臨床分子病理實(shí)驗(yàn)室二代基因測(cè)序檢測(cè)專家共識(shí)

1、臨床分子病理實(shí)驗(yàn)室二代基因測(cè)序檢測(cè)專家共識(shí)近年二代基因測(cè)序(next-generation sequencing,ngs)技術(shù)快速發(fā)展,其應(yīng)用 已進(jìn)展至臨床檢測(cè),如遺傳疾病、實(shí)體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細(xì)胞 抗原分析及非侵襲性產(chǎn)前篩查等。國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)會(huì)已出臺(tái)相關(guān)共識(shí)與指南以推動(dòng)其 在臨床中的應(yīng)用。中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)和中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤病理專委會(huì)前期組織 病理、臨床、生物信息等專家進(jìn)行了充分討論,擬在 ngs 的操作流程、數(shù)據(jù)處理、 結(jié)果解讀等方面作規(guī)范和建議,以規(guī)范 ngs 在分子病理領(lǐng)域的應(yīng)用。臨床分子病理實(shí)驗(yàn)室 ngs 樣本可采用甲醛固定石蠟包埋組織(formalin-fixed

2、paraffin-embedded,ffpe)、新鮮組織、各種體液上清 液、體液離心細(xì)胞塊、石蠟包埋標(biāo)本和血漿/血液標(biāo)本等。本共識(shí)特色是基于病理評(píng)估的組織樣本(ffpe、新鮮)的規(guī)范。 測(cè)序分析范圍基于目前臨床需求,本共識(shí)著重在于目標(biāo)區(qū)域測(cè)序(panel)分析的實(shí) 踐。隨著技術(shù)的更新和應(yīng)用的成熟,本共識(shí)將持續(xù)更新以滿足臨床需求。一、實(shí)驗(yàn)室總體要求ngs 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的總體設(shè)計(jì)與要求應(yīng)參考分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室建設(shè)指南(試 行)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則、個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南、腫瘤個(gè)體化治療檢測(cè)技術(shù)指南、個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室管理辦法、測(cè)序技術(shù) 的個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)指南(試行)進(jìn)

3、行。1. ngs 檢測(cè)人員的資質(zhì)要求:ngs 檢測(cè)技術(shù)人員應(yīng)具備臨床病理學(xué)、分子生物 學(xué)的相關(guān)專業(yè)大專以上學(xué)歷,并經(jīng)過 ngs 技術(shù)的理論與技能培訓(xùn)合格。數(shù)據(jù)分析人 員應(yīng)具有臨床醫(yī)學(xué)或分子生物學(xué)或遺傳學(xué)知識(shí)背景并經(jīng)生物信息學(xué)培訓(xùn)。最終報(bào)告 應(yīng)由中級(jí)或碩士以上具有病理學(xué)背景、經(jīng)培訓(xùn)合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或者授權(quán)簽字 人(醫(yī)學(xué)博士學(xué)位或高級(jí)職稱)審核。2. ngs 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的區(qū)域設(shè)置要求:原則上 ngs 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)有以下分區(qū):樣本 前處理區(qū)、試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫(kù)制備區(qū)、雜交捕獲區(qū)/多重 pcr 區(qū)域(第一擴(kuò)增區(qū))、文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)(第二擴(kuò)增區(qū))、文庫(kù)檢測(cè)與質(zhì)控區(qū)、測(cè)序區(qū)、數(shù)據(jù) 存貯區(qū)。各工

4、作區(qū)空氣及人員流向需要嚴(yán)格按照醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 室工作導(dǎo)則。分區(qū)可根據(jù)實(shí)際情況合并,但是在前處理和建庫(kù)時(shí),血液樣本應(yīng)與組 織樣本分開。3. ngs 檢測(cè)試劑及項(xiàng)目要求:試劑和測(cè)序平臺(tái)均應(yīng)選擇中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理 總局(cfda)認(rèn)可產(chǎn)品。涉及到實(shí)驗(yàn)室自配試劑,應(yīng)該有嚴(yán)格的試劑制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī) 程(sop),需經(jīng)過臨床實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目(ldt)驗(yàn)證合格才可使用。每個(gè) ngs 檢測(cè)項(xiàng)目 在驗(yàn)證時(shí)需要根據(jù)建庫(kù)方法、測(cè)序平臺(tái)和分析工具以及不同的突變類型包括,單堿基突變 single nucleotidevariant,snvs、小片段插入或者缺失(indels)、基因拷貝數(shù)變異 copynum

5、ber variations(cnvs)、染色體結(jié)構(gòu)變異,structuralvariation(svs)以及不同的樣本類型(如 ffpe 組織、新 鮮組織、全血、胸水等)對(duì)特定 panel的準(zhǔn)確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數(shù)進(jìn)行 ldt驗(yàn)證。應(yīng)該有經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的在不同的 mutant allele frequencies(maf) 下,不同測(cè)序深度的靈敏度及特異性數(shù)據(jù),確定不同樣本的可信的測(cè)序深度。經(jīng)驗(yàn)證后,sop 發(fā)生的任何改動(dòng),包括試劑、儀器、基因項(xiàng)目等都需要重新做驗(yàn)證。驗(yàn)證實(shí) 驗(yàn)結(jié)果簽名留底備案。4.ngs 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理要求:ngs 檢測(cè)主要包括實(shí)驗(yàn)操作和生物信息學(xué)分析

