基因突變的檢測(cè)方法

1、基因突變的檢測(cè)方法基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，檢測(cè)方法也隨之迅速發(fā)展。 人類細(xì)胞癌基因的突變類型已如上所述，對(duì)于基因突變的檢測(cè)，1985 以前，利用 Southern 印跡法，可以篩選出基因的缺失、 插入和移碼重組等突變形式。 對(duì)于用該法法不能檢測(cè)的突變， 只能應(yīng) 用復(fù)雜費(fèi)時(shí)的 DNA序列測(cè)定分析法。多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reactio n,PCR )技術(shù)是突變研究中的最重大進(jìn)展， 使基因突變檢測(cè)技術(shù)有了長(zhǎng)足的發(fā)展， 目前幾乎所有的基因 突變檢測(cè)的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR勺基礎(chǔ)之上，并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，目前已達(dá)二十余種， 自動(dòng)化程

2、度也愈來愈高， 分析時(shí)間大大縮短， 分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有很 大很提高。 其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性 ( single-strand comformational polymorphism,SSCP ) 和異源雙鏈分析法(heteroduplex analysis,HA )。下面分別介紹幾種 PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典 突變檢測(cè)方法，可根據(jù)檢測(cè)目的和實(shí)驗(yàn)室條件選擇時(shí)參考。PCR-SSC法 PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構(gòu)象， 一個(gè)堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動(dòng)速度改 變。其基本原理為單鏈 DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，

3、這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成，即使一個(gè)堿基的不同， 也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)而出刺同的遷移率。 由于該法簡(jiǎn)單快速， 因 而被廣泛用于未知基因突變的檢測(cè)。用PCR-SSC法檢測(cè)小于200bp的PCR產(chǎn)物時(shí)，突變檢出率可達(dá)70% -95 %，片段大于400bp時(shí)，檢出率僅為50%左右，該法可能會(huì)存在1%的假陽性率。應(yīng)用PCR-SSCPt應(yīng)注意電泳的最佳條件，一般突變類型對(duì)檢測(cè)的靈敏度無大的影 響，同時(shí)該法不能測(cè)定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)，還需通過序列分析來確定。Sarkar 等認(rèn)為對(duì)于大于200bp的片段，用其RNA分子來做SSCP會(huì)提高其錄敏度。應(yīng)用PCR-SSCP僉測(cè)點(diǎn)突變已見 報(bào)道于人類大部分的腫瘤組織

4、或細(xì)胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。 檢測(cè)的基因包括多種癌基因及抑癌基因， 也是檢測(cè)抑癌基因 p53 突變最常用的方法， 僅檢測(cè) 第5-8外顯子即可發(fā)現(xiàn)85%以上的p53基因突變。由于該法簡(jiǎn)便快速，特別適合大樣本基 因突變研究的篩選工作。異源雙鏈分析法(HA) HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈 DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成一突起，在非變性凝膠中電泳 時(shí)，會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙 DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的 是單鏈DNA HA法分離的是雙鏈 DNA也只適合于小片段的分析。但HA對(duì)一些不

5、能用 SSCP檢出的突變有互補(bǔ)作用，兩者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高到近100%。突變體富集PCRfeC mutant-enriched PCR )本法的基本原理是利用ras基因家族某個(gè)密碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)， 如 K-ras 基因第 12 密碼子的 BstNI 位點(diǎn)，第 13 密古 巴子有Bgin位點(diǎn)。用鏈續(xù)二次的巢式 PCF來擴(kuò)增包括 K-ras第12、13密碼子的DNA片段, 在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集。變性梯度凝膠電泳法(denaturing grad

6、inent electrophoresis,DGGE) DGGE法分析 PCR產(chǎn)物，如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域，檢出率可達(dá)100%，檢測(cè)片段可達(dá)1kb，最適圍為100bp-500bp?；驹砘诋?dāng)雙鏈 DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳適移率下降，當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)， 會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程而被分離。 由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測(cè)， 需要一套專用的電泳裝置， 合成 的PCR引物最好在5末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測(cè)發(fā)生于高熔點(diǎn)區(qū)的突變。 在DGGE勺基礎(chǔ)上，又發(fā)展

