版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、內科學專業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 rna干擾沉默乙肝病毒x基因表達實驗性治療肝細胞癌的研究關鍵詞:肝細胞癌 hbx基因 rna干擾 基因治療 mhcc97-h細胞摘要:肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是癌癥的第三號殺手。盡管目前診療手段日新月異,但hcc進展迅速,患者往往在確診后約6個月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法,而基因治療的興起,為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn),80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白,并有充分的實驗依據說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關系甚為密切,因此hb
2、x基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導下特異性轉錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達治療hcc研究”進行。 目的:rnai沉默hbx基因表達治療肝細胞癌。 方法:以人肝癌細胞株mhcc97-h細胞gdna為模板,pcr克隆hbx基因片段,測序和blast分析;通過hbx全基因擴增,初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點之間的關系;設立嚴格對照,用rt-pcr和細胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細胞內hbx基因轉錄及hb
3、x蛋白表達。按shrna設計原則,依據從mhcc97-h中克隆hbx基因序列,設計并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關對照序列),經退火成互補雙鏈,克隆至pgenesil-i載體;行酶切、pcr和測序鑒定;將鑒定的shrna質粒脂質體轉染mhcc97-h細胞,觀察egfp表達,流式細胞分析轉染效率。電穿孔轉染將三種構建的質粒導入mhcc97-h細胞;g418篩選、挑單細胞克??;用半定量rt-pcr及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細胞內hbx蛋白水平的影響。對hbx表達下調的單細胞克隆,體外實驗分析細胞周期、細胞增殖;裸鼠體內單細胞克隆成瘤情況:并對成瘤組
4、織行病理分析。 結果:在mhcc97-h細胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段,blast分析證實整合的hbx基因為adr亞型(c基因型);hbx全基因擴增失敗,推測hbvdna整合位點可能位于hbx基因3末端,導致整合hbx基因3末端缺失;mhcc97-h細胞整合hbx基因轉錄mrna并表達hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實pshrna-x164/x215/mock載體構建成功;轉染48h后mhcc97-h細胞發(fā)出綠色熒光,pshrna-x215轉染效率最低。經過30-35天篩選,pshrna-x215/x164/mock質粒轉染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克??;半定量rt
5、-pcr分析:與mhcc97h比較,mock各單細胞克隆hbxmrna水平變化不明顯;與mock02克隆比較,x215有6個克隆有hbxmrna水平的下調約為70-93,x164各克隆下調25:與mock02克隆比較,21543克隆胞內hbx蛋白水平下降;細胞周期檢測,21543比mock02克?。篻o/g1期:86.931.00vs65.972.43,s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率,mock02:21.62.9,21543:19.12.5(p>0.05):裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02:766.6117.8mm3
6、,21543:255.366.1mm3(p<0.05);原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm,21543:0.510.08cm(p<0.05);he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結構差別不明顯;免疫組織化學染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性,afp陽性。 結論:mhcc97-h細胞是選擇性表達hbx基因的人肝癌細胞株。構建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細胞hbx基因特異性shrna表達質粒,并成功轉染人肝癌細胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細胞hbx基因表達能明顯延緩mhcc97-h
7、細胞生長,對hcc有一定的治療作用;表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細胞生長中起重要作用。正文內容 肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是癌癥的第三號殺手。盡管目前診療手段日新月異,但hcc進展迅速,患者往往在確診后約6個月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法,而基因治療的興起,為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn),80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白,并有充分的實驗依據說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關系甚為密切,因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介
