二硫鍵蛋白表達策略的研究新進展(3)

1、二硫鍵蛋白表達策略的研究新進展(3)3.3.1 Erv1p 體系在二硫鍵蛋白表達中的應(yīng)用細胞內(nèi)隔室的情況相反，它們存在二硫鍵從頭形成的催化酶，如巰基氧化酶，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ero1、釀酒酵母線粒體內(nèi)膜空間的 Erv1p 等。如果向大腸桿菌細胞質(zhì)引入二硫鍵從頭形成體系，可能會大幅提高活性蛋白的產(chǎn)率。但是，此類巰基氧化酶不是直接作用于底物，它們需要媒介蛋白的輔助，如 Ero1 依賴 PDI,Erv1p 依賴 Mia40 等34.另據(jù)文獻報道，黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adeninedinucleotide, FAD）存在時，釀酒酵母的 Erv1p 可能獨立于 Mia40,直接利用氧氣分子催化巰

2、基形成二硫鍵35.另外，人們發(fā)現(xiàn)沒有任何輔因子時，Erv1p能有效地使變性牛胰胰蛋白酶抑制劑（含兩對二硫鍵）重新恢復自然狀態(tài)34.因此 Erv1p 可能是一種單獨的催化二硫鍵從頭形成的氧化酶。利用這一特性，2010 年 Hatahet 等34將釀酒酵母的 Erv1p 引入野生型大腸桿菌細胞質(zhì)，首次獲得比 （trxB-, gor-） 菌株產(chǎn)率更高的活性目標蛋白。他們的結(jié)果不僅顛覆了長久以來野生型原核細胞質(zhì)不能產(chǎn)生二硫鍵的普遍觀點，還使人們認識到蛋白的氧化折疊除與反應(yīng)環(huán)境相關(guān)，還與催化酶類有關(guān)。隨后，Nguyen 等36報道，利用預(yù)表達體系可進一步提高 Erv1p 對蛋白氧化的促進效應(yīng)。但同時還需

3、要融合標簽防止折疊中間體聚集。他們通過在細胞質(zhì)預(yù)先表達 Erv1p 與二硫鍵異構(gòu)酶，使活性 vtPA（含有 9 對二硫鍵）的產(chǎn)量比過去僅依靠 DsbC 共表達時提高 800 倍以上。另外，該體系也可應(yīng)用于分子間二硫鍵蛋白，如人類抵抗素（Resistin）是一種抑制脂肪細胞攝取糖分的激素，成熟的 Resistin 含有 5 對二硫鍵，并依靠 1 對分子間二硫鍵形成同源二聚體。以往的表達體系難以獲得可溶的或均質(zhì)蛋白，利用上述方法顯著提高Resistin 同型二聚體的產(chǎn)率。由此可見，這類巰基氧化酶似乎可以促進多二硫鍵蛋白的高效表達。3.3.2 QSOX 體系在二硫鍵蛋白表達中的應(yīng)用另一類靜息巰基氧化

4、酶 （quiescin-sulfhydryloxidase, QSOX） 是目前已知的唯一具有多功能域的氧化酶。QSOX 包括兩個類似硫氧還蛋白的功能域、富含螺旋的間隔區(qū)以及 FAD 結(jié)合功能域。與其他單功能域巰基氧化酶 Ero1,Erv1 等類似，QSOX 可催化二硫鍵的從頭形成，且具有更強的氧化能力37.利用這一特點，2012 年 Abskharon 等38報道了一種新的大腸桿菌表達體系，他依靠人源重組靜息巰基氧化酶（HsQSOX），在細胞質(zhì)中成功獲得具有生物活性的朊蛋白。隨后研究人員針對 QSOX 催化二硫鍵形成展開了深入研究。2014 年 Zhang 等39將 QSOX 與PDI 在

5、Origami B 細胞質(zhì)中融合表達，構(gòu)建了一種超氧化性細胞（superoxidizing cells）。他們以一類新近報道的對氧化還原敏感的綠色熒光蛋白（redox-sensitive green fluorescent protein, roGFP） 監(jiān)測細胞內(nèi)巰基-二硫鍵氧化還原電位，發(fā)現(xiàn)新型超氧化細胞的細胞質(zhì)氧化還原電位為-196 mV,比哺乳動物或酵母細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（約為-230 mV）還高。因此，這種超氧化性細胞非常利于二硫鍵的形成，明顯提高富含二硫鍵蛋白 Gluc、vtPA 等的氧化折疊效率，為利用大腸桿菌異源表達真核生物多二硫鍵蛋白提供了新策略。4 展望蛋白的氧化折疊除了具有熱力學

6、、動力學基礎(chǔ)之外，還涉及復雜的分子體系，所以它是一個難以解決的科學問題。如果蛋白還存在二硫鍵、糖基化等修飾，其表達折疊將更加復雜和難以控制。雖然近年來，人們利用（trxB-, gor-）工程菌株、超氧化性細胞或者二硫鍵從頭形成體系，已成功地在大腸桿菌中表達多種二硫鍵蛋白。但是這些方法存在局限性，它們或許只適用于小范圍的蛋白。隨著生產(chǎn)、研究的發(fā)展，人們越來越需要更多新型、通用的二硫鍵蛋白表達菌株或體系，這將是一個富有挑戰(zhàn)性的課題。但值得一提的是，2014 年 Georgescauld 等28發(fā)表的研究成果解析了分子伴侶輔助蛋白折疊組裝的作用機制，這為科學家們理解蛋白折疊的分子機制帶來了巨大幫助。

7、同時，這些理論成果也有助于優(yōu)化已有的方法策略，或為研發(fā)高效的二硫鍵蛋白表達體系創(chuàng)造新的契機。參考文獻（References）：1 DEMAIN A L, VAISHNAV P. Production of recombinant pro-teins by microbes and higher organismsJ. Biotechnology Ad-vances, 2009,27（3）：297-306.2 WONG J W, HO S Y, HOGG P J. Disulfide bond acquisitionthrough eukaryotic protein evolutionJ. M

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