全基因組測序技術(shù)在預防醫(yī)學中的應用綜述(2)

1、全基因組測序技術(shù)在預防醫(yī)學中的應用綜述(2)3疾病流行規(guī)律分析和預測使用群體遺傳學方法，對病原體的歷史分離株進行全基因組序列分析和進化研究，可以推測病原的長期流行情況，深入認識其所致疾病的流行規(guī)律。流感是最常見的呼吸道傳染病，每年在全球造成幾十萬人死亡。通過北半球（美國紐約）和南半球（新西蘭）在12年間分離的上千株甲型流感病毒的序列分析，Rambaut等22提出了流感流行的源庫模型;（source-sink model）。他們推測，流感病毒的遺傳多樣性在位于熱帶地區(qū)的宿主種群中（source）持續(xù)產(chǎn)生，并在強烈的自然選擇作用下發(fā)生抗原漂變等變異。隨后，在熱帶地區(qū)變異后的流感病毒季節(jié)性傳播到南北

2、半球的溫帶地區(qū)（sink）并在當?shù)卦斐闪餍?。因此，要從根源上遏制流感疫情，不僅要對流行區(qū)域進行疫苗接種等防控措施，還須要重視對熱帶地區(qū)流感宿主種群的研究。鼠疫菌是對人類歷史影響最深遠的病原之一，曾導致3次世界范圍的大流行。但由于缺乏病原學證據(jù)，前2次大流行（公元6世紀的查士丁尼瘟疫和14-17 世紀的中世紀黑死?。?是否為鼠疫菌所致在學術(shù)界一直有爭議。直到近年來，通過對死于前2次瘟疫的患者尸骨中提取的古DNA進行全基因組測序，才為這些爭議蓋棺定論23-24.分析結(jié)果顯示，古DNA與現(xiàn)代鼠疫桿菌在核心基因組上僅存在幾百個單堿基差異，證明2次流行確實是鼠疫桿菌所致。造成2次流行的鼠疫桿菌分屬于不同

3、的進化分支，其中引起第1次大流行的分支已經(jīng)在進化長河中消失；而引起第2次大流行的分支被保留下來，其后代在進化了幾百年后又導致了第3次世界大流行24.對全球代表性鼠疫桿菌分離株的全基因組測序和分析進一步加深了我們對鼠疫流行規(guī)律的認識。研究結(jié)果表明鼠疫可能起源于中國青藏高原東部，并通過絲綢之路、茶馬古道和唐蕃古道等古商貿(mào)途徑傳播到世界其他地區(qū)，說明人類活動在鼠疫傳播中起到重要作用25-26.通過適當?shù)臄?shù)學方法對病原體基因組變異進行解析，可以推測產(chǎn)生變異的系統(tǒng)發(fā)育過程，以及進化傳播過程中的各種重要參數(shù)，包括傳播速度、基礎(chǔ)復制率、采樣比率、有效種群大小等。Stadler等27應用基于貝葉斯方法開發(fā)的存

4、亡輪廓線模型（birth-death skyline plot, BDSP）對HIV基因組序列進行分析，重現(xiàn)了由于成功應用雞尾酒療法，英國的B型HIV-1有效復制率和種群多樣性在20世紀90年代開始呈現(xiàn)明顯下降的趨勢；并指出在90年代中期之后，由于高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法的產(chǎn)生，HIV的有效復制率開始低于1,提示流行趨勢已得到控制。該方法還被應用于63株埃及分離的HCV的序列分析，結(jié)果清晰顯示了20世紀初由于抗血吸蟲注射療法造成埃及HCV感染急劇增加，而在70年代之后，由于口服療法逐漸取代了注射療法，HCV感染率及有效種群也隨之下降27.BDSP方法從數(shù)學層面將基因組序列變異和疾病流行規(guī)律結(jié)合起來

5、，在將來疾病流行趨勢分析中將發(fā)揮重要作用。4疫苗變異監(jiān)測和使用效果評價利用全基因組序列分析，我們還可以對疫苗株的變異及使用效果進行監(jiān)測和評價。EV76是鼠疫耶爾森菌減毒活疫苗，曾在世界范圍內(nèi)應用于鼠疫預防接種。通過對中國保藏的EV76-CN株進行全基因組測序，并與鼠疫桿菌野生株進行比較分析，我們鑒定出疫苗株發(fā)生了12個突變（6個單核苷酸多態(tài)性和6個插入缺失）。選擇更多來自不同研究所和國際保藏中心的EV76疫苗株，對這些突變位點進行了掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗在各個國家之間轉(zhuǎn)移、運輸和生產(chǎn)的過程中，至少已形成5個種系，并發(fā)現(xiàn)中國使用的EV76株存在3個獨立的來源28.基因組水平的遺傳變異可能導致疫苗株