8、導下特異性轉錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達治療hcc研究”進行。 目的:rnai沉默hbx基因表達治療肝細胞癌。 方法:以人肝癌細胞株mhcc97-h細胞gdna為模板,pcr克隆hbx基因片段,測序和blast分析;通過hbx全基因擴增,初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點之間的關系;設立嚴格對照,用rt-pcr和細胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細胞內hbx基因轉錄及hbx蛋白表達。按shrna設計原則,依據從mhcc97-h中克隆hbx
9、基因序列,設計并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關對照序列),經退火成互補雙鏈,克隆至pgenesil-i載體;行酶切、pcr和測序鑒定;將鑒定的shrna質粒脂質體轉染mhcc97-h細胞,觀察egfp表達,流式細胞分析轉染效率。電穿孔轉染將三種構建的質粒導入mhcc97-h細胞;g418篩選、挑單細胞克?。挥冒攵縭t-pcr及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細胞內hbx蛋白水平的影響。對hbx表達下調的單細胞克隆,體外實驗分析細胞周期、細胞增殖;裸鼠體內單細胞克隆成瘤情況:并對成瘤組織行病理分析。 結果:在mhcc97-h細胞中克隆、測序獲247bp
10、hbx基因片段,blast分析證實整合的hbx基因為adr亞型(c基因型);hbx全基因擴增失敗,推測hbvdna整合位點可能位于hbx基因3末端,導致整合hbx基因3末端缺失;mhcc97-h細胞整合hbx基因轉錄mrna并表達hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實pshrna-x164/x215/mock載體構建成功;轉染48h后mhcc97-h細胞發(fā)出綠色熒光,pshrna-x215轉染效率最低。經過30-35天篩選,pshrna-x215/x164/mock質粒轉染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克?。话攵縭t-pcr分析:與mhcc97h比較,mock各單細胞克隆hbxmrn
11、a水平變化不明顯;與mock02克隆比較,x215有6個克隆有hbxmrna水平的下調約為70-93,x164各克隆下調25:與mock02克隆比較,21543克隆胞內hbx蛋白水平下降;細胞周期檢測,21543比mock02克隆:go/g1期:86.931.00vs65.972.43,s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率,mock02:21.62.9,21543:19.12.5(p>0.05):裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02:766.6117.8mm3,21543:255.366.1mm3(p<0.05)
12、;原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm,21543:0.510.08cm(p<0.05);he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結構差別不明顯;免疫組織化學染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性,afp陽性。 結論:mhcc97-h細胞是選擇性表達hbx基因的人肝癌細胞株。構建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細胞hbx基因特異性shrna表達質粒,并成功轉染人肝癌細胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細胞hbx基因表達能明顯延緩mhcc97-h細胞生長,對hcc有一定的治療作用;表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細胞
13、生長中起重要作用。肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是癌癥的第三號殺手。盡管目前診療手段日新月異,但hcc進展迅速,患者往往在確診后約6個月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法,而基因治療的興起,為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn),80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白,并有充分的實驗依據說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關系甚為密切,因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導下特異性轉錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經濟、快捷、高效的
14、抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達治療hcc研究”進行。 目的:rnai沉默hbx基因表達治療肝細胞癌。 方法:以人肝癌細胞株mhcc97-h細胞gdna為模板,pcr克隆hbx基因片段,測序和blast分析;通過hbx全基因擴增,初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點之間的關系;設立嚴格對照,用rt-pcr和細胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細胞內hbx基因轉錄及hbx蛋白表達。按shrna設計原則,依據從mhcc97-h中克隆hbx基因序列,設計并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關對照序列),經退火成互
