堵杰開題報(bào)告2

1、開題報(bào)告：放射自顯影法測(cè)定中藥對(duì)小鼠整體作用譜研究摘要: 目的: 研究不同中藥對(duì)小鼠器官組織機(jī)能影響的差異 方法：選用 10 味具 有寒熱藥性沒(méi)有異議的常用中藥，粉碎成 80 目細(xì)粉，制備成混懸液，以臨床常 用量的上限按體表面積折算成小鼠用量， 給小鼠灌胃。采用14c-2-脫氧葡萄糖 代謝放射自顯影等方法研究 10 味中藥在單次用藥 1 小時(shí)后不同性味的中藥對(duì)各 器官組織機(jī)能的影響。 結(jié)論：不同寒熱藥性的中藥之間不只是作用程度的量的差 別，還包含有作用于不同器官組織的質(zhì)的區(qū)分。關(guān)鍵詞：放射自顯影術(shù)；小鼠整體薄切片；寒熱中藥；作用譜1. 研究背景1.1放射自顯影術(shù) 放射自顯影術(shù)（ARG）是目前核

2、醫(yī)學(xué)在應(yīng)用研究當(dāng)中最具前景 的領(lǐng)域之一。 它對(duì)探討疾病的發(fā)病機(jī)制 1 、診斷和新藥開發(fā)，研究中藥藥 性2-4提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)平臺(tái)。各類物質(zhì)（如藥物 營(yíng)養(yǎng)成分、毒物等）在細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)經(jīng)常處于吸收、滲透、合成、轉(zhuǎn)移、分解 和排除的動(dòng)態(tài)過(guò)程， 存在于不斷更新與動(dòng)態(tài)平衡之中 5。運(yùn)用放射自顯影術(shù)， 不僅能準(zhǔn)確地測(cè)定體內(nèi)代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化， 而且可以確切地標(biāo)示出在組 織器官中不同水平的定位，尤其設(shè)計(jì)和運(yùn)用放射自顯影的不同水平示蹤術(shù)， 可以觀察在整體水平的、臟器水平的、細(xì)胞水平的和亞細(xì)胞水平或分子水平 的定位研究 6 ，并可與不同水平的組織結(jié)構(gòu)改變聯(lián)系起來(lái)觀察。1.2 葡萄糖代謝放射自

3、顯影 。本課題的主要貢獻(xiàn)在于：以整體 10卩m切片和放射自顯影術(shù)為主要技術(shù)平臺(tái)， 建立能夠描述小鼠整體器官、 組織、細(xì)胞各水平糖代謝變化的方法， 稱之為小鼠 整體薄切片放射自顯影術(shù)的方法。2 文獻(xiàn)綜述2.1 放射自顯影術(shù)的研究現(xiàn)狀 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)生命規(guī)律的認(rèn)識(shí)逐步由整體器官水平向細(xì)胞分子乃至基因水平深 入，核醫(yī)學(xué)在早期又稱為同位素學(xué)。核醫(yī)學(xué)的創(chuàng)立時(shí)期很難有明確的年限考證， 但核醫(yī)學(xué)是 20世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一門新興交叉學(xué)科是毫無(wú)疑問(wèn)的。一般認(rèn)為,1923年,G. Hevesy把同位素示蹤技術(shù)用于生物學(xué)中是核醫(yī)學(xué)史上的一個(gè)要里程碑。 放射性同位素在示蹤技術(shù)方面的應(yīng)用， 是核技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)重要組成部分。

4、放射 自顯影術(shù)不但具有能在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上觀察機(jī)能變化的特點(diǎn)， 而且還具有定位精 確，靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、可供定量和雙核素示蹤等優(yōu)點(diǎn)。所以，在近代醫(yī)學(xué)生 物各門學(xué)科， 尤其藥理學(xué)中的應(yīng)用占有十分重要地位。 放射自顯影術(shù)將要追蹤的 藥物用放射性核素標(biāo)記后，經(jīng)不同途徑將示蹤物引入體內(nèi)或作離體摻入等方法， 研究生理或病理狀態(tài)下各種放射性核素標(biāo)記在機(jī)體、 組織、 細(xì)胞中的分布、 定位 等動(dòng)態(tài)過(guò)程中的規(guī)律，以分析其合成、更新、排出、蓄積， 作用部位來(lái)闡明藥 物的作用機(jī)理， 為合理用藥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， 并可使其研究達(dá)到亞細(xì)胞水平及分子 水平，以圖像形式表達(dá)其生理功能。 如研究， 對(duì)鈾有明顯的解毒和促排效果的雙

