內(nèi)科學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文[精品論文]RNA干擾沉默乙肝病毒X基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)性治療肝細(xì)胞癌的研究

1、內(nèi)科學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 rna干擾沉默乙肝病毒x基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)性治療肝細(xì)胞癌的研究關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌 hbx基因 rna干擾 基因治療 mhcc97-h細(xì)胞摘要：肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是癌癥的第三號(hào)殺手。盡管目前診療手段日新月異，但hcc進(jìn)展迅速，患者往往在確診后約6個(gè)月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法，而基因治療的興起，為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn)，80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白，并有充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系甚為密切，因此hb

2、x基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導(dǎo)下特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達(dá)治療hcc研究”進(jìn)行。 目的：rnai沉默hbx基因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌。 方法：以人肝癌細(xì)胞株mhcc97-h細(xì)胞gdna為模板，pcr克隆hbx基因片段，測序和blast分析；通過hbx全基因擴(kuò)增，初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點(diǎn)之間的關(guān)系；設(shè)立嚴(yán)格對照，用rt-pcr和細(xì)胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細(xì)胞內(nèi)hbx基因轉(zhuǎn)錄及hb

3、x蛋白表達(dá)。按shrna設(shè)計(jì)原則，依據(jù)從mhcc97-h中克隆hbx基因序列，設(shè)計(jì)并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關(guān)對照序列)，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆至pgenesil-i載體；行酶切、pcr和測序鑒定；將鑒定的shrna質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mhcc97-h細(xì)胞，觀察egfp表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入mhcc97-h細(xì)胞；g418篩選、挑單細(xì)胞克??；用半定量rt-pcr及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白水平的影響。對hbx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對成瘤組

4、織行病理分析。 結(jié)果：在mhcc97-h細(xì)胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段，blast分析證實(shí)整合的hbx基因?yàn)閍dr亞型(c基因型)；hbx全基因擴(kuò)增失敗，推測hbvdna整合位點(diǎn)可能位于hbx基因3末端，導(dǎo)致整合hbx基因3末端缺失；mhcc97-h細(xì)胞整合hbx基因轉(zhuǎn)錄mrna并表達(dá)hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實(shí)pshrna-x164/x215/mock載體構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后mhcc97-h細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshrna-x215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過30-35天篩選，pshrna-x215/x164/mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克??；半定量rt

5、-pcr分析：與mhcc97h比較，mock各單細(xì)胞克隆hbxmrna水平變化不明顯；與mock02克隆比較，x215有6個(gè)克隆有hbxmrna水平的下調(diào)約為70-93，x164各克隆下調(diào)25：與mock02克隆比較，21543克隆胞內(nèi)hbx蛋白水平下降；細(xì)胞周期檢測，21543比mock02克?。篻o/g1期：86.931.00vs65.972.43，s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率，mock02:21.62.9，21543：19.12.5(p>0.05)：裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02：766.6117.8mm3

6、，21543：255.366.1mm3(p<0.05)；原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm，21543：0.510.08cm(p<0.05)；he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結(jié)構(gòu)差別不明顯；免疫組織化學(xué)染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性，afp陽性。 結(jié)論：mhcc97-h細(xì)胞是選擇性表達(dá)hbx基因的人肝癌細(xì)胞株。構(gòu)建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細(xì)胞hbx基因特異性shrna表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細(xì)胞hbx基因表達(dá)能明顯延緩mhcc97-h

7、細(xì)胞生長，對hcc有一定的治療作用；表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細(xì)胞生長中起重要作用。正文內(nèi)容 肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是癌癥的第三號(hào)殺手。盡管目前診療手段日新月異，但hcc進(jìn)展迅速，患者往往在確診后約6個(gè)月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法，而基因治療的興起，為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn)，80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白，并有充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系甚為密切，因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介