15、補雙鏈,克隆至pgenesil-i載體;行酶切、pcr和測序鑒定;將鑒定的shrna質粒脂質體轉染mhcc97-h細胞,觀察egfp表達,流式細胞分析轉染效率。電穿孔轉染將三種構建的質粒導入mhcc97-h細胞;g418篩選、挑單細胞克??;用半定量rt-pcr及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細胞內hbx蛋白水平的影響。對hbx表達下調的單細胞克隆,體外實驗分析細胞周期、細胞增殖;裸鼠體內單細胞克隆成瘤情況:并對成瘤組織行病理分析。 結果:在mhcc97-h細胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段,blast分析證實整合的hbx基因為adr亞型(c基因型);h
16、bx全基因擴增失敗,推測hbvdna整合位點可能位于hbx基因3末端,導致整合hbx基因3末端缺失;mhcc97-h細胞整合hbx基因轉錄mrna并表達hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實pshrna-x164/x215/mock載體構建成功;轉染48h后mhcc97-h細胞發(fā)出綠色熒光,pshrna-x215轉染效率最低。經過30-35天篩選,pshrna-x215/x164/mock質粒轉染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克??;半定量rt-pcr分析:與mhcc97h比較,mock各單細胞克隆hbxmrna水平變化不明顯;與mock02克隆比較,x215有6個克隆有hbxmrna水
17、平的下調約為70-93,x164各克隆下調25:與mock02克隆比較,21543克隆胞內hbx蛋白水平下降;細胞周期檢測,21543比mock02克?。篻o/g1期:86.931.00vs65.972.43,s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率,mock02:21.62.9,21543:19.12.5(p>0.05):裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02:766.6117.8mm3,21543:255.366.1mm3(p<0.05);原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm,21543:0
18、.510.08cm(p<0.05);he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結構差別不明顯;免疫組織化學染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性,afp陽性。 結論:mhcc97-h細胞是選擇性表達hbx基因的人肝癌細胞株。構建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細胞hbx基因特異性shrna表達質粒,并成功轉染人肝癌細胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細胞hbx基因表達能明顯延緩mhcc97-h細胞生長,對hcc有一定的治療作用;表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細胞生長中起重要作用。肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,h
19、cc)是癌癥的第三號殺手。盡管目前診療手段日新月異,但hcc進展迅速,患者往往在確診后約6個月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法,而基因治療的興起,為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn),80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白,并有充分的實驗依據說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關系甚為密切,因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導下特異性轉錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。
20、研究圍繞“沉默hbx基因表達治療hcc研究”進行。 目的:rnai沉默hbx基因表達治療肝細胞癌。 方法:以人肝癌細胞株mhcc97-h細胞gdna為模板,pcr克隆hbx基因片段,測序和blast分析;通過hbx全基因擴增,初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點之間的關系;設立嚴格對照,用rt-pcr和細胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細胞內hbx基因轉錄及hbx蛋白表達。按shrna設計原則,依據從mhcc97-h中克隆hbx基因序列,設計并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關對照序列),經退火成互補雙鏈,克隆至pgenesil-i載體;行酶切、pcr和測序鑒定;將鑒定的sh
21、rna質粒脂質體轉染mhcc97-h細胞,觀察egfp表達,流式細胞分析轉染效率。電穿孔轉染將三種構建的質粒導入mhcc97-h細胞;g418篩選、挑單細胞克?。挥冒攵縭t-pcr及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細胞內hbx蛋白水平的影響。對hbx表達下調的單細胞克隆,體外實驗分析細胞周期、細胞增殖;裸鼠體內單細胞克隆成瘤情況:并對成瘤組織行病理分析。 結果:在mhcc97-h細胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段,blast分析證實整合的hbx基因為adr亞型(c基因型);hbx全基因擴增失敗,推測hbvdna整合位點可能位于hbx基因3末端,導致整合
22、hbx基因3末端缺失;mhcc97-h細胞整合hbx基因轉錄mrna并表達hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實pshrna-x164/x215/mock載體構建成功;轉染48h后mhcc97-h細胞發(fā)出綠色熒光,pshrna-x215轉染效率最低。經過30-35天篩選,pshrna-x215/x164/mock質粒轉染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克隆;半定量rt-pcr分析:與mhcc97h比較,mock各單細胞克隆hbxmrna水平變化不明顯;與mock02克隆比較,x215有6個克隆有hbxmrna水平的下調約為70-93,x164各克隆下調25:與mock02克隆比較,215