7、了用濕度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法 (溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE )。DGGE和 TGGE勻有商品化的電泳裝置， 該法一經(jīng)建立，操作也較簡(jiǎn)便，適合于大樣本的檢測(cè)篩選?；瘜W(xué)切割錯(cuò)配法(chemical cleavage of mismatch,CCM ) CCM為在 Maxam-Gilbert 測(cè)序法 的基礎(chǔ)上發(fā)展的一項(xiàng)檢測(cè)突變的技術(shù)，其檢測(cè)突變的準(zhǔn)確性可與DNA測(cè)序相仿。其基本原理為將待測(cè)含DNA片段與相應(yīng)的野生型 DNA片段或DNA和RNA片段混俁變性雜交，在異源雜合 的雙鏈核酸分子中，錯(cuò)配的C能被羥胺或哌啶切

8、割，錯(cuò)配的T能被四氧化餓切割，經(jīng)變性凝膠電泳即可確定是否存在突變。 該法檢出率很高， 也是檢片段最長(zhǎng)的方法， 已有報(bào)功檢測(cè)了 片段，如果同時(shí)對(duì)正、反義鏈進(jìn)行分析，檢出率可達(dá)100%。應(yīng)用熒光檢測(cè)系統(tǒng)可增強(qiáng)敏感度，可檢測(cè)到 10個(gè)細(xì)胞中的 1 個(gè)突變細(xì)胞。該法中的化學(xué)試劑有毒，又發(fā)展了碳二亞胺檢 測(cè)法(catodiimide,CDI ) ,CDI為無毒物質(zhì)，也可檢測(cè)大片段DNA的點(diǎn)突變。等位基因特異性寡核苷酸分析法( allele-specific oligonucleotide,ASO ) ASO 為一種以 雜交為基礎(chǔ)對(duì)已知突變的檢測(cè)技術(shù)。以PCR和ASO相結(jié)合，設(shè)計(jì)一段 20bp左右的寡核苷

9、酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR拉增的樣品DNA雜交?？梢杂酶鞣N突變類型的寡核苷酸探針， 同時(shí)以野生型探針為對(duì)照， 如出現(xiàn)陽性雜交帶， 則表運(yùn)河樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點(diǎn)突變，ASO需嚴(yán)格控制雜交條件和設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照避免假陽性和假陰性。目前已有商品化的檢測(cè)盒檢測(cè)部分癌基因ASO突變。DNA芯片技術(shù)(DNA chip ) DNA芯片技術(shù)是90年代后發(fā)展的一項(xiàng) DNA分析新技術(shù)，它集合 了集成電路計(jì)算機(jī)、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)記探針和DNA合成等先進(jìn)技術(shù)?？捎糜诨蚨ㄎ弧NA測(cè)序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突變檢測(cè)方面DNA芯片也有廣闊的前景，其基

10、本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此之間重疊1個(gè)堿基，并覆蓋全部所需檢測(cè)的基因，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA發(fā)別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個(gè)堿基的差異，正常和突變的DNA將會(huì)得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過共聚集顯微鏡分別檢測(cè)兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)，即可確定是否存在突變，該方法快速簡(jiǎn)單、 片動(dòng)化程度高， 具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ?將在基因突變檢測(cè)中心發(fā)揮非常重要的作用。連接酶鏈反應(yīng)( ligase chain reaction,LCR ) 與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)比較，其最大特點(diǎn)為可 準(zhǔn)確區(qū)分基因序列中單個(gè)基因突變，由 Landegree 于 1988 年首次

11、應(yīng)用于鐮刀獎(jiǎng)細(xì)胞貧血的 分子診斷。LCR是以DNA連接酶將某一 DNA鏈的5-磷酸與另一相鄰鏈 3-羥基連接為基礎(chǔ)， 應(yīng)用兩對(duì)互補(bǔ)的引物，雙鏈DNA經(jīng)加熱變性后，兩對(duì)引物分別與模板復(fù)性，若完全互補(bǔ)，則在連接酶的作用下，使相鄰兩引物的 5- 磷酸與 3- 羥基形成磷酸二酯二酯鍵而連接，前一 次的連接產(chǎn)物又作為下一次循環(huán)反應(yīng)的模板，如果配對(duì)的堿基存在突變則不能連接和擴(kuò)增。LCR產(chǎn)物檢測(cè)最初是通過這32p標(biāo)記上游引物3未端，經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加以鑒定，其檢測(cè)敏感性達(dá)到 200 個(gè)靶分子。也可設(shè)計(jì) 1 個(gè)橫跨兩引物的檢測(cè)探針，用它與 LCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測(cè)。近年有應(yīng)用熒光素、地高辛等非核素