8、導(dǎo)下特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達(dá)治療hcc研究”進(jìn)行。 目的：rnai沉默hbx基因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌。 方法：以人肝癌細(xì)胞株mhcc97-h細(xì)胞gdna為模板，pcr克隆hbx基因片段，測序和blast分析；通過hbx全基因擴(kuò)增，初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點(diǎn)之間的關(guān)系；設(shè)立嚴(yán)格對照，用rt-pcr和細(xì)胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細(xì)胞內(nèi)hbx基因轉(zhuǎn)錄及hbx蛋白表達(dá)。按shrna設(shè)計(jì)原則，依據(jù)從mhcc97-h中克隆hbx

9、基因序列，設(shè)計(jì)并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關(guān)對照序列)，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆至pgenesil-i載體；行酶切、pcr和測序鑒定；將鑒定的shrna質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mhcc97-h細(xì)胞，觀察egfp表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入mhcc97-h細(xì)胞；g418篩選、挑單細(xì)胞克??；用半定量rt-pcr及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白水平的影響。對hbx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對成瘤組織行病理分析。 結(jié)果：在mhcc97-h細(xì)胞中克隆、測序獲247bp

10、hbx基因片段，blast分析證實(shí)整合的hbx基因?yàn)閍dr亞型(c基因型)；hbx全基因擴(kuò)增失敗，推測hbvdna整合位點(diǎn)可能位于hbx基因3末端，導(dǎo)致整合hbx基因3末端缺失；mhcc97-h細(xì)胞整合hbx基因轉(zhuǎn)錄mrna并表達(dá)hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實(shí)pshrna-x164/x215/mock載體構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后mhcc97-h細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshrna-x215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過30-35天篩選，pshrna-x215/x164/mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克??；半定量rt-pcr分析：與mhcc97h比較，mock各單細(xì)胞克隆hbxmrn

11、a水平變化不明顯；與mock02克隆比較，x215有6個(gè)克隆有hbxmrna水平的下調(diào)約為70-93，x164各克隆下調(diào)25：與mock02克隆比較，21543克隆胞內(nèi)hbx蛋白水平下降；細(xì)胞周期檢測，21543比mock02克隆：go/g1期：86.931.00vs65.972.43，s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率，mock02:21.62.9，21543：19.12.5(p>0.05)：裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02：766.6117.8mm3，21543：255.366.1mm3(p<0.05)

12、；原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm，21543：0.510.08cm(p<0.05)；he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結(jié)構(gòu)差別不明顯；免疫組織化學(xué)染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性，afp陽性。 結(jié)論：mhcc97-h細(xì)胞是選擇性表達(dá)hbx基因的人肝癌細(xì)胞株。構(gòu)建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細(xì)胞hbx基因特異性shrna表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細(xì)胞hbx基因表達(dá)能明顯延緩mhcc97-h細(xì)胞生長，對hcc有一定的治療作用；表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細(xì)胞

13、生長中起重要作用。肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是癌癥的第三號(hào)殺手。盡管目前診療手段日新月異，但hcc進(jìn)展迅速，患者往往在確診后約6個(gè)月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法，而基因治療的興起，為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn)，80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白，并有充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系甚為密切，因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導(dǎo)下特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的

14、抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達(dá)治療hcc研究”進(jìn)行。 目的：rnai沉默hbx基因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌。 方法：以人肝癌細(xì)胞株mhcc97-h細(xì)胞gdna為模板，pcr克隆hbx基因片段，測序和blast分析；通過hbx全基因擴(kuò)增，初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點(diǎn)之間的關(guān)系；設(shè)立嚴(yán)格對照，用rt-pcr和細(xì)胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細(xì)胞內(nèi)hbx基因轉(zhuǎn)錄及hbx蛋白表達(dá)。按shrna設(shè)計(jì)原則，依據(jù)從mhcc97-h中克隆hbx基因序列，設(shè)計(jì)并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關(guān)對照序列)，經(jīng)退火成互

15、補(bǔ)雙鏈，克隆至pgenesil-i載體；行酶切、pcr和測序鑒定；將鑒定的shrna質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mhcc97-h細(xì)胞，觀察egfp表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入mhcc97-h細(xì)胞；g418篩選、挑單細(xì)胞克??；用半定量rt-pcr及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白水平的影響。對hbx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對成瘤組織行病理分析。 結(jié)果：在mhcc97-h細(xì)胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段，blast分析證實(shí)整合的hbx基因?yàn)閍dr亞型(c基因型)；h

