抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體的檢測及臨床意義

1、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體 (ANCA) 檢測及臨床意義間接熒光免疫 (IIF) 方法(歐盟)、ANCA既念及分類抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體是一種以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿成份為靶抗原的自身抗體，對系統(tǒng)性血管炎炎癥性腸病等多種疾病的診斷和鑒別診斷具有重要 的意義,已成為自身免疫性疾病的一項(xiàng)非常重要的常規(guī)檢測項(xiàng)目。目前，已經(jīng)有十余種中性粒細(xì)胞胞漿成分被證實(shí)為ANCA的靶抗原，蛋白酶3(PR3)，髓過氧化物酶(MPO),人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HEL)，乳鐵蛋白(LF)，組織蛋白酶G(Cath G),殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(BPI)，人溶酶體相關(guān)膜蛋白2 (H-LAMP2),溶菌素(LYS),天青殺素，防御素，烯醇

2、化酶，葡萄糖醛酸酶。根據(jù)乙醇固定的中性粒細(xì)胞基質(zhì)片中，可以區(qū)分兩種不同的熒光模型：一種胞漿型(c-ANCA，是均勻分布在整個(gè)中性粒細(xì)胞胞漿中的顆粒型熒光, 細(xì)胞核無熒光。在乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞片中，其熒光模型表現(xiàn)相同。其 主要的靶抗原是蛋白酶 3(PR3)。另一種是核周型(p-ANCA，是圍繞中性粒細(xì)胞細(xì)胞核周圍的平滑帶狀熒光。由多種抗原引起，主要靶抗原是髓過氧化物酶 (MPO,人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HEL)，乳鐵蛋白(LF)，組織蛋白酶G(Cath G)，殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(BPI)，人溶酶體相關(guān)膜蛋白2 (H-LAMP2)，溶菌素(LYS)等。不同抗體在乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞片中

3、，其熒光模型表現(xiàn)有所不同?？?MPO抗體產(chǎn)生的P-ANCA因耐甲醛，其熒光模型與在乙醇固定的中性粒細(xì)胞中出現(xiàn)的 c-ANCA類似故叫甲醛抗性的P -ANCA而其他非MPC抗體不與甲醛固定的中性粒細(xì)胞反應(yīng)，無熒光表現(xiàn)，這種類型又稱為 甲醛敏感的p-ANCA故根據(jù)乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞片表現(xiàn)， 可初步判定ANCA 的靶抗原PR3 MPO 非 MPC三類。二、ANCA勺檢測間接熒光免疫方法是檢測 ANCA勺參考方法或者標(biāo)準(zhǔn)方法，至今也是最常用的經(jīng)典方法。IIF是區(qū)分C-ANCA和P-ANCA的基礎(chǔ)，有較高敏感性，可半定量，但I(xiàn)IF測定的是總ANCA不能準(zhǔn)確區(qū)分靶抗原，需特異性的檢測方法作為補(bǔ)充。

4、由于多種免疫性疾病患者存在 ANA用IIF法檢測ANCA寸，會產(chǎn)生干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。為避免干擾現(xiàn)象，采用了四基質(zhì)聯(lián)合的檢測即：乙醇固定的粒細(xì)胞；甲 醛固定的粒細(xì)胞；Hep-2 （人喉癌細(xì)胞）細(xì)胞；猴肝細(xì)胞?；|(zhì)片各細(xì)胞分布及意 義如表一所述。ANCA熒光模型及表現(xiàn)如表二所述。表一：四聯(lián)基質(zhì)片分布及意義區(qū)分ANA的干擾：HeP-2細(xì)胞有典型熒光表現(xiàn)，Hep-2細(xì)胞甲醛固定 粒細(xì)胞1判斷C-ANCA,2:區(qū)分 P-ANCA對甲 醛敏感還是耐受甲醛抗性P-ANCA抗MPO抗體耐 甲醛，其熒光與在乙醇固定的中 性粒細(xì)胞中的C-ANCA類似甲醛敏感P-ANCA其他非MPO抗體不與甲醛固定的中性粒細(xì)胞反