12、標(biāo)記方法。Batt在1994年發(fā)展了一種更為簡(jiǎn)的方法，好微孔板夾心雜交法。由于 LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及 能檢測(cè)單個(gè)堿基突變的能力，因此被應(yīng)用于腫瘤基因突變的分子診斷，并與PCR吉合用以提高其敏感性。等位基因特異性擴(kuò)增法 (Allele-specificamplification,ASA) ASA于 1989 年建立，是 PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)( amplification refractory mutation system,ARMS)、等位基因特性 PCR( allele-specificPCR,ASPCR等，用于對(duì)已知突變基因進(jìn)行檢測(cè)。該法通過設(shè)計(jì)兩個(gè)5端

13、引物，一個(gè)與正常 DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變 DNA互補(bǔ)，對(duì)于純合性突變，分別加入這兩種引物及 3端引物進(jìn)行兩個(gè)平行 PCR吸有與突變DNA完互 補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯(cuò)配位于引物的3端則導(dǎo)致PCR不能延伸，則稱為ARMS ARMS ASPCR借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時(shí)檢測(cè)兩種或多種等位 基因突變位點(diǎn)。ASA法的檢出率依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DNA有氏配時(shí)錯(cuò)配延伸，特別是當(dāng)錯(cuò)配堿基為G: T時(shí)，這時(shí)可通過調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件如引物靶DNA Taq DNA聚合酶的濃度等來得高瓜在特異性。 在反應(yīng)體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴(kuò)增。 還可 通過在引物 3端的第

14、二個(gè)堿基引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，使之與模板之間形成雙重錯(cuò)配以阻止錯(cuò) 誤延伸。RNA酶A切割法(RNaseA cleavage )在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子 RNA RNA或 RNA DNA中的錯(cuò)配堿基可被 RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離。當(dāng)RNA探針上錯(cuò)配的堿基為嘌呤時(shí)，RNaseA在錯(cuò)配處的切割效率很低，甚至不切割，而當(dāng)錯(cuò)配堿基為嘧啶時(shí)，則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個(gè)條鏈，突變檢出率只有30%，如同時(shí)分析正義和反義二條鏈，檢出率可達(dá)70%。該法需要制備 RNA探針，增加了操作的復(fù)雜性，但可用于 1-2kb 的大片段進(jìn)行檢測(cè)， 并能確定突變位點(diǎn)。 于這些優(yōu)越性

15、，它仍被作為一 種經(jīng)典方法用于對(duì)未知突變進(jìn)行分析。染色體原位雜交( In situ hybridization of chromosome)染色體發(fā)現(xiàn)距今已有 150 多年的歷史， 染色體檢測(cè)被廣泛用于動(dòng)、 植物及人類的細(xì)胞遺傳學(xué)研究， 隨著染色體分技術(shù)和分 子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展。 染色體研究范圍也不斷擴(kuò)大， 特別是用于腫瘤分子診斷。 腫瘤細(xì)胞的 染色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象，可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類。在腫瘤形成的生物學(xué)基礎(chǔ)方面， 原發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關(guān)， 腫瘤細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)各種形式的染色體畸 變，如缺失、重復(fù)、易位、重排、單體斷裂及核內(nèi)復(fù)制等；繼發(fā)性變化主要是腫瘤細(xì)胞核型 的改

16、變。染色體的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的診斷、 鑒別診斷、生物學(xué)行為判別等方面都重要意義。染 色體的檢測(cè)方法進(jìn)展很快，檢測(cè)的精確率也不斷提高，這里主要介紹熒光原位雜交和PRINS法。熒光原位雜交技術(shù)( fluorescent in situ hybridiaation,FISH)創(chuàng)建于 1986 年。 1969 年Gall 和 Pardue 首先應(yīng)用核素標(biāo)記核苷酸制備探針，通過放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)。應(yīng)用核 素標(biāo)記的探針其敏感性可以檢測(cè)到中期染色體上幾百 堿基的單拷貝靶核苷酸序列，敏感性雖高，但定位不夠精確。FISH 具有探針穩(wěn)定、操作安全，可快速、多色顯示多個(gè)不同探針的雜交信號(hào)等優(yōu)點(diǎn)。FISH 的靈敏感與