16、bx全基因擴(kuò)增失敗，推測hbvdna整合位點(diǎn)可能位于hbx基因3末端，導(dǎo)致整合hbx基因3末端缺失；mhcc97-h細(xì)胞整合hbx基因轉(zhuǎn)錄mrna并表達(dá)hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實(shí)pshrna-x164/x215/mock載體構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后mhcc97-h細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshrna-x215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過30-35天篩選，pshrna-x215/x164/mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克??；半定量rt-pcr分析：與mhcc97h比較，mock各單細(xì)胞克隆hbxmrna水平變化不明顯；與mock02克隆比較，x215有6個(gè)克隆有hbxmrna水

17、平的下調(diào)約為70-93，x164各克隆下調(diào)25：與mock02克隆比較，21543克隆胞內(nèi)hbx蛋白水平下降；細(xì)胞周期檢測，21543比mock02克?。篻o/g1期：86.931.00vs65.972.43，s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率，mock02:21.62.9，21543：19.12.5(p>0.05)：裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02：766.6117.8mm3，21543：255.366.1mm3(p<0.05)；原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm，21543：0

18、.510.08cm(p<0.05)；he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結(jié)構(gòu)差別不明顯；免疫組織化學(xué)染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性，afp陽性。 結(jié)論：mhcc97-h細(xì)胞是選擇性表達(dá)hbx基因的人肝癌細(xì)胞株。構(gòu)建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細(xì)胞hbx基因特異性shrna表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細(xì)胞hbx基因表達(dá)能明顯延緩mhcc97-h細(xì)胞生長，對hcc有一定的治療作用；表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細(xì)胞生長中起重要作用。肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，h

19、cc)是癌癥的第三號(hào)殺手。盡管目前診療手段日新月異，但hcc進(jìn)展迅速，患者往往在確診后約6個(gè)月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法，而基因治療的興起，為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn)，80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白，并有充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系甚為密切，因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導(dǎo)下特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。

20、研究圍繞“沉默hbx基因表達(dá)治療hcc研究”進(jìn)行。 目的：rnai沉默hbx基因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌。 方法：以人肝癌細(xì)胞株mhcc97-h細(xì)胞gdna為模板，pcr克隆hbx基因片段，測序和blast分析；通過hbx全基因擴(kuò)增，初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點(diǎn)之間的關(guān)系；設(shè)立嚴(yán)格對照，用rt-pcr和細(xì)胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細(xì)胞內(nèi)hbx基因轉(zhuǎn)錄及hbx蛋白表達(dá)。按shrna設(shè)計(jì)原則，依據(jù)從mhcc97-h中克隆hbx基因序列，設(shè)計(jì)并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關(guān)對照序列)，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆至pgenesil-i載體；行酶切、pcr和測序鑒定；將鑒定的sh

21、rna質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mhcc97-h細(xì)胞，觀察egfp表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入mhcc97-h細(xì)胞；g418篩選、挑單細(xì)胞克??；用半定量rt-pcr及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白水平的影響。對hbx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對成瘤組織行病理分析。 結(jié)果：在mhcc97-h細(xì)胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段，blast分析證實(shí)整合的hbx基因?yàn)閍dr亞型(c基因型)；hbx全基因擴(kuò)增失敗，推測hbvdna整合位點(diǎn)可能位于hbx基因3末端，導(dǎo)致整合

22、hbx基因3末端缺失；mhcc97-h細(xì)胞整合hbx基因轉(zhuǎn)錄mrna并表達(dá)hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實(shí)pshrna-x164/x215/mock載體構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后mhcc97-h細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshrna-x215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過30-35天篩選，pshrna-x215/x164/mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克??；半定量rt-pcr分析：與mhcc97h比較，mock各單細(xì)胞克隆hbxmrna水平變化不明顯；與mock02克隆比較，x215有6個(gè)克隆有hbxmrna水平的下調(diào)約為70-93，x164各克隆下調(diào)25：與mock02克隆比較，215