5、 應(yīng)，無熒光表現(xiàn)區(qū)分ANA與ANCA借助猴肝細(xì)胞 和其中的肝血竇粒細(xì)胞。ANCA陽性，只有肝血竇粒細(xì)胞出 現(xiàn)熒光，。如果兩者冋時(shí)陽性，所 有肝細(xì)胞核都有熒光。猴肝 細(xì)胞乙醇固定 粒細(xì)胞是標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)基質(zhì)。區(qū)分兩種熒光模型：C-ANCA P-ANCA表二：ANCA光模型及表現(xiàn)熒光模型熒 光 表 現(xiàn)乙醇固定粒細(xì)胞甲醛固定粒細(xì)胞Hep-2細(xì)胞猴肝細(xì)胞ANA陰 性c-ANCA陽性胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的細(xì)顆 粒熒光，胞質(zhì)熒光清 晰勾勒出核的輪廓， 分頁核之間熒光增 強(qiáng)。胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的細(xì)顆 粒熒光，胞質(zhì)熒光清 晰勾勒出核的輪廓， 分頁核之間熒光增 強(qiáng)。陰性肝細(xì)胞本身無熒光。僅肝血竇粒細(xì)胞出現(xiàn) 熒光。p-ANCA陽性甲

6、醛 耐受P-ANCA呈現(xiàn)核周胞質(zhì)平滑絲 狀帶熒光。熒光陽性 的胞質(zhì)主要集中在分 頁核周圍，形成環(huán)狀 或不規(guī)則的塊狀。胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的細(xì)顆 粒熒光，胞質(zhì)熒光清 晰勾勒出核的輪廓， 分頁核之間熒光增 強(qiáng)。陰性肝臟細(xì)胞本身無熒光。僅肝血竇粒細(xì)胞出現(xiàn)yH-；、/ 熒光。甲醛 敏感P-ANCA呈現(xiàn)核周胞質(zhì)平滑絲 狀帶熒光。熒光陽性 的胞質(zhì)主要集中在分 頁核周圍，形成環(huán)狀 或不規(guī)則的塊狀。陰性陰性肝臟細(xì)胞本身無熒光。僅肝血竇粒細(xì)胞出現(xiàn) 熒光。ANAANCA陰性細(xì)胞核陽性，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)陰性細(xì)胞核呈現(xiàn) 熒光表現(xiàn)，如ANA所述肝細(xì)胞核陽性。 肝血竇粒細(xì)胞未見熒 光。甲醛耐受P-ANCA陽性細(xì)胞核陽性，熒光強(qiáng) 度增

7、強(qiáng)熒光表現(xiàn)如C-ANCA陽 性，乙醇，甲醛固定粒細(xì)胞所述細(xì)胞核呈現(xiàn) 熒光表現(xiàn)，如ANA所述。肝細(xì)胞和肝血竇粒細(xì)胞都有熒光。甲醛敏感P-ANCA陽性細(xì)胞核陽性，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)陰性細(xì)胞核呈現(xiàn) 熒光表現(xiàn)，如ANA所述。肝細(xì)胞和肝血竇粒細(xì) 胞都有熒光。陽 性二、注意事項(xiàng)為提高對疾病診斷的特異性，檢測時(shí)應(yīng)注意以下問題1、檢測ANCA般建議同時(shí)做IIF初篩和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，以提高 ANCA勺臨床應(yīng)用價(jià)值，不做單獨(dú)初篩或單獨(dú)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，以免降低對疾病診斷的特異性。2、不能僅檢測抗PR3和MPO兩種特異性抗體，而不檢測，這樣容易限制 ANCA寸疾病診斷的特異性。3、用IIF檢測時(shí)，僅使用乙醇固定的粒細(xì)胞片，這樣不能嚴(yán)格

8、排除ANA的干擾,容易出現(xiàn)假陽性。四、臨床意義（一） ANCA與原發(fā)性小血管炎韋格納肉芽腫（WG）,顯微多動(dòng)脈炎（MPA）,壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN） 和變應(yīng)性肉芽腫性血管炎（CSS）等等原發(fā)性系統(tǒng)性小血管炎的發(fā)病與 ANCA密切相關(guān)，臨床上已將上述疾病統(tǒng)稱為 ANCA相關(guān)小血管炎。ANCA特異性PR3抗體和抗MPO抗體的檢測已成為原發(fā)性小血管炎的敏感特異的血清學(xué)檢測項(xiàng)目。1、抗PR3抗體特異性PR3抗體為WG勺標(biāo)志性抗體，抗PR3抗體熒光模型以C-ANCA為主。但以C-ANCA診斷WGt異性為90%,而以抗PR3抗體的特異性可超過95%?？筆R3 抗體在其他的原發(fā)性血管炎中業(yè)可以檢