17、探針標(biāo)記方法和檢測(cè)儀器性能有關(guān)，探針標(biāo)記時(shí)摻入的修飾核苷酸比例直接影響雜交信號(hào)強(qiáng)度。FISH 探針一般采用隨機(jī)引物法或切口翻譯法，如將PCR技術(shù)引入FISH探針標(biāo)記，可使其靈敏度提高到。應(yīng)用慢掃描 CCD配合影像處理理軟件，增強(qiáng)信噪比，有利于檢測(cè)微弱信號(hào)，如應(yīng)用TSA系統(tǒng)( tyramide signal amplification )能將雜交信號(hào)再放大 1000 倍，可用于單拷貝基因 的定位。FISH分辨率大約為1-3Mb,如果應(yīng)用強(qiáng)變性劑處理染色體，讓DNA分子從蛋白質(zhì)中分離出來，使雙 DNA完全伸展并粘附在玻片上，經(jīng)引處理后，分辨率可達(dá)1-2kb。還可采用對(duì)分裂中期染色體進(jìn)行顯微解剖(m

18、icrodissect )法以提高分辨率。FISH的另一個(gè)特點(diǎn)是可以聯(lián)合慶用地高辛、生物素等多種標(biāo)記系統(tǒng)，在一次雜交中可檢測(cè)多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關(guān)系， 即多色 FISH 或多靶 FISH。 FISH 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究 中的基因擴(kuò)增、 易位重排及缺失等的檢測(cè)， 在腫瘤診斷和鑒別診斷、 預(yù)后和治療監(jiān)控等方面 都有重要意義。Klch等于1989年發(fā)明了染色體上寡核苷酸引物原位DNA合成技術(shù)(oligonucleotideprimedin situ DNA synthesis,PRINS),并成功地用于染色體特異a衛(wèi)星DNA標(biāo)記。其基本原理是用非標(biāo)記的寡核苷酸引物同染色體上

19、靶序列特異性地雜交，在DNA聚合酶作用下，當(dāng)引物延伸時(shí)，摻入標(biāo)記的核革酸可直接或間接地檢量標(biāo)記位點(diǎn)。PRINS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需克隆基因作探針， 且由于雜交反應(yīng)在前， 標(biāo)記在后， 故非特異懷背景低。 缺點(diǎn)是信號(hào)弱， 靈敏度低， 為克服這一制瞇， Terkelsen 等建立了重復(fù)引物原位標(biāo)記技術(shù)( repeated PRINS ) , 重復(fù)進(jìn) 行PRINS反應(yīng)，使信號(hào)號(hào)強(qiáng)度明顯提高。基于FISH的原理，發(fā)展了多色原位經(jīng)物標(biāo)記(multicolor PRINS ,可測(cè)定二個(gè)以上靶序列在DNA分子上的相互的位置， 且特異性比FISH還高。DNA序列分析(DNA sequencing)應(yīng)用各種突變檢測(cè)技

20、術(shù)檢測(cè)到的基因突變，最后都需用 序列分析才能確定突變類型及突變位置，其效率可以達(dá)到100?，F(xiàn)在的測(cè)序方法已與經(jīng)典的方法有了很大的不同， 其基本原理雖仍是雙脫氧終止法， 但自動(dòng)化程度大為提高， 操作更 簡(jiǎn)便，測(cè)序時(shí)間也大大縮短。隨著PCR技術(shù)與測(cè)序聯(lián)合使用，不需經(jīng)過M13亞克隆步驟，故稱為直接測(cè)序法(direct sequencing,DS )。DS法測(cè)序的模板主主要來源于PCR應(yīng)用不對(duì)稱 PCR( asymmetric PCR )和基因組擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄同步測(cè)序法( genomic amplification with tran script seque ncin g,GAWTS)等，使單鏈產(chǎn)物大大增加。近年來，PCR循環(huán)測(cè)序法的建立，使模板擴(kuò)增與同步進(jìn)行， 引物用四種不同前顏色的熒光標(biāo)記， 使每個(gè)樣品的四個(gè)測(cè)序反 應(yīng)可在一個(gè)反應(yīng)管和一個(gè)泳道內(nèi)進(jìn)行，