23、43克隆胞內(nèi)hbx蛋白水平下降；細(xì)胞周期檢測，21543比mock02克?。篻o/g1期：86.931.00vs65.972.43，s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率，mock02:21.62.9，21543：19.12.5(p>0.05)：裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02：766.6117.8mm3，21543：255.366.1mm3(p<0.05)；原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm，21543：0.510.08cm(p<0.05)；he染色示21543和moc

24、k02克隆腫瘤組織病理結(jié)構(gòu)差別不明顯；免疫組織化學(xué)染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性，afp陽性。 結(jié)論：mhcc97-h細(xì)胞是選擇性表達(dá)hbx基因的人肝癌細(xì)胞株。構(gòu)建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細(xì)胞hbx基因特異性shrna表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細(xì)胞hbx基因表達(dá)能明顯延緩mhcc97-h細(xì)胞生長，對hcc有一定的治療作用；表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細(xì)胞生長中起重要作用。肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是癌癥的第三號(hào)殺手。盡管目前診療手段日新月異，但hcc進(jìn)展迅速，患者往往

25、在確診后約6個(gè)月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法，而基因治療的興起，為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn)，80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白，并有充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系甚為密切，因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導(dǎo)下特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達(dá)治療hcc研究”進(jìn)行。 目的：rnai沉默hbx基

26、因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌。 方法：以人肝癌細(xì)胞株mhcc97-h細(xì)胞gdna為模板，pcr克隆hbx基因片段，測序和blast分析；通過hbx全基因擴(kuò)增，初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點(diǎn)之間的關(guān)系；設(shè)立嚴(yán)格對照，用rt-pcr和細(xì)胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細(xì)胞內(nèi)hbx基因轉(zhuǎn)錄及hbx蛋白表達(dá)。按shrna設(shè)計(jì)原則，依據(jù)從mhcc97-h中克隆hbx基因序列，設(shè)計(jì)并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關(guān)對照序列)，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆至pgenesil-i載體；行酶切、pcr和測序鑒定；將鑒定的shrna質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mhcc97-h細(xì)胞，觀察egfp表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效

27、率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入mhcc97-h細(xì)胞；g418篩選、挑單細(xì)胞克??；用半定量rt-pcr及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白水平的影響。對hbx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對成瘤組織行病理分析。 結(jié)果：在mhcc97-h細(xì)胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段，blast分析證實(shí)整合的hbx基因?yàn)閍dr亞型(c基因型)；hbx全基因擴(kuò)增失敗，推測hbvdna整合位點(diǎn)可能位于hbx基因3末端，導(dǎo)致整合hbx基因3末端缺失；mhcc97-h細(xì)胞整合hbx基因轉(zhuǎn)錄mrna并表達(dá)hb

28、x蛋白。酶切、pcr及測序證實(shí)pshrna-x164/x215/mock載體構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后mhcc97-h細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshrna-x215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過30-35天篩選，pshrna-x215/x164/mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克??；半定量rt-pcr分析：與mhcc97h比較，mock各單細(xì)胞克隆hbxmrna水平變化不明顯；與mock02克隆比較，x215有6個(gè)克隆有hbxmrna水平的下調(diào)約為70-93，x164各克隆下調(diào)25：與mock02克隆比較，21543克隆胞內(nèi)hbx蛋白水平下降；細(xì)胞周期檢測，21543比mock02克?。篻

29、o/g1期：86.931.00vs65.972.43，s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率，mock02:21.62.9，21543：19.12.5(p>0.05)：裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02：766.6117.8mm3，21543：255.366.1mm3(p<0.05)；原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm，21543：0.510.08cm(p<0.05)；he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結(jié)構(gòu)差別不明顯；免疫組織化學(xué)染色21543和mock02

