標記、作為雜交育種、重組育種的遺傳標記 3、遺傳學研究中，轉化、轉導、原生質體融合、質粒和轉座、遺傳學研究中，轉化、轉導、原生質體融合、質粒和轉座 子研究中的標記。子研究中的標記。 二、營養(yǎng)缺陷型突變株的應用二、營養(yǎng)缺陷型突變株的應用 黃色短桿菌的代謝過程 黃色短桿菌的代謝特點黃色短桿菌的代謝特點 天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶（AK），），是一個變構酶，并有是一

52、個變構酶，并有 兩個活性中心，分別受兩個活性中心，分別受LysLys、ThrThr的的協(xié)同反饋抑協(xié)同反饋抑 制制 協(xié)同反饋抑制：協(xié)同反饋抑制：該酶有多個活性中心，抑制物可以該酶有多個活性中心，抑制物可以 分別和某一個特定的活性中心結合，但是并不影響該分別和某一個特定的活性中心結合，但是并不影響該 酶的活性，只有當該酶的所有的活性中心都被抑制物酶的活性，只有當該酶的所有的活性中心都被抑制物 結合后，其活性才受到抑制。結合后，其活性才受到抑制。 天冬氨酰磷酸天冬氨酰磷酸 天冬氨酸天冬氨酸-半醛半醛 高絲氨酸高絲氨酸 高絲氨酸磷酸高絲氨酸磷酸 O-O-琥珀酸高絲氨酸琥珀酸高絲氨酸 二氫吡啶二氫吡啶-

53、2,6-2,6-二羧酸二羧酸 賴氨酸賴氨酸 蘇氨酸蘇氨酸 異亮氨酸異亮氨酸 蛋氨酸蛋氨酸 天冬氨酸天冬氨酸 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 兩個分支點的優(yōu)先合成機制兩個分支點的優(yōu)先合成機制 ： 優(yōu)先合成優(yōu)先合成HosHos，然后再優(yōu)先合成，然后再優(yōu)先合成MetMet 當當MetMet過量時過量時 阻遏阻遏琥珀酰高絲氨酸合成酶，使代謝流向合成琥珀酰高絲氨酸合成酶，使代謝流向合成ThrThr的的 方向進行方向進行 當當ThrThr過量時過量時 反饋抑制反饋抑制高絲氨酸脫氫酶，使代謝流向高絲氨酸脫氫酶，使代謝流向LysLys的合成上。的合成上。 （MetMetThrThrLysLys） 育種

54、途徑育種途徑 1.1.切斷或減弱代謝支路切斷或減弱代謝支路 切斷或減弱合成切斷或減弱合成Met Met 、ThrThr的分支途徑的分支途徑選育選育營養(yǎng)缺營養(yǎng)缺 陷型陷型或或滲漏滲漏突變株突變株 滲漏缺陷型滲漏缺陷型: :遺傳障礙不完全的突變型，其中某一種酶的活性遺傳障礙不完全的突變型，其中某一種酶的活性 下降而不是完全喪失，所以這種缺陷型能少量合成某種代下降而不是完全喪失，所以這種缺陷型能少量合成某種代 謝終產物，能在基本培養(yǎng)基上進行少量的生長。謝終產物，能在基本培養(yǎng)基上進行少量的生長。 由于由于滲漏缺陷型滲漏缺陷型不合成過量的終產物，所以不會造成不合成過量的終產物，所以不會造成 反饋抑制而影

55、響中間代謝產物的積累。反饋抑制而影響中間代謝產物的積累。 A A、需要選用、需要選用HomHomL L（ （L L，leakageleakage） 其意義在于實現(xiàn)優(yōu)先合成的轉換：可引起一種終其意義在于實現(xiàn)優(yōu)先合成的轉換：可引起一種終 產物的過量生成。產物的過量生成。 高比活性的高絲氨酸脫氫酶（高比活性的高絲氨酸脫氫酶（HDHD）使）使MetMet、 ThrThr優(yōu)先合成。若往培養(yǎng)基里添加過量的優(yōu)先合成。若往培養(yǎng)基里添加過量的MetMet，將，將 HDHD的活性控制在原來活性的的活性控制在原來活性的1/31/3，在野生株中也能，在野生株中也能 積累積累5g/L Lys5g/L Lys，進一步通過