6、兩部分。實(shí)驗(yàn)操作部分包括樣本準(zhǔn)備、文庫(kù)制備、 編碼(barcoding)、目標(biāo)區(qū)域富集、測(cè)序等;生物信息學(xué)分析部分包括定位 (mapping)、比對(duì)、變異識(shí)別、變異注釋、變異解讀及報(bào)告等。上述流程均需要建 立實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系文件和 sop 及機(jī)器運(yùn)行和維護(hù) sop,具有嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控措 施;定期參加室間質(zhì)評(píng)以有及持續(xù)的質(zhì)量保證和改進(jìn)計(jì)劃。二、ngs 分析樣本、基因 panel 和轉(zhuǎn)運(yùn)要求ngs 分析樣本類型可采用 ffpe 樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細(xì)胞塊石蠟包埋標(biāo)本和血漿/血液標(biāo)本等。對(duì)于腫瘤體細(xì)胞變異初次 ngs 檢測(cè)應(yīng)首選經(jīng)病理評(píng)估的組織樣本,在此數(shù)據(jù)基 礎(chǔ)上的再次檢測(cè)可

7、選取液體樣本動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。ngs 檢測(cè)前需通過病理診斷明確其腫瘤的性質(zhì)及含量,根據(jù)不同腫瘤類型選擇 合適的基因 panel 測(cè)序。不同疾病的基因 panel 列表,必須由臨床與檢測(cè)機(jī)構(gòu)的專家共同決定,已達(dá)到 不同實(shí)驗(yàn)室之間的可比性和完善性。未經(jīng)病理評(píng)估的基因檢測(cè)結(jié)果不可單獨(dú)用于分子病理臨床診斷目的。樣本質(zhì)量對(duì)檢測(cè)結(jié)果和分析至關(guān)重要,病理醫(yī)師需要對(duì)可評(píng)估的樣本進(jìn)一步明 確病理診斷,并評(píng)價(jià)標(biāo)本有無出血、壞死和不利于核酸檢測(cè)的前處理(例如含 hcl 脫鈣液處理),病變細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)的總量和比例,避免假陰性。組織標(biāo)本中腫瘤細(xì) 胞含量建議達(dá)到 20%以上,低于此標(biāo)準(zhǔn)可富集后檢測(cè)。ngs 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)不

8、同類型的樣本有采集及處理 sop 指導(dǎo)。對(duì)于不同的樣 本(ffpe、體液、血液等)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有不同的樣本運(yùn)送 sop,物流環(huán)節(jié)(含冷鏈運(yùn)輸) 應(yīng)有相關(guān)運(yùn)送記錄,確保樣本運(yùn)送安全、無污染、無降解。三、ngs 檢測(cè)流程中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.核酸提取及其質(zhì)量分析:提取的核酸質(zhì)量是 ngs 檢測(cè)成功的關(guān)鍵因素,在制 備文庫(kù)前應(yīng)采用多種方法對(duì)核酸質(zhì)量評(píng)估,包括純度、濃度和完整性分析。需要根據(jù)不同的樣本類型制定相應(yīng)的 sop 用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對(duì)應(yīng)明確接受和拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。2. 文庫(kù)制備及其質(zhì)量分析:文庫(kù)制備方法主要有雜交捕獲和擴(kuò)增子建庫(kù),無論 采用何種方法制備文庫(kù)和平臺(tái)檢測(cè),都應(yīng)對(duì)檢測(cè)

9、基因、區(qū)域或突變熱點(diǎn)進(jìn)行描述,并 建立實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) sop。建立好文庫(kù)后上機(jī)測(cè)序前需對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量分析。每個(gè)檢測(cè) 項(xiàng)目應(yīng)設(shè)定其文庫(kù)質(zhì)量的要求,明確接受或拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。3. ngs 測(cè)序儀上機(jī)分析及其質(zhì)量分析:ngs 建庫(kù)主要有擴(kuò)增法和捕獲法兩大策略,測(cè)序時(shí)根據(jù)檢測(cè)樣本量和質(zhì)量要求確定適當(dāng)?shù)男酒? 以保證測(cè)序質(zhì)量和靶區(qū)覆蓋深度。錄入樣本編號(hào)、檢測(cè)內(nèi)容、設(shè)定參數(shù)等信息,按 儀器操作流程進(jìn)行測(cè)序。產(chǎn)生的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)要求詳見后文。4.ngs 檢測(cè)中的樣本追蹤及對(duì)照設(shè)置:(1)樣本追蹤:為確保檢測(cè)過程中樣本沒 有混淆或污染,可選用多個(gè) snv 位點(diǎn)或其他標(biāo)簽作為樣本身份標(biāo)識(shí)(sample id),在檢測(cè)前對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)