30、克隆hbsag、hbcag陰性，afp陽性。 結(jié)論：mhcc97-h細(xì)胞是選擇性表達(dá)hbx基因的人肝癌細(xì)胞株。構(gòu)建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細(xì)胞hbx基因特異性shrna表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細(xì)胞hbx基因表達(dá)能明顯延緩mhcc97-h細(xì)胞生長，對hcc有一定的治療作用；表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細(xì)胞生長中起重要作用。肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是癌癥的第三號(hào)殺手。盡管目前診療手段日新月異，但hcc進(jìn)展迅速，患者往往在確診后約6個(gè)月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法，而基因治療的興起，

31、為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn)，80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白，并有充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系甚為密切，因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導(dǎo)下特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達(dá)治療hcc研究”進(jìn)行。 目的：rnai沉默hbx基因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌。 方法：以人肝癌細(xì)胞株mhcc97-h細(xì)胞gdna為模板，

32、pcr克隆hbx基因片段，測序和blast分析；通過hbx全基因擴(kuò)增，初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點(diǎn)之間的關(guān)系；設(shè)立嚴(yán)格對照，用rt-pcr和細(xì)胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細(xì)胞內(nèi)hbx基因轉(zhuǎn)錄及hbx蛋白表達(dá)。按shrna設(shè)計(jì)原則，依據(jù)從mhcc97-h中克隆hbx基因序列，設(shè)計(jì)并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關(guān)對照序列)，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆至pgenesil-i載體；行酶切、pcr和測序鑒定；將鑒定的shrna質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mhcc97-h細(xì)胞，觀察egfp表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入mhcc97-h細(xì)胞；g418篩選、挑單細(xì)胞

33、克??；用半定量rt-pcr及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白水平的影響。對hbx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對成瘤組織行病理分析。 結(jié)果：在mhcc97-h細(xì)胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段，blast分析證實(shí)整合的hbx基因?yàn)閍dr亞型(c基因型)；hbx全基因擴(kuò)增失敗，推測hbvdna整合位點(diǎn)可能位于hbx基因3末端，導(dǎo)致整合hbx基因3末端缺失；mhcc97-h細(xì)胞整合hbx基因轉(zhuǎn)錄mrna并表達(dá)hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實(shí)pshrna-x164/x215/mock載體構(gòu)

34、建成功；轉(zhuǎn)染48h后mhcc97-h細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshrna-x215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過30-35天篩選，pshrna-x215/x164/mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克??；半定量rt-pcr分析：與mhcc97h比較，mock各單細(xì)胞克隆hbxmrna水平變化不明顯；與mock02克隆比較，x215有6個(gè)克隆有hbxmrna水平的下調(diào)約為70-93，x164各克隆下調(diào)25：與mock02克隆比較，21543克隆胞內(nèi)hbx蛋白水平下降；細(xì)胞周期檢測，21543比mock02克?。篻o/g1期：86.931.00vs65.972.43，s期:7.390.97v

35、s19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率，mock02:21.62.9，21543：19.12.5(p>0.05)：裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02：766.6117.8mm3，21543：255.366.1mm3(p<0.05)；原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm，21543：0.510.08cm(p<0.05)；he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結(jié)構(gòu)差別不明顯；免疫組織化學(xué)染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性，afp陽性。 結(jié)論：mhcc97-h細(xì)胞是選擇

36、性表達(dá)hbx基因的人肝癌細(xì)胞株。構(gòu)建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細(xì)胞hbx基因特異性shrna表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細(xì)胞hbx基因表達(dá)能明顯延緩mhcc97-h細(xì)胞生長，對hcc有一定的治療作用；表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細(xì)胞生長中起重要作用。肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是癌癥的第三號(hào)殺手。盡管目前診療手段日新月異，但hcc進(jìn)展迅速，患者往往在確診后約6個(gè)月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法，而基因治療的興起，為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾

37、90。研究發(fā)現(xiàn)，80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白，并有充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系甚為密切，因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導(dǎo)下特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達(dá)治療hcc研究”進(jìn)行。 目的：rnai沉默hbx基因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌。 方法：以人肝癌細(xì)胞株mhcc97-h細(xì)胞gdna為模板，pcr克隆hbx基因片段，測序和blast分析；通過hbx全基因擴(kuò)增，初步研究

