乳鼠腎細(xì)胞的原代培養(yǎng)盛心磊

乳鼠腎細(xì)胞的原代培養(yǎng)生92盛心磊2009012337同組成員：王璇實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2012年4月19至4月26實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)、了解細(xì)胞原代培養(yǎng)的一般方法與步驟。掌握無菌操作技術(shù)。復(fù)習(xí)并再次練習(xí)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)器材與試劑：1.實(shí)驗(yàn)器材：超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、水浴鍋、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、濾器、酒精燈、酒精棉、鑷子、器械缸、廢液缸、記號(hào)筆，蠟盤、大頭針、眼科剪、眼科鑷，移液器架、移液器、吸頭，試劑瓶、試劑瓶架，平皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、離心管等。2.實(shí)驗(yàn)試劑：PBS溶液：以成品干粉加超純水配制；過濾后121oC滅菌20min，4oC保存消化液：0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及雙抗）3.材料：三天左右的乳鼠（每人解剖一只）。實(shí)驗(yàn)步驟：消化法：（以下寫的是我實(shí)際操作時(shí)的步驟）將乳鼠（3天左右）斷頭放血致死。進(jìn)入無菌間，用70%乙醇消毒乳鼠體表，將其固定在蠟盤上。在超凈臺(tái)內(nèi)，將其背部皮膚剪出一個(gè)“工”字型開口，然后將皮膚拉開，固定在蠟盤上，使其腰背部肌肉暴露出來。用70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱兩側(cè)各剪一切口，取出腎臟，置于盛有PBS溶液的平皿中。將腎臟剪成數(shù)塊，用PBS溶液再洗滌一次。吸去PBS溶液，將腎臟剪碎（小而均勻）。加入0.5mL胰酶—EDTA溶液，于37℃消化20～30分鐘，直至組織塊變白、呈疏松狀。加入0.5mL含血清DMEM培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)“吹打”分散細(xì)胞。去除大塊組織后，1000rpm離心10min；棄上清。加入1mL含血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加入到10mL培養(yǎng)瓶中（每瓶1.5mL，每瓶80～100萬細(xì)胞），37℃、5%CO2培養(yǎng)。取少量細(xì)胞懸液（20uL），以PBS溶液稀釋10倍后進(jìn)行計(jì)數(shù)。1～2日后，更換部分或全部培養(yǎng)液。細(xì)胞生長成單層后，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。整理：取腎后，將鼠尸體置于專門的垃圾袋中。蠟盤、大頭針用洗干凈后，浸泡于酒精中。小剪刀、小鑷子在超凈臺(tái)中，可放置在專用的器械缸中；用畢洗刷干凈，按規(guī)定放置（216，盆中）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束將廢物缸中的物品及平皿丟棄，將廢物缸洗凈、控干水分，以酒精擦拭后置于超凈臺(tái)中。需要回收的培養(yǎng)皿洗凈后放在規(guī)定處。腎細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：吸棄原培養(yǎng)基，以PBS溶液洗細(xì)胞1-2次；加入200uL消化液，37℃消化3-5min（具體時(shí)間根據(jù)觀察結(jié)果決定）；加500uL含10％血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化；1000rpm，離心10min（實(shí)驗(yàn)中我未進(jìn)行離心）；加入1mL含血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；按比例分盤，取250uL和450uL分別接在兩個(gè)新的培養(yǎng)皿中，放在37oC、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；觀察記錄細(xì)胞生長狀況并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：乳鼠腎細(xì)胞的原代培養(yǎng)照片：乳鼠組織貼壁細(xì)胞乳鼠組織貼壁細(xì)胞圖1乳鼠腎細(xì)胞的原代培養(yǎng)（放大倍數(shù)10×40倍）上圖表示的是乳鼠腎細(xì)胞的原代培養(yǎng)的情況。圖中標(biāo)示出的是貼壁細(xì)胞，呈梭形，數(shù)量較多。圖中較亮的部分不是貼壁細(xì)胞，有可能是乳鼠腎臟內(nèi)的一些結(jié)締組織或脂肪組織。通過觀察，我發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿中部分區(qū)域都有細(xì)胞貼壁的現(xiàn)象，大約占到底面積的50%，因此決定先不傳代。在更換培養(yǎng)基后，我將其放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，一天后傳代。貼壁細(xì)胞圖2乳鼠腎細(xì)胞的原代培養(yǎng)（放大倍數(shù)10×40倍）貼壁細(xì)胞如上圖，培養(yǎng)皿的大部分區(qū)域都已經(jīng)被貼壁細(xì)胞覆蓋，覆蓋面積大約達(dá)到了70%，因此決定進(jìn)行傳代培養(yǎng)。乳鼠腎細(xì)胞的傳代培養(yǎng)照片圖3乳鼠腎細(xì)胞的傳代培養(yǎng)照片（放大倍數(shù)10×40倍）如圖所示，左邊的圖表示的是傳代時(shí)體積較少的細(xì)胞在傳代一天后的生長情況。可以看到，細(xì)胞數(shù)量較多，大部分都已經(jīng)貼壁，生長良好?？傮w上而言，較少的這一盤細(xì)胞長勢(shì)很好，底面積的覆蓋率大約達(dá)到了40%。右圖表示的是分盤時(shí)細(xì)胞較多的一盤。經(jīng)過一天的培養(yǎng)，底面積的覆蓋率達(dá)到了70%。圖4乳鼠腎細(xì)胞的傳代培養(yǎng)照片（放大倍數(shù)10×40倍）圖4表示的是傳代2天后細(xì)胞較多的一盤細(xì)胞的生長情況。