23、43克隆胞內hbx蛋白水平下降;細胞周期檢測,21543比mock02克隆:go/g1期:86.931.00vs65.972.43,s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率,mock02:21.62.9,21543:19.12.5(p>0.05):裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02:766.6117.8mm3,21543:255.366.1mm3(p<0.05);原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm,21543:0.510.08cm(p<0.05);he染色示21543和moc
24、k02克隆腫瘤組織病理結構差別不明顯;免疫組織化學染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性,afp陽性。 結論:mhcc97-h細胞是選擇性表達hbx基因的人肝癌細胞株。構建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細胞hbx基因特異性shrna表達質粒,并成功轉染人肝癌細胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細胞hbx基因表達能明顯延緩mhcc97-h細胞生長,對hcc有一定的治療作用;表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細胞生長中起重要作用。肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是癌癥的第三號殺手。盡管目前診療手段日新月異,但hcc進展迅速,患者往往
25、在確診后約6個月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法,而基因治療的興起,為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn),80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白,并有充分的實驗依據說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關系甚為密切,因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導下特異性轉錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達治療hcc研究”進行。 目的:rnai沉默hbx基
26、因表達治療肝細胞癌。 方法:以人肝癌細胞株mhcc97-h細胞gdna為模板,pcr克隆hbx基因片段,測序和blast分析;通過hbx全基因擴增,初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點之間的關系;設立嚴格對照,用rt-pcr和細胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細胞內hbx基因轉錄及hbx蛋白表達。按shrna設計原則,依據從mhcc97-h中克隆hbx基因序列,設計并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關對照序列),經退火成互補雙鏈,克隆至pgenesil-i載體;行酶切、pcr和測序鑒定;將鑒定的shrna質粒脂質體轉染mhcc97-h細胞,觀察egfp表達,流式細胞分析轉染效
27、率。電穿孔轉染將三種構建的質粒導入mhcc97-h細胞;g418篩選、挑單細胞克??;用半定量rt-pcr及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細胞內hbx蛋白水平的影響。對hbx表達下調的單細胞克隆,體外實驗分析細胞周期、細胞增殖;裸鼠體內單細胞克隆成瘤情況:并對成瘤組織行病理分析。 結果:在mhcc97-h細胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段,blast分析證實整合的hbx基因為adr亞型(c基因型);hbx全基因擴增失敗,推測hbvdna整合位點可能位于hbx基因3末端,導致整合hbx基因3末端缺失;mhcc97-h細胞整合hbx基因轉錄mrna并表達hb
28、x蛋白。酶切、pcr及測序證實pshrna-x164/x215/mock載體構建成功;轉染48h后mhcc97-h細胞發(fā)出綠色熒光,pshrna-x215轉染效率最低。經過30-35天篩選,pshrna-x215/x164/mock質粒轉染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克隆;半定量rt-pcr分析:與mhcc97h比較,mock各單細胞克隆hbxmrna水平變化不明顯;與mock02克隆比較,x215有6個克隆有hbxmrna水平的下調約為70-93,x164各克隆下調25:與mock02克隆比較,21543克隆胞內hbx蛋白水平下降;細胞周期檢測,21543比mock02克?。篻
29、o/g1期:86.931.00vs65.972.43,s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率,mock02:21.62.9,21543:19.12.5(p>0.05):裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02:766.6117.8mm3,21543:255.366.1mm3(p<0.05);原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm,21543:0.510.08cm(p<0.05);he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結構差別不明顯;免疫組織化學染色21543和mock02