38、hbx基因3末端與hbvdna整合位點(diǎn)之間的關(guān)系；設(shè)立嚴(yán)格對照，用rt-pcr和細(xì)胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細(xì)胞內(nèi)hbx基因轉(zhuǎn)錄及hbx蛋白表達(dá)。按shrna設(shè)計(jì)原則，依據(jù)從mhcc97-h中克隆hbx基因序列，設(shè)計(jì)并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關(guān)對照序列)，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆至pgenesil-i載體；行酶切、pcr和測序鑒定；將鑒定的shrna質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mhcc97-h細(xì)胞，觀察egfp表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入mhcc97-h細(xì)胞；g418篩選、挑單細(xì)胞克??；用半定量rt-pcr及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶向shrna對hbx

39、基因mrna及細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白水平的影響。對hbx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對成瘤組織行病理分析。 結(jié)果：在mhcc97-h細(xì)胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段，blast分析證實(shí)整合的hbx基因?yàn)閍dr亞型(c基因型)；hbx全基因擴(kuò)增失敗，推測hbvdna整合位點(diǎn)可能位于hbx基因3末端，導(dǎo)致整合hbx基因3末端缺失；mhcc97-h細(xì)胞整合hbx基因轉(zhuǎn)錄mrna并表達(dá)hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實(shí)pshrna-x164/x215/mock載體構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后mhcc97-h細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshrna-x215轉(zhuǎn)

40、染效率最低。經(jīng)過30-35天篩選，pshrna-x215/x164/mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克??；半定量rt-pcr分析：與mhcc97h比較，mock各單細(xì)胞克隆hbxmrna水平變化不明顯；與mock02克隆比較，x215有6個(gè)克隆有hbxmrna水平的下調(diào)約為70-93，x164各克隆下調(diào)25：與mock02克隆比較，21543克隆胞內(nèi)hbx蛋白水平下降；細(xì)胞周期檢測，21543比mock02克?。篻o/g1期：86.931.00vs65.972.43，s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率，mock0

41、2:21.62.9，21543：19.12.5(p>0.05)：裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02：766.6117.8mm3，21543：255.366.1mm3(p<0.05)；原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm，21543：0.510.08cm(p<0.05)；he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結(jié)構(gòu)差別不明顯；免疫組織化學(xué)染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性，afp陽性。 結(jié)論：mhcc97-h細(xì)胞是選擇性表達(dá)hbx基因的人肝癌細(xì)胞株。構(gòu)建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細(xì)胞hb

42、x基因特異性shrna表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細(xì)胞hbx基因表達(dá)能明顯延緩mhcc97-h細(xì)胞生長，對hcc有一定的治療作用；表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細(xì)胞生長中起重要作用。肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是癌癥的第三號(hào)殺手。盡管目前診療手段日新月異，但hcc進(jìn)展迅速，患者往往在確診后約6個(gè)月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法，而基因治療的興起，為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn)，80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白，并有充分的

43、實(shí)驗(yàn)依據(jù)說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系甚為密切，因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導(dǎo)下特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達(dá)治療hcc研究”進(jìn)行。 目的：rnai沉默hbx基因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌。 方法：以人肝癌細(xì)胞株mhcc97-h細(xì)胞gdna為模板，pcr克隆hbx基因片段，測序和blast分析；通過hbx全基因擴(kuò)增，初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點(diǎn)之間的關(guān)系；設(shè)立嚴(yán)格對照，用rt-pcr

44、和細(xì)胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細(xì)胞內(nèi)hbx基因轉(zhuǎn)錄及hbx蛋白表達(dá)。按shrna設(shè)計(jì)原則，依據(jù)從mhcc97-h中克隆hbx基因序列，設(shè)計(jì)并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關(guān)對照序列)，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆至pgenesil-i載體；行酶切、pcr和測序鑒定；將鑒定的shrna質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mhcc97-h細(xì)胞，觀察egfp表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入mhcc97-h細(xì)胞；g418篩選、挑單細(xì)胞克??；用半定量rt-pcr及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白水平的影響。對hbx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)