5、 酚胺酸時(shí)，張建時(shí)等應(yīng)用了整體放射自顯影術(shù)和微光密度法對(duì)雙酚胺酸進(jìn)行了定 位、定量和分布的觀察 （10）。2.2 放射自顯影術(shù)中用到的幾種組織切片方法的種類和優(yōu)缺點(diǎn)2.2.1 冰凍切片法：是放射自顯影術(shù)中最常用的一種切片方法。 其最突出的優(yōu)點(diǎn)是可完全防止放射性 示蹤物在組織中擴(kuò)散或易位， 因而可以在放射自顯影中， 反應(yīng)出保留在機(jī)體生存 狀態(tài)時(shí)組織中全部呈游離態(tài)和結(jié)合態(tài)放射性示蹤物的確切位置和定量關(guān)系（10）。2.2.2 石蠟包埋切片法：石蠟包埋切片為常規(guī)制片技術(shù)， 是研究細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的常用方法， 也經(jīng)常 用于放射自顯影 （12）。石蠟切片法通過(guò)固定、脫水、透明和包埋等步驟，可以充 分洗脫

6、組織中游離態(tài)放射性示蹤物，而只保留與蛋白質(zhì)牢固結(jié)合的放射性示蹤 物。其優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好， 在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值， 能 切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰。塑料包埋切片法：常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類 （Glycol methacrylate, GMA，環(huán)氧樹脂類（Epon 812,618）及脲醛樹脂（UF類，其優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)作光鏡和電鏡檢測(cè)，塑料包 埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片，光鏡切片可薄至0.52卩m故稱半薄切片（ Semithin section ） （13）。以上切片方法較少用于放射自顯影術(shù)。3. 實(shí)驗(yàn)方法31 實(shí)驗(yàn)材料311 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： BI/F1 代雄性小鼠（購(gòu)置于上

7、海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公 司，系雄性BALB/C小鼠與雌性ICR小鼠交配所生產(chǎn)。清潔級(jí)，合格證號(hào)：SCXK （滬） 2007-0005），體重 18-22g， 42只312 實(shí)驗(yàn)儀器：滑動(dòng)切片機(jī)（萊卡 -1400）；自制小鼠冰凍固定器；電吹風(fēng)機(jī)（松下）；B測(cè)量?jī)x，WALLAC 1410, Pharmacia公司出品；制冷冷柜，新飛BC/BD-385，河南新鄉(xiāng)飛利浦電器有限公司生產(chǎn)；數(shù)碼相機(jī)。313 實(shí)驗(yàn)試劑： Ehrlich 蘇木素液；沉淀酸化伊紅 Y 乙醇液； 1%鹽酸酒精 溶液； 14C 2脫氧葡萄糖；高氯酸；雙氧水；無(wú)水乙醇；二甲苯； 2,5-二苯基 噁唑（PPO）;烏拉坦32 實(shí)驗(yàn)分

8、組 將小鼠稱重，性別和體重均衡后，分成 11 組：空白對(duì)照組 1 組 每組 6只），給藥組 10組（每組 3只） 。給藥組每組小鼠給予一味中藥灌胃，根 據(jù)臨床用藥劑量按體表面積計(jì)算給藥劑量， 灌胃。其中性寒藥 5 種，性熱藥 5 種，10組共給予10味中藥?？瞻讓?duì)照組給予同體積（按 0.1 ml/10 g體重）蒸餾 水。3. 3同位素引入 給予中藥后1h，所有小鼠（包括空白對(duì)照組）尾靜脈注射14C一 脫氧葡萄糖l2. 5 p,Ci/kg（體重）。2 h后，烏拉坦5g/kg處死動(dòng)物，一 80C速凍。 整體冷凍切片10卩m，把整體切片置于載玻片上，貼上寫好編號(hào)的14C-2脫氧 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)梯度放射源