9、測出來，但陽性率較低?？筆R3抗體敏感度與疾病的活動(dòng)性及病程有關(guān)，在疾病的早期癥狀不明顯時(shí), 就可出現(xiàn)陽性。因而抗PR3抗體常作為WG勺早期診斷、療效判斷、復(fù)發(fā)估計(jì)的指標(biāo)，對臨床治療有重要的參考價(jià)值。2、抗MP航體抗MPC抗體熒光模型以P-ANCA為主，主要與 MPA NCGN CSS相關(guān)。還可見于其他疾病，如節(jié)結(jié)性多動(dòng)脈炎，抗腎小球基底膜腎病，WG SLE RA藥物誘導(dǎo)的狼瘡，F(xiàn)elty綜合癥等?？贵w滴度與疾病活動(dòng)性相關(guān)，可用于早期診斷、療效判斷、復(fù)發(fā)估計(jì)的指標(biāo)，對臨床治療有重要的參考價(jià)值?？筂P翫體陽性高度提示壞死性血管炎或特發(fā)性 NCGN對診斷原發(fā)性小血管炎的特異性達(dá)到99%。因而每一個(gè)

10、不明原因的血管炎或腎小球腎炎的患者，都應(yīng)該檢測ANCA表三：ANCAf原發(fā)性小血管炎相關(guān)疾病熒光模型靶抗原（）韋格納肉芽腫（WG）C , P （少見）PR3( 85), MPQ 10)顯微多動(dòng)脈炎（MPA）C , PPR3(45), MPQ45)壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN）C , P （少見）PR3(25), MPQ 65)變應(yīng)性肉芽腫性血管炎（CSS）C , P （少見）PR3( 10), MPQ60)結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎（PAN少見PR3( 5), MPQ 15)抗腎小球基底膜?。?GBNPMPO（二） ANCAf藥物誘導(dǎo)性血管炎近年來不斷有藥物治療引起的 ANCA陽性的病例報(bào)道，如丙

11、基硫氧嘧啶，肼苯噠嗪，普魯卡因酰胺，青酶胺，美滿霉素，他巴唑 /甲巰咪唑等。其中報(bào)道比較多的是長期使用丙基硫氧嘧啶引起的 ANCA其特點(diǎn)是滴度高，抗體譜廣（抗原主要是MPO也可同時(shí)伴有或單獨(dú)出現(xiàn)其他靶抗原，如PR3 LF, Cath G, BPI, LYS等）。藥物誘導(dǎo)性血管炎患者臨床表現(xiàn)與原發(fā)性血管炎類似，停止丙基硫氧嘧啶用藥后，臨床癥狀好轉(zhuǎn)，ANCA可轉(zhuǎn)陰。因此，長期使用丙基硫氧嘧啶治療過程中,應(yīng)定期檢測ANCA及早發(fā)現(xiàn)藥物誘導(dǎo)性血管炎。（三）ANCAf其他疾病除原發(fā)性血管炎外，其他一些疾病中也可出現(xiàn)ANCA主要為P-ANCA其靶抗原并非 PR MPO 而是 LF, Cath G, BPI

12、, LYS等1 、慢性炎癥性腸病 （CIBD）CIBD是一種消化系統(tǒng)的自身免疫性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ UQ ,克羅恩?。–D兩種。以往的CIBD診斷依賴X線檢查，內(nèi)窺鏡及組織學(xué)診斷，缺乏有效的試驗(yàn)室指標(biāo)。近年來研究發(fā)現(xiàn) UC病人血清中ANCA性率為60-80 %，而CD患者的陽性率為10-20 %，多為P-ANCA相關(guān)靶抗原有BPI等。滴度與疾病的活動(dòng)度和病程無關(guān)。因?yàn)镻-ANCA在 U邙日性率高，CD陽性率低，故可作為兩者的鑒別診斷及UC早期診斷指標(biāo)。2、結(jié)締組織病在結(jié)締組織病中，ANCA陽性主要見于SLE和RA其他結(jié)締組織病中少見。但文獻(xiàn)報(bào)道在SLE和 RA陽性率差異特別大（16-69 %）,這可能與使用方法，抗原基質(zhì)片及工作人員水平有很大關(guān)系。SLE中A