45、驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對成瘤組織行病理分析。 結(jié)果：在mhcc97-h細(xì)胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段，blast分析證實(shí)整合的hbx基因?yàn)閍dr亞型(c基因型)；hbx全基因擴(kuò)增失敗，推測hbvdna整合位點(diǎn)可能位于hbx基因3末端，導(dǎo)致整合hbx基因3末端缺失；mhcc97-h細(xì)胞整合hbx基因轉(zhuǎn)錄mrna并表達(dá)hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實(shí)pshrna-x164/x215/mock載體構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后mhcc97-h細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshrna-x215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過30-35天篩選，pshrna-x215/x164/mock質(zhì)

46、粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克??；半定量rt-pcr分析：與mhcc97h比較，mock各單細(xì)胞克隆hbxmrna水平變化不明顯；與mock02克隆比較，x215有6個(gè)克隆有hbxmrna水平的下調(diào)約為70-93，x164各克隆下調(diào)25：與mock02克隆比較，21543克隆胞內(nèi)hbx蛋白水平下降；細(xì)胞周期檢測，21543比mock02克?。篻o/g1期：86.931.00vs65.972.43，s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率，mock02:21.62.9，21543：19.12.5(p>0.05)：

47、裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02：766.6117.8mm3，21543：255.366.1mm3(p<0.05)；原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm，21543：0.510.08cm(p<0.05)；he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結(jié)構(gòu)差別不明顯；免疫組織化學(xué)染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性，afp陽性。 結(jié)論：mhcc97-h細(xì)胞是選擇性表達(dá)hbx基因的人肝癌細(xì)胞株。構(gòu)建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細(xì)胞hbx基因特異性shrna表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞mhcc97-h。rnai

48、沉默mhcc97-h細(xì)胞hbx基因表達(dá)能明顯延緩mhcc97-h細(xì)胞生長，對hcc有一定的治療作用；表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細(xì)胞生長中起重要作用。肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是癌癥的第三號(hào)殺手。盡管目前診療手段日新月異，但hcc進(jìn)展迅速，患者往往在確診后約6個(gè)月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法，而基因治療的興起，為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn)，80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白，并有充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系甚為密切，因此hbx基因可能為h

49、cc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導(dǎo)下特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達(dá)治療hcc研究”進(jìn)行。 目的：rnai沉默hbx基因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌。 方法：以人肝癌細(xì)胞株mhcc97-h細(xì)胞gdna為模板，pcr克隆hbx基因片段，測序和blast分析；通過hbx全基因擴(kuò)增，初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點(diǎn)之間的關(guān)系；設(shè)立嚴(yán)格對照，用rt-pcr和細(xì)胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細(xì)胞內(nèi)hbx基因轉(zhuǎn)錄及hbx蛋白表達(dá)。按

50、shrna設(shè)計(jì)原則，依據(jù)從mhcc97-h中克隆hbx基因序列，設(shè)計(jì)并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關(guān)對照序列)，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆至pgenesil-i載體；行酶切、pcr和測序鑒定；將鑒定的shrna質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mhcc97-h細(xì)胞，觀察egfp表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入mhcc97-h細(xì)胞；g418篩選、挑單細(xì)胞克??；用半定量rt-pcr及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白水平的影響。對hbx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對成瘤組織行病理分析。

51、 結(jié)果：在mhcc97-h細(xì)胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段，blast分析證實(shí)整合的hbx基因?yàn)閍dr亞型(c基因型)；hbx全基因擴(kuò)增失敗，推測hbvdna整合位點(diǎn)可能位于hbx基因3末端，導(dǎo)致整合hbx基因3末端缺失；mhcc97-h細(xì)胞整合hbx基因轉(zhuǎn)錄mrna并表達(dá)hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實(shí)pshrna-x164/x215/mock載體構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后mhcc97-h細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshrna-x215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過30-35天篩選，pshrna-x215/x164/mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克?。话攵縭t-pcr分析：