該盤細(xì)胞密度較大，覆蓋率達(dá)到了100，而且培養(yǎng)基的顏色發(fā)生了變化，由原來的紫色變成了淡紅色，說明細(xì)胞活性強(qiáng)，生長較快。圖5乳鼠腎細(xì)胞的傳代培養(yǎng)照片（放大倍數(shù)10×40倍）圖5表示的是傳代3天后細(xì)胞較少的一盤的細(xì)胞的生長狀況。如圖所示，細(xì)胞的生長情況良好，覆蓋率也接近100%。兩盤細(xì)胞的覆蓋率都已經(jīng)達(dá)到較高，停止實(shí)驗(yàn)。分析與討論：原代細(xì)胞培養(yǎng)每天觀察的主要內(nèi)容：每天需要觀察的項(xiàng)目有：培養(yǎng)皿中是否有污染，細(xì)胞生長狀態(tài)，PH（通過培養(yǎng)液顏色變化）。如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變?yōu)槌燃t色或是淺紅色，且沒有出現(xiàn)渾濁的現(xiàn)象，說明細(xì)胞生長狀況良好。如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且又混濁，表明已被污染，這時(shí)細(xì)胞不易貼壁生長，逐漸死亡。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后我對(duì)培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化的培養(yǎng)皿進(jìn)行觀察（未換液），發(fā)現(xiàn)明顯的渾濁現(xiàn)象，用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形狀由梭形變?yōu)閳A球，細(xì)胞逐漸死亡。在沒有發(fā)生污染的情況下，一般按規(guī)24h，可見到許多細(xì)胞貼壁，由圓形懸浮狀態(tài)的細(xì)胞延展成短梭狀。培養(yǎng)3-4天時(shí)，細(xì)胞生長繁殖，數(shù)量增加，可見細(xì)胞形成孤立小片（細(xì)胞島），逐漸擴(kuò)展。細(xì)胞透明，顆粒少，界線清楚，狀態(tài)佳。由于細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)物堆積，CO2增多，培養(yǎng)液逐漸變酸呈黃色，但液體澄清，此時(shí)換液一次。2、原代培養(yǎng)的常見問題及注意事項(xiàng)：細(xì)胞貼壁狀況不好，細(xì)胞大量死亡。原因可能是在消化的時(shí)候，由于操作時(shí)間過長，細(xì)胞消化時(shí)間也變長，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面發(fā)生變化，導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡。細(xì)胞呈團(tuán)狀，沒能分散開。原因可能是剪碎細(xì)胞的過程中沒能做到很好，造成還有很大的細(xì)胞團(tuán)存在。在實(shí)驗(yàn)過程中，我十分注意細(xì)胞的分離，用剪刀反復(fù)剪細(xì)胞團(tuán)，因此分離較好。培養(yǎng)液中有大量雜質(zhì)，影響到觀察。原因是在剪碎腎的時(shí)候，把細(xì)胞剪碎，導(dǎo)致有很多細(xì)胞碎片，尤其是粘稠狀的遺傳物質(zhì)，會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在本次實(shí)驗(yàn)中確實(shí)出現(xiàn)了一些亮度較高的區(qū)域，懷疑為細(xì)胞碎片或是一些結(jié)締組織。培養(yǎng)幾天后，發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)存在。說明當(dāng)時(shí)的無菌操作存在問題，染上了雜菌，這個(gè)對(duì)細(xì)胞的正常生長也是會(huì)有影響的。傳代后細(xì)胞大量死亡。這個(gè)是由于小鼠腎細(xì)胞的活力不夠，在經(jīng)過傳代的胰酶消化后，細(xì)胞大量死亡，加之培養(yǎng)環(huán)境的改變，細(xì)胞不能調(diào)整而死亡。3、細(xì)胞生長周期：培養(yǎng)細(xì)胞的生命期（LifeSpanofCultureCells）大致經(jīng)歷原代培養(yǎng)(primaryculture)期、傳代期、衰退期三個(gè)階段，即細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。

細(xì)胞從接種到分離再培養(yǎng)的時(shí)間一般稱為“一代”，傳代細(xì)胞的一代生長期分為滯留期(latentphase)、指數(shù)生長期(logarithmicgrowthphase)、平臺(tái)期（stagnatephase）三個(gè)階段。其中指數(shù)生長期（又稱對(duì)數(shù)期）為細(xì)胞增殖最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多，成倍增長，活力最佳，容易出現(xiàn)接觸抑制(contactinhibition)和密度抑制(densityinh-ibition)。細(xì)胞分裂指數(shù)(mitoticindex，MI)可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個(gè)重要指標(biāo)，MI即指細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)，細(xì)胞的MI一般介于0.1%～0.5%，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。也可通過生長曲線在此期確定細(xì)胞的群體倍增時(shí)間（populationdoublingtime，PDT）。六、感謝感謝李鵬老師在實(shí)驗(yàn)前詳細(xì)的講解以及實(shí)驗(yàn)過程中的耐心的指導(dǎo)，也感謝各位助教的精心準(zhǔn)備和悉心“點(diǎn)撥”。經(jīng)過本次實(shí)驗(yàn)，我學(xué)習(xí)到了乳鼠細(xì)胞的原代培養(yǎng)，進(jìn)一步練習(xí)了傳代技術(shù)，在此對(duì)老師和助教致以最誠摯的謝意！本次實(shí)驗(yàn)，我進(jìn)行傳代的細(xì)胞“興奮過度”，活力四射，長勢(shì)過于兇猛，成為本次實(shí)驗(yàn)最健康的細(xì)胞。以至于4月25日細(xì)胞已經(jīng)長滿培養(yǎng)皿，提前結(jié)束了實(shí)驗(yàn)。事實(shí)告訴我們，只要認(rèn)真學(xué)習(xí)，注意操作中的一些細(xì)節(jié)，細(xì)胞傳代不是特別困難的。另外