30、克隆hbsag、hbcag陰性,afp陽性。 結論:mhcc97-h細胞是選擇性表達hbx基因的人肝癌細胞株。構建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細胞hbx基因特異性shrna表達質粒,并成功轉染人肝癌細胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細胞hbx基因表達能明顯延緩mhcc97-h細胞生長,對hcc有一定的治療作用;表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細胞生長中起重要作用。肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是癌癥的第三號殺手。盡管目前診療手段日新月異,但hcc進展迅速,患者往往在確診后約6個月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法,而基因治療的興起,
31、為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn),80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白,并有充分的實驗依據說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關系甚為密切,因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導下特異性轉錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達治療hcc研究”進行。 目的:rnai沉默hbx基因表達治療肝細胞癌。 方法:以人肝癌細胞株mhcc97-h細胞gdna為模板,
32、pcr克隆hbx基因片段,測序和blast分析;通過hbx全基因擴增,初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點之間的關系;設立嚴格對照,用rt-pcr和細胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細胞內hbx基因轉錄及hbx蛋白表達。按shrna設計原則,依據從mhcc97-h中克隆hbx基因序列,設計并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關對照序列),經退火成互補雙鏈,克隆至pgenesil-i載體;行酶切、pcr和測序鑒定;將鑒定的shrna質粒脂質體轉染mhcc97-h細胞,觀察egfp表達,流式細胞分析轉染效率。電穿孔轉染將三種構建的質粒導入mhcc97-h細胞;g418篩選、挑單細胞
33、克?。挥冒攵縭t-pcr及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細胞內hbx蛋白水平的影響。對hbx表達下調的單細胞克隆,體外實驗分析細胞周期、細胞增殖;裸鼠體內單細胞克隆成瘤情況:并對成瘤組織行病理分析。 結果:在mhcc97-h細胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段,blast分析證實整合的hbx基因為adr亞型(c基因型);hbx全基因擴增失敗,推測hbvdna整合位點可能位于hbx基因3末端,導致整合hbx基因3末端缺失;mhcc97-h細胞整合hbx基因轉錄mrna并表達hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實pshrna-x164/x215/mock載體構
34、建成功;轉染48h后mhcc97-h細胞發(fā)出綠色熒光,pshrna-x215轉染效率最低。經過30-35天篩選,pshrna-x215/x164/mock質粒轉染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克?。话攵縭t-pcr分析:與mhcc97h比較,mock各單細胞克隆hbxmrna水平變化不明顯;與mock02克隆比較,x215有6個克隆有hbxmrna水平的下調約為70-93,x164各克隆下調25:與mock02克隆比較,21543克隆胞內hbx蛋白水平下降;細胞周期檢測,21543比mock02克隆:go/g1期:86.931.00vs65.972.43,s期:7.390.97v
35、s19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率,mock02:21.62.9,21543:19.12.5(p>0.05):裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02:766.6117.8mm3,21543:255.366.1mm3(p<0.05);原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm,21543:0.510.08cm(p<0.05);he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結構差別不明顯;免疫組織化學染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性,afp陽性。 結論:mhcc97-h細胞是選擇
36、性表達hbx基因的人肝癌細胞株。構建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細胞hbx基因特異性shrna表達質粒,并成功轉染人肝癌細胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細胞hbx基因表達能明顯延緩mhcc97-h細胞生長,對hcc有一定的治療作用;表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細胞生長中起重要作用。肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是癌癥的第三號殺手。盡管目前診療手段日新月異,但hcc進展迅速,患者往往在確診后約6個月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法,而基因治療的興起,為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾
37、90。研究發(fā)現(xiàn),80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白,并有充分的實驗依據說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關系甚為密切,因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導下特異性轉錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達治療hcc研究”進行。 目的:rnai沉默hbx基因表達治療肝細胞癌。 方法:以人肝癌細胞株mhcc97-h細胞gdna為模板,pcr克隆hbx基因片段,測序和blast分析;通過hbx全基因擴增,初步研究