9、，-20 C保存。3. 4放射自顯影 在上述載玻片滴上7.5%PPOC甲苯溶液，將涂完核乳膠的蓋玻 片覆蓋于載玻片上，置4C冰箱中進(jìn)行高速放射自顯影24小時(shí)。35 顯影、定影3 6 蘇木素 -伊紅染色37 數(shù)據(jù)采集 數(shù)碼相機(jī)拍攝整體組織切片及自顯影圖片。 通過(guò)在整體組織切片 上各組織、器官、細(xì)胞的位置，確定相應(yīng)自顯影圖片上各組織、器官、細(xì)胞的位 置，利用PHOTOSHOP軟件，獲取其影像的平均發(fā)光度。38 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)4. 可行性分析41 理論方面：近一個(gè)世紀(jì)的中藥現(xiàn)代化研究積累已證明中藥對(duì)機(jī)體有廣泛作 用，因此動(dòng)物口服后，總可以得到中藥對(duì)動(dòng)物各組織、器官、細(xì)胞影響的結(jié)果。中藥的廣泛作用可以

10、表現(xiàn)為， 在中藥干預(yù)下機(jī)體各組織、 器官、細(xì)胞對(duì)能量需求 的變化。通過(guò)放射自顯影方法，比較正常組與各用藥組對(duì)14C-2-脫氧葡萄糖攝入的改變，來(lái)了解器官、組織、細(xì)胞的這種機(jī)能變化。這種方法有利于研究中 藥性味歸經(jīng)等作用影響機(jī)體信息傳遞的部位及可能的機(jī)制。 技術(shù)方面：本課題通過(guò)改進(jìn)、整合現(xiàn)有的切片方法，使其符合小鼠整體薄切 片水平放射自顯影的要求。 運(yùn)用本課題的切片方法， 制備放射自顯影時(shí)， 可切出 10卩m的整體放射自顯影組織切片標(biāo)本，從而可以得到高分辨力的放射自顯影 圖，為完成課題提供了技術(shù)保障。 數(shù)據(jù)獲取和分析：本課題將逐步建立對(duì)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程， 所購(gòu)買的相應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析軟件，

11、 可大大簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)處理工作、 提高數(shù)據(jù)處理和分析的 準(zhǔn)確性和可靠性。5 進(jìn)度安排2009.3.2009.5 冰凍切片2009.5 核乳膠涂布（ 7d）放射自顯影過(guò)程（ 3d）顯影、定影及常規(guī)染色（ 7d） 數(shù)據(jù)采集及處理統(tǒng)計(jì) 1 月論文6 參考文獻(xiàn)1. 曹軍勝,徐文梅,孫志宏放射性核素a14C在生物學(xué)中的應(yīng)用J.延安大學(xué)學(xué) 報(bào) （自然科學(xué)版 ）,2. 王博，俞仲毅，陸敏 中藥歸經(jīng)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)研究 （一） 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào) 第20卷第 l 期2006年 3月:51 -533. 俞仲毅,王博,陸敏 中藥歸經(jīng)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)研究 （二） 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào) 第 20卷第 3期 2006年9月:32-364. 俞仲毅, 王博, 陸敏 中藥“四性 對(duì)器官組織機(jī)能影響的初步研究 上海中醫(yī)藥 雜志 2006 年第 40卷 第 4期:1-35. 朱壽彭，張瀾生 放射自顯影對(duì)體內(nèi)污染放射性物質(zhì)的代謝研究 原子能出版 北京 1988 年6. 崔云峰，白凈，葡萄糖代謝的動(dòng)力學(xué)研究， 國(guó)外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè)， 2004， 27（4）：1931977.8.9. 陳盛祖 核醫(yī)學(xué)的發(fā)展及其與相關(guān)學(xué)科的關(guān)系 物理學(xué)和高新技術(shù) 2000 ，29 （ 2）： 91-9510. 張建時(shí)，