甘露聚糖對纖維素酶水解的抑制及其緩解方法研究

1、甘露聚糖對纖維素酶水解的抑制及其緩解方法研究目前纖維素酶的成本過高是限制燃料乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的主要因 素之一,因而如何提高纖維素酶水解效率 , 降低纖維素酶用量是當(dāng)前 燃料乙醇生產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點。在木質(zhì)纖維原料中 , 半纖維素會覆蓋 在纖維素表面形成物理屏障 , 降低纖維素酶對纖維素的可及性。為克 服該屏障作用 , 原料中的半纖維素需要轉(zhuǎn)化為游離態(tài)或者是被水解為 可溶性的糖。研究表明游離態(tài)的木聚糖 （ 闊葉材和禾本科中半纖維素 的主要成分 ）及其水解產(chǎn)物對纖維素水解有強烈的抑制作用 , 但是游 離態(tài)的甘露聚糖 （ 針葉材中半纖維素的主要成分 ） 及其水解產(chǎn)物對纖 維素水解效率的影響還尚不清楚。

2、因而本文圍繞游離態(tài)的甘露聚糖及 其水解產(chǎn)物對纖維素酶水解纖維素的影響開展系統(tǒng)研究 , 探究了甘露 聚糖及其水解產(chǎn)物抑制纖維素水解的機制 , 并在深入了解其抑制機制 的基礎(chǔ)上探究了緩解甘露聚糖及其水解產(chǎn)物抑制纖維素水解的有效 措施, 以期為開發(fā)水解得率高、酶制劑使用量少的高效酶水解技術(shù)提 供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下 : 首先考察了不同種類的甘露 聚糖（直鏈甘露聚糖、低分子量半乳甘露聚糖以及高分子量半乳甘露 聚糖）對纖維素水解效率的影響 , 并探究了甘露聚糖結(jié)構(gòu)特性包括分 子量和半乳糖取代基等對甘露聚糖抑制纖維素水解的影響。 研究結(jié)果 顯示, 這三種甘露聚糖均會抑制纖維素水解 , 在纖維素

3、酶水解微晶纖 維素 Avicel 的體系中分別添加 2.5mg/mL 直鏈甘露聚糖、高分子量半 乳甘露聚糖以及低分子量半乳甘露聚糖后 ,Avicel 酶解得率降低了13.75%-39.10%。甘露聚糖對纖維素水解的抑制作用與甘露聚糖的結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān) , 高分子量的甘露聚糖對纖維素水解的抑制作用強于 低分子量甘露聚糖的抑制作用 , 而半乳糖基支鏈的存在會使甘露聚糖 對纖維素水解的抑制作用能力減弱。 探究了甘露聚糖對單一纖維素酶 組分（內(nèi)切葡聚糖酶Cel5A、外切葡聚糖酶Cel6A和Cel7A以及p -葡萄糖苷酶Cel3A）酶促反應(yīng)動力學(xué)的影響，揭示了甘露聚糖抑制纖維素 水解的機制。通過探究甘露

4、聚糖對單一纖維素酶組分水解能力的影響 發(fā)現(xiàn)甘露聚糖對Cel5A、Cel6A和Cel7A的水解能力有強烈的抑制作 用,但是對Cel3A的水解能力沒有影響。動力學(xué)試驗結(jié)果表明甘露聚 糖會占據(jù)Cel7A的活性位點，從而競爭性的抑制Cel7A的活力，其中高 分子量半乳甘露聚糖對Cel7A活力的抑制作用最強（抑制常數(shù)K_i為0.43 mg/mL）, 低分子量半乳甘露聚糖的抑制作用次之 （抑制常數(shù) K_i為 0.47mg/mL）, 直鏈甘露聚糖的抑制作用最弱 （抑制常數(shù) K_i 為 0.50 mg/mL）。研究了甘露聚糖水解產(chǎn)物（甘露低聚糖、甘露糖和半乳糖）對纖維素水解效率的影響。研究結(jié)果顯示 , 甘露低

5、聚糖、甘露糖和半 乳糖也會抑制纖維素水解效率 , 其中甘露低聚糖抑制纖維素水解的能 力最強, 其次是半乳糖 , 再次是甘露糖。在纖維素酶水解 Avicel 的體 系中分別添加等量的 （5 mg/mL） 甘露低聚糖、半乳糖和甘露糖 后,Avicel酶解得率分別降低了 12.70% 4.23%和3.97%o進一步探究甘露低聚糖結(jié)構(gòu)特性包括鏈長和半乳糖取代基等對甘露低聚糖抑 制纖維素水解的影響可知 , 甘露低聚糖對纖維素水解的抑制作用隨甘 露低聚糖鏈長的增加而減弱 ,隨半乳糖取代基的移除而增強。通過探究甘露低聚糖、 甘露糖及半乳糖對單一纖維素酶組分水解能力的影響發(fā)現(xiàn)甘露低聚糖對Cel5A和Cel3A

6、的水解能力沒有抑制作用，但是會 抑制Cel6A和Cel7A的水解能力，而甘露糖和半乳糖對 Cel5A、Cel6A和Cel7A的水解能力均有抑制作用。動力學(xué)試驗結(jié)果進一步表明甘露 低聚糖是Cel7A的競爭性抑制劑(抑制常數(shù)K_i為1.57mg/mL)。探究 了甘露聚糖酶對甘露聚糖抑制纖維素水解的緩解作用 , 并從緩解甘露 聚糖抑制的角度揭示了甘露聚糖酶強化木質(zhì)纖維原料酶解的機制。 研 究結(jié)果顯示 , 甘露聚糖酶能有效的緩解甘露聚糖及其水解產(chǎn)物對纖維 素水解的抑制作用，在纖維素酶水解Avicel的體系中添加5 mg/mL半乳甘露聚糖后 ,Avicel 的酶解得率從 38.75%降低到了 18.68

7、%,進一步添加內(nèi)切甘露聚糖酶、P -甘露糖苷酶和半乳糖苷酶后,Avicel的酶解得率顯著提高到了 35.33%。在纖維素酶水解白云杉纖維素的過程中, 添加甘露聚糖酶后 , 白云杉纖維素的酶解得率提高了 14.29%。進步分析酶解液中纖維素酶活力的變化可知 , 添加甘露聚糖酶后 , 酶 解液中Cel5A和Cel7A的活力分別提高了 14.30%和10.91%,表明甘露聚糖酶可通過緩解酶解液中甘露聚糖對 Cel5A和Cel7A活力的抑制作用, 提高纖維素酶的活力 , 進而強化白云杉纖維素酶解。 探究了化學(xué)助 劑 Tween 80 對甘露聚糖及其水解產(chǎn)物抑制纖維素水解的緩解作用。研究結(jié)果顯示 ,Tween 80 能在一定程度上緩解甘露聚糖、 甘露低聚糖、 甘露糖及半乳糖對纖維素水解的抑制作用 , 在纖維素酶水解 Avicel的體系中分別添加半乳甘露聚糖 (5 mg/mL) 、甘露低聚糖 (5 mg/mL) 、添加甘露糖(10 mg/mL)和半乳糖(10 mg/mL)后,Avicel的酶解得率從 48.60%分別降低到了 26.64%、 39.96%、 39.15%和 36.90%,進Tween80 后,Avicel 的酶解得率分別提高到了 36.00%、46.58% 46.35%和45.00%。動力學(xué)試