38、hbx基因3末端與hbvdna整合位點之間的關系;設立嚴格對照,用rt-pcr和細胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細胞內hbx基因轉錄及hbx蛋白表達。按shrna設計原則,依據從mhcc97-h中克隆hbx基因序列,設計并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關對照序列),經退火成互補雙鏈,克隆至pgenesil-i載體;行酶切、pcr和測序鑒定;將鑒定的shrna質粒脂質體轉染mhcc97-h細胞,觀察egfp表達,流式細胞分析轉染效率。電穿孔轉染將三種構建的質粒導入mhcc97-h細胞;g418篩選、挑單細胞克?。挥冒攵縭t-pcr及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶向shrna對hbx
39、基因mrna及細胞內hbx蛋白水平的影響。對hbx表達下調的單細胞克隆,體外實驗分析細胞周期、細胞增殖;裸鼠體內單細胞克隆成瘤情況:并對成瘤組織行病理分析。 結果:在mhcc97-h細胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段,blast分析證實整合的hbx基因為adr亞型(c基因型);hbx全基因擴增失敗,推測hbvdna整合位點可能位于hbx基因3末端,導致整合hbx基因3末端缺失;mhcc97-h細胞整合hbx基因轉錄mrna并表達hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實pshrna-x164/x215/mock載體構建成功;轉染48h后mhcc97-h細胞發(fā)出綠色熒光,pshrna-x215轉
40、染效率最低。經過30-35天篩選,pshrna-x215/x164/mock質粒轉染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克??;半定量rt-pcr分析:與mhcc97h比較,mock各單細胞克隆hbxmrna水平變化不明顯;與mock02克隆比較,x215有6個克隆有hbxmrna水平的下調約為70-93,x164各克隆下調25:與mock02克隆比較,21543克隆胞內hbx蛋白水平下降;細胞周期檢測,21543比mock02克隆:go/g1期:86.931.00vs65.972.43,s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率,mock0
41、2:21.62.9,21543:19.12.5(p>0.05):裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02:766.6117.8mm3,21543:255.366.1mm3(p<0.05);原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm,21543:0.510.08cm(p<0.05);he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結構差別不明顯;免疫組織化學染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性,afp陽性。 結論:mhcc97-h細胞是選擇性表達hbx基因的人肝癌細胞株。構建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細胞hb
42、x基因特異性shrna表達質粒,并成功轉染人肝癌細胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細胞hbx基因表達能明顯延緩mhcc97-h細胞生長,對hcc有一定的治療作用;表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細胞生長中起重要作用。肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是癌癥的第三號殺手。盡管目前診療手段日新月異,但hcc進展迅速,患者往往在確診后約6個月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法,而基因治療的興起,為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn),80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白,并有充分的
43、實驗依據說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關系甚為密切,因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導下特異性轉錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達治療hcc研究”進行。 目的:rnai沉默hbx基因表達治療肝細胞癌。 方法:以人肝癌細胞株mhcc97-h細胞gdna為模板,pcr克隆hbx基因片段,測序和blast分析;通過hbx全基因擴增,初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點之間的關系;設立嚴格對照,用rt-pcr
44、和細胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細胞內hbx基因轉錄及hbx蛋白表達。按shrna設計原則,依據從mhcc97-h中克隆hbx基因序列,設計并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關對照序列),經退火成互補雙鏈,克隆至pgenesil-i載體;行酶切、pcr和測序鑒定;將鑒定的shrna質粒脂質體轉染mhcc97-h細胞,觀察egfp表達,流式細胞分析轉染效率。電穿孔轉染將三種構建的質粒導入mhcc97-h細胞;g418篩選、挑單細胞克??;用半定量rt-pcr及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細胞內hbx蛋白水平的影響。對hbx表達下調的單細胞克隆,體外實