56、，進一步通過突變突變將將HDHD比活性降低比活性降低 到原來活性的到原來活性的1/31/3，可積累，可積累20g/L Lys20g/L Lys。 在這樣低在這樣低 的比活性下，不添加的比活性下，不添加ThrThr和和MetMet，野生菌株也能正，野生菌株也能正 常生長。常生長。 但如果單獨過量添加一種但如果單獨過量添加一種ThrThr或或MetMet，反而由，反而由 于過剩的于過剩的ThrThr或或MetMet抑制或阻遏本來已經活力很低抑制或阻遏本來已經活力很低 的的HDHD使使ThrThr或或MetMet合成不足而抑制生長。合成不足而抑制生長。 結果：結果：由于由于HD活性下降但不完全喪失，

57、使代活性下降但不完全喪失，使代 謝流發(fā)生變化，使原來優(yōu)先合成謝流發(fā)生變化，使原來優(yōu)先合成Hos方向轉方向轉 向合成向合成Lys方向。而方向。而Thr和和Met少量合成，生少量合成，生 成的成的Thr的量不足以與的量不足以與Lys共同對共同對AK酶起協(xié)酶起協(xié) 同反饋抑制，就使同反饋抑制，就使Lys得以積累。得以積累。 B B、需要選用、需要選用Hom-Hom-，其意義在于： 解除了Hom的優(yōu)先合成機制，阻斷了代謝向Met、 Thr的方向進行，節(jié)省了原料，可以使Asp- 半醛這個中間代謝產物全部轉入Lys的生物合成 上。 在培養(yǎng)基中限量的供給Met 、Thr（或者Hom）， 對于AK酶活性的調節(jié)有

58、著重要意義。因為AK酶 是一個協(xié)同反饋抑制的變構酶，限制了其中某 一個抑制物（Thr），則Lys的濃度再高，也不 會影響到AK酶的活性，那么，代謝一直向著賴 氨酸合成的方向進行，使得產物的合成暢通無 阻。 雙重營養(yǎng)缺陷型突變株（Met- + Thr-）, 其本質和Hom- 相同。 優(yōu)點：遺傳性質穩(wěn)定，回復突變的幾率 少。 人工控制黃色短桿菌的代謝過程生產賴氨酸 三、抗阻遏和抗反饋突變型三、抗阻遏和抗反饋突變型 抗阻遏和抗反饋突變型都是由于代謝失調所造成的，它們抗阻遏和抗反饋突變型都是由于代謝失調所造成的，它們 都有共同的表型，即在細胞中已經有大量終產物時仍然持都有共同的表型，即在細胞中已經有大

59、量終產物時仍然持 續(xù)合成該產物，但失調的原因不同。續(xù)合成該產物，但失調的原因不同。 抗阻遏突變型抗阻遏突變型是由于調節(jié)基因發(fā)生突變或操縱基因發(fā)生突是由于調節(jié)基因發(fā)生突變或操縱基因發(fā)生突 變，使產生的阻遏蛋白不再能和代謝終產物結合或者結合變，使產生的阻遏蛋白不再能和代謝終產物結合或者結合 以后不能作用于已突變的操縱基因，因此盡管有很多終產以后不能作用于已突變的操縱基因，因此盡管有很多終產 物存在，細胞內仍然合成有關的酶去合成這些終產物。物存在，細胞內仍然合成有關的酶去合成這些終產物。 抗反饋突變型抗反饋突變型則是變構酶基因發(fā)生變化，使變構酶不再能則是變構酶基因發(fā)生變化，使變構酶不再能 和代謝終產

60、物結合，使合成代謝中的這一酶（一般是第一和代謝終產物結合，使合成代謝中的這一酶（一般是第一 個酶）仍具有催化活性，從而消除了反饋作用，使細胞能個酶）仍具有催化活性，從而消除了反饋作用，使細胞能 過量積累這一終產物。過量積累這一終產物。 抗阻遏和抗反饋突變型的選育抗阻遏和抗反饋突變型的選育 誘變處理后，選育結構類似物抗性突變株，這些突誘變處理后，選育結構類似物抗性突變株，這些突 變株就包括了抗阻遏和抗反饋二種類型突變。變株就包括了抗阻遏和抗反饋二種類型突變。 結構類似物是指一些和細菌體內氨基酸、嘌呤、維結構類似物是指一些和細菌體內氨基酸、嘌呤、維 生素等代謝產物結構相類似的物質。生素等代謝產物結