52、與mhcc97h比較，mock各單細(xì)胞克隆hbxmrna水平變化不明顯；與mock02克隆比較，x215有6個(gè)克隆有hbxmrna水平的下調(diào)約為70-93，x164各克隆下調(diào)25：與mock02克隆比較，21543克隆胞內(nèi)hbx蛋白水平下降；細(xì)胞周期檢測，21543比mock02克?。篻o/g1期：86.931.00vs65.972.43，s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率，mock02:21.62.9，21543：19.12.5(p>0.05)：裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02：766.6117.8mm3，21543：

53、255.366.1mm3(p<0.05)；原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm，21543：0.510.08cm(p<0.05)；he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結(jié)構(gòu)差別不明顯；免疫組織化學(xué)染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性，afp陽性。 結(jié)論：mhcc97-h細(xì)胞是選擇性表達(dá)hbx基因的人肝癌細(xì)胞株。構(gòu)建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細(xì)胞hbx基因特異性shrna表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細(xì)胞hbx基因表達(dá)能明顯延緩mhcc97-h細(xì)胞生長，對h

54、cc有一定的治療作用；表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細(xì)胞生長中起重要作用。肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是癌癥的第三號(hào)殺手。盡管目前診療手段日新月異，但hcc進(jìn)展迅速，患者往往在確診后約6個(gè)月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法，而基因治療的興起，為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn)，80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白，并有充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系甚為密切，因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導(dǎo)下特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默

55、。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達(dá)治療hcc研究”進(jìn)行。 目的：rnai沉默hbx基因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌。 方法：以人肝癌細(xì)胞株mhcc97-h細(xì)胞gdna為模板，pcr克隆hbx基因片段，測序和blast分析；通過hbx全基因擴(kuò)增，初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點(diǎn)之間的關(guān)系；設(shè)立嚴(yán)格對照，用rt-pcr和細(xì)胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細(xì)胞內(nèi)hbx基因轉(zhuǎn)錄及hbx蛋白表達(dá)。按shrna設(shè)計(jì)原則，依據(jù)從mhcc97-h中克隆hbx基因序列，設(shè)計(jì)并合成編碼

56、shrna三對寡核酸序列(含無關(guān)對照序列)，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆至pgenesil-i載體；行酶切、pcr和測序鑒定；將鑒定的shrna質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mhcc97-h細(xì)胞，觀察egfp表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入mhcc97-h細(xì)胞；g418篩選、挑單細(xì)胞克??；用半定量rt-pcr及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白水平的影響。對hbx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對成瘤組織行病理分析。 結(jié)果：在mhcc97-h細(xì)胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段，blas

57、t分析證實(shí)整合的hbx基因?yàn)閍dr亞型(c基因型)；hbx全基因擴(kuò)增失敗，推測hbvdna整合位點(diǎn)可能位于hbx基因3末端，導(dǎo)致整合hbx基因3末端缺失；mhcc97-h細(xì)胞整合hbx基因轉(zhuǎn)錄mrna并表達(dá)hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實(shí)pshrna-x164/x215/mock載體構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后mhcc97-h細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshrna-x215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過30-35天篩選，pshrna-x215/x164/mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克??；半定量rt-pcr分析：與mhcc97h比較，mock各單細(xì)胞克隆hbxmrna水平變化不明顯；與mo

58、ck02克隆比較，x215有6個(gè)克隆有hbxmrna水平的下調(diào)約為70-93，x164各克隆下調(diào)25：與mock02克隆比較，21543克隆胞內(nèi)hbx蛋白水平下降；細(xì)胞周期檢測，21543比mock02克?。篻o/g1期：86.931.00vs65.972.43，s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率，mock02:21.62.9，21543：19.12.5(p>0.05)：裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02：766.6117.8mm3，21543：255.366.1mm3(p<0.05)；原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm，21543：0.510.08cm(p<0.05)；he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結(jié)構(gòu)差別不明顯；免疫組織化學(xué)染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性，afp陽性。 結(jié)論：mhcc97-h細(xì)胞是選擇性表達(dá)hbx基因的人肝癌細(xì)胞株。構(gòu)建了