45、驗分析細胞周期、細胞增殖;裸鼠體內單細胞克隆成瘤情況:并對成瘤組織行病理分析。 結果:在mhcc97-h細胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段,blast分析證實整合的hbx基因為adr亞型(c基因型);hbx全基因擴增失敗,推測hbvdna整合位點可能位于hbx基因3末端,導致整合hbx基因3末端缺失;mhcc97-h細胞整合hbx基因轉錄mrna并表達hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實pshrna-x164/x215/mock載體構建成功;轉染48h后mhcc97-h細胞發(fā)出綠色熒光,pshrna-x215轉染效率最低。經過30-35天篩選,pshrna-x215/x164/mock質
46、粒轉染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克隆;半定量rt-pcr分析:與mhcc97h比較,mock各單細胞克隆hbxmrna水平變化不明顯;與mock02克隆比較,x215有6個克隆有hbxmrna水平的下調約為70-93,x164各克隆下調25:與mock02克隆比較,21543克隆胞內hbx蛋白水平下降;細胞周期檢測,21543比mock02克?。篻o/g1期:86.931.00vs65.972.43,s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率,mock02:21.62.9,21543:19.12.5(p>0.05):
47、裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02:766.6117.8mm3,21543:255.366.1mm3(p<0.05);原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm,21543:0.510.08cm(p<0.05);he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結構差別不明顯;免疫組織化學染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性,afp陽性。 結論:mhcc97-h細胞是選擇性表達hbx基因的人肝癌細胞株。構建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細胞hbx基因特異性shrna表達質粒,并成功轉染人肝癌細胞mhcc97-h。rnai
48、沉默mhcc97-h細胞hbx基因表達能明顯延緩mhcc97-h細胞生長,對hcc有一定的治療作用;表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細胞生長中起重要作用。肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是癌癥的第三號殺手。盡管目前診療手段日新月異,但hcc進展迅速,患者往往在確診后約6個月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法,而基因治療的興起,為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn),80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白,并有充分的實驗依據說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關系甚為密切,因此hbx基因可能為h
49、cc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導下特異性轉錄后基因沉默。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達治療hcc研究”進行。 目的:rnai沉默hbx基因表達治療肝細胞癌。 方法:以人肝癌細胞株mhcc97-h細胞gdna為模板,pcr克隆hbx基因片段,測序和blast分析;通過hbx全基因擴增,初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點之間的關系;設立嚴格對照,用rt-pcr和細胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細胞內hbx基因轉錄及hbx蛋白表達。按
50、shrna設計原則,依據從mhcc97-h中克隆hbx基因序列,設計并合成編碼shrna三對寡核酸序列(含無關對照序列),經退火成互補雙鏈,克隆至pgenesil-i載體;行酶切、pcr和測序鑒定;將鑒定的shrna質粒脂質體轉染mhcc97-h細胞,觀察egfp表達,流式細胞分析轉染效率。電穿孔轉染將三種構建的質粒導入mhcc97-h細胞;g418篩選、挑單細胞克隆;用半定量rt-pcr及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細胞內hbx蛋白水平的影響。對hbx表達下調的單細胞克隆,體外實驗分析細胞周期、細胞增殖;裸鼠體內單細胞克隆成瘤情況:并對成瘤組織行病理分析。
51、 結果:在mhcc97-h細胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段,blast分析證實整合的hbx基因為adr亞型(c基因型);hbx全基因擴增失敗,推測hbvdna整合位點可能位于hbx基因3末端,導致整合hbx基因3末端缺失;mhcc97-h細胞整合hbx基因轉錄mrna并表達hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實pshrna-x164/x215/mock載體構建成功;轉染48h后mhcc97-h細胞發(fā)出綠色熒光,pshrna-x215轉染效率最低。經過30-35天篩選,pshrna-x215/x164/mock質粒轉染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克隆;半定量rt-pcr分析:
52、與mhcc97h比較,mock各單細胞克隆hbxmrna水平變化不明顯;與mock02克隆比較,x215有6個克隆有hbxmrna水平的下調約為70-93,x164各克隆下調25:與mock02克隆比較,21543克隆胞內hbx蛋白水平下降;細胞周期檢測,21543比mock02克?。篻o/g1期:86.931.00vs65.972.43,s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率,mock02:21.62.9,21543:19.12.5(p>0.05):裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02:766.6117.8mm3,21543:
53、255.366.1mm3(p<0.05);原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm,21543:0.510.08cm(p<0.05);he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結構差別不明顯;免疫組織化學染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性,afp陽性。 結論:mhcc97-h細胞是選擇性表達hbx基因的人肝癌細胞株。構建了靶向整合于人肝癌mhcc97-h細胞hbx基因特異性shrna表達質粒,并成功轉染人肝癌細胞mhcc97-h。rnai沉默mhcc97-h細胞hbx基因表達能明顯延緩mhcc97-h細胞生長,對h
54、cc有一定的治療作用;表明hbx基因在維持肝癌腫瘤細胞生長中起重要作用。肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是癌癥的第三號殺手。盡管目前診療手段日新月異,但hcc進展迅速,患者往往在確診后約6個月死亡。因此我們需要尋找一種更有效的治療方法,而基因治療的興起,為從根本上徹底治療該病帶來了希望。 我國hcc患者血清乙肝病毒表面抗原陽性率逾90。研究發(fā)現(xiàn),80以上hcc患者的肝組織中含有特異性的hbx蛋白,并有充分的實驗依據說明hbx蛋白與hcc的發(fā)生與發(fā)展關系甚為密切,因此hbx基因可能為hcc基因治療的理想靶基因。 rna干擾是在雙鏈rna介導下特異性轉錄后基因沉默
55、。大量研究表明rnai現(xiàn)象不僅是一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定、基因治療等方面提供新的方法。研究圍繞“沉默hbx基因表達治療hcc研究”進行。 目的:rnai沉默hbx基因表達治療肝細胞癌。 方法:以人肝癌細胞株mhcc97-h細胞gdna為模板,pcr克隆hbx基因片段,測序和blast分析;通過hbx全基因擴增,初步研究hbx基因3末端與hbvdna整合位點之間的關系;設立嚴格對照,用rt-pcr和細胞免疫熒光染色分析mhcc97-h細胞內hbx基因轉錄及hbx蛋白表達。按shrna設計原則,依據從mhcc97-h中克隆hbx基因序列,設計并合成編碼
56、shrna三對寡核酸序列(含無關對照序列),經退火成互補雙鏈,克隆至pgenesil-i載體;行酶切、pcr和測序鑒定;將鑒定的shrna質粒脂質體轉染mhcc97-h細胞,觀察egfp表達,流式細胞分析轉染效率。電穿孔轉染將三種構建的質粒導入mhcc97-h細胞;g418篩選、挑單細胞克??;用半定量rt-pcr及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶向shrna對hbx基因mrna及細胞內hbx蛋白水平的影響。對hbx表達下調的單細胞克隆,體外實驗分析細胞周期、細胞增殖;裸鼠體內單細胞克隆成瘤情況:并對成瘤組織行病理分析。 結果:在mhcc97-h細胞中克隆、測序獲247bphbx基因片段,blas
57、t分析證實整合的hbx基因為adr亞型(c基因型);hbx全基因擴增失敗,推測hbvdna整合位點可能位于hbx基因3末端,導致整合hbx基因3末端缺失;mhcc97-h細胞整合hbx基因轉錄mrna并表達hbx蛋白。酶切、pcr及測序證實pshrna-x164/x215/mock載體構建成功;轉染48h后mhcc97-h細胞發(fā)出綠色熒光,pshrna-x215轉染效率最低。經過30-35天篩選,pshrna-x215/x164/mock質粒轉染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克?。话攵縭t-pcr分析:與mhcc97h比較,mock各單細胞克隆hbxmrna水平變化不明顯;與mo
58、ck02克隆比較,x215有6個克隆有hbxmrna水平的下調約為70-93,x164各克隆下調25:與mock02克隆比較,21543克隆胞內hbx蛋白水平下降;細胞周期檢測,21543比mock02克?。篻o/g1期:86.931.00vs65.972.43,s期:7.390.97vs19.532.23(p<0.05);平板克隆形成率,mock02:21.62.9,21543:19.12.5(p>0.05):裸鼠異位移植腫瘤生長體積mock02:766.6117.8mm3,21543:255.366.1mm3(p<0.05);原位移植腫瘤的幾何平均直徑mock02:1.070.13cm,21543:0.510.08cm(p<0.05);he染色示21543和mock02克隆腫瘤組織病理結構差別不明顯;免疫組織化學染色21543和mock02克隆hbsag、hbcag陰性,afp陽性。 結論:mhcc97-h細胞是選擇性表達hbx基因的人肝癌細胞株。構建了
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 多元文化舞蹈行業(yè)發(fā)展前景及投資風險預測分析報告
- 多元文化旅游行業(yè)競爭分析及發(fā)展前景預測報告
- 工業(yè)互聯(lián)網行業(yè)的消費心理分析
- 新能源大巴車行業(yè)相關項目現(xiàn)狀分析及對策
- 多元文化傳媒行業(yè)五年發(fā)展預測分析報告
- 環(huán)保科技研發(fā)行業(yè)市場調研分析報告
- 經濟型酒店行業(yè)發(fā)展全景調研與投資趨勢預測研究報告
- 水環(huán)境監(jiān)測與水質改善行業(yè)發(fā)展前景及投資風險預測分析報告
- 多元文化社交網絡行業(yè)營銷策略方案
- 電視劇發(fā)行行業(yè)競爭分析及發(fā)展前景預測報告
- 2024二十屆三中全會知識競賽題庫及答案
- 2024公安校園欺凌課件
- 2024年職業(yè)健康綜合知識競賽題庫附答案
- (完整word版)企業(yè)對賬函模板
- 送貨單EXCEL模板
- 《南水北調工程》PPT課件.ppt
- 超星系統(tǒng)鄭州航空工業(yè)管理學院-大學英語所有答案
- 電纜敷設監(jiān)理控制要點及措施
- 海灣GST5000控制器說明書 (DEMO)
- 企業(yè)內部審計工作手冊(共38頁).doc
- 企業(yè)會計準則應用指南——會計科目和主要賬務處理(完整版)
評論
0/150
提交評論