6、表型變化，進而影響接種后的免疫效果，因此我們的發(fā)現(xiàn)將有助于闡明各批次疫苗的免疫效力不同的問題，為疫苗的質(zhì)量監(jiān)測提出了新的思路。美國從2000年開始，大范圍應用肺炎球菌脂多糖-蛋白質(zhì)聯(lián)合七價疫苗（PCV7）。與此同時，能逃避疫苗的肺炎鏈球菌菌株在種群中的頻率開始上升。2012年，Golubchik等29通過對62株19A血清型肺炎鏈球菌的測序分析表明，同源重組造成關(guān)鍵遺傳片段在菌株間的水平轉(zhuǎn)移，是導致疫苗逃避的最重要原因。研究還發(fā)現(xiàn)，在重組造成莢膜轉(zhuǎn)換，從而逃避疫苗作用的同時，大量其他未知功能的基因組片段也通過搭車效應轉(zhuǎn)移到受體菌中。因此，疫苗的大規(guī)模應用會對細菌種群的進化產(chǎn)生一些難以預料的后果

7、。2013年，Croucher等30進一步研究了肺炎鏈球菌種群在疫苗作用下的進化機制，通過616株無癥狀攜帶者分離的肺炎鏈球菌基因組序列比對，研究者在莢膜生物合成基因簇、抗原蛋白編碼基因PspA和PspC等基因元件中觀察到了顯著的重組事件。結(jié)合近十年的流行病學資料進行綜合分析發(fā)現(xiàn)：重組對整個種群的血清型轉(zhuǎn)換和耐藥譜產(chǎn)生了影響，受到免疫的7個血清型幾乎完全消失，取而代之的是非疫苗免疫的型別。但接種疫苗前后物種的基因庫基本沒有發(fā)生變化，因此盡管兒童患病率顯著下降，肺炎鏈球菌的無癥狀攜帶者比例與疫苗使用前相比無顯著差別。以上研究讓我們了解到大規(guī)模疫苗接種行為對病原體種群組成的影響，這為將來疫苗的針對

8、性設(shè)計提供了依據(jù)。5問題與展望盡管已經(jīng)在預防醫(yī)學領(lǐng)域取得了顯著進展，但全基因組測序技術(shù)要真正進入基層疾病監(jiān)測機構(gòu)和醫(yī)院，仍然有很長一段路要走。首先要解決的是成本問題。目前上市的測序儀主要為人類基因組研究設(shè)計，而普通細菌基因組大小僅為人類基因組大小的千分之一。進行微生物基因組測序時，為了降低成本，往往須要把幾十甚至上百株樣品的DNA加上標簽后混合測序。這對于群體遺傳學研究是非常合適的，但限制了其在臨床上的應用。第二個要解決的問題是測序前樣本的快速處理。如果按照傳統(tǒng)測序方法，先對菌株進行復蘇培養(yǎng)，再大量提取DNA進行測序，其整個周期將仍然很長，難以體現(xiàn)快速全基因組序列分析的優(yōu)勢。盡管已有一些實驗室

9、解決方案被提出，如上文中提到的利用MGIT方法對結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)測序21,以及在非培養(yǎng)條件下，對樣本DNA進行富集后測序，或者直接進行宏基因組或者單細胞測序等32-33,但這些方法的大規(guī)模臨床應用還存在技術(shù)和成本屏障。第三個問題是海量數(shù)據(jù)的儲存管理及自動化分析。高通量實驗技術(shù)使得數(shù)據(jù)產(chǎn)生相對容易，而對數(shù)據(jù)的解析和管理成為科研的瓶頸。尤其對于疾病防控工作者和醫(yī)生來講，在日常工作中去對大量數(shù)據(jù)進行深入分析是不現(xiàn)實的，必須開發(fā)數(shù)據(jù)庫和自動化分析平臺，實現(xiàn)從序列到結(jié)果解讀的一鍵化;操作?？梢栽O(shè)想未來傳染病防控工作的一個場景：工作人員采集到患者體液樣本，在實驗室經(jīng)過簡單處理和平板培養(yǎng)，長出單菌落后，

10、將其分成兩部分，一部分用于提取DNA測序，另一部分繼續(xù)培養(yǎng)，進行表型試驗。幾個小時內(nèi)獲得測序結(jié)果后，可直接導入普通筆記本電腦預裝的軟件（或網(wǎng)絡分析平臺），軟件在幾分鐘內(nèi)自動給出標準格式的病原特性和溯源分析報告。測序分析結(jié)果與表型試驗相互印證，為患者臨床治療和疾病流行控制提供迅速有效的指導。這個場景令人鼓舞與期待。1 Didelot X, Bowden R, Wilson DJ, et al. Transforming clinical mi-crobiology with bacterial genome sequencingJ. Nat Rev Genet,2012, 13（9）：601-6

11、12.2 Diep BA. Use of whole-genome sequencing for outbreak investiga-tionsJ. Lancet Infect Dis, 2013, 13（2）：99-101.3 Robinson ER, Walker TM, Pallen MJ. Genomics and outbreak in-vestigation: from sequence to consequenceJ. Genome Med, 2013,5（4）：36.4 Kao RR, Haydon DT, Lycett SJ, et al. Supersize me: how whole-genome sequencing and big data are transforming epidemiologyJ. Trends Microbiol, 2014, 22（5）：282-291.5 Shapiro BJ, David LA, Friedman J, et al. Looking for Darwin s foot-prints in the microbial worldJ. Trend