細(xì)胞遺傳室工作手冊SOP

1、第一章設(shè)備與器械 中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國家 重點實驗室 作業(yè)指導(dǎo)書 文件編號 版本/修訂號 實驗室用房使用規(guī)范 發(fā)布日期 實施日期 1目的 規(guī)范實驗室用房，確保實驗室工作和業(yè)務(wù)用房的正常需要，以促進(jìn)科室的發(fā) 展，確保各項工作順利進(jìn)行。 2實驗室用房規(guī)范與要求 細(xì)胞遺傳學(xué)實驗室一般分為洗滌室、培養(yǎng)室、細(xì)胞學(xué)處理室、閱片室、暗室、 檔案室。其要求一般與其他普通實驗室的要求基本相同： 1. 便于所有器具的清洗。 2. 3 便于準(zhǔn)備消毒及各種試劑的保藏。 4.便于使用各種方法檢測待檢標(biāo)本，進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)方面的臨床診斷。 但同時需要具有暗室并具有符合醫(yī)療檔案存放的檔案室。 洗滌室 玻璃器皿的清

2、洗、包裝，培養(yǎng)物質(zhì)的準(zhǔn)備與消毒，供應(yīng)物品的保藏等工作都 需在洗滌室里進(jìn)行，洗滌室的大小一般為4mX6m，洗滌室應(yīng)設(shè)有下列設(shè)備： 1. 一個清洗玻璃器皿的水槽，便于清洗、晾干； 2. 電熱干燥消毒箱，用于玻璃器皿的干熱滅菌； 3. 高壓蒸汽滅菌鍋，用于不能耐受干熱滅菌物品的處理； 4. 烤箱兩個便于烤干玻璃器皿或高壓蒸汽滅菌物品； 5. 石英玻璃雙重蒸鐳器或超純水裝置，用于蒸鐳水或超純水的制備； 6. 真空泵一個，以備配制培養(yǎng)基過濾時用； 7. 物品準(zhǔn)備臺，以備包裹玻璃器皿等； 8. 儲柜或儲架，便于清洗干燥的器皿或其它物品存放； 9. 酸缸，一般最好是耐酸材料，用于盛裝清洗液，清洗液多為含重洛

3、酸鉀的 硫酸溶液。 培養(yǎng)室 培養(yǎng)室包括操作間和緩沖室，操作室功能是進(jìn)行無菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)，如各種組織取 材與接種材料的準(zhǔn)備、培養(yǎng)物的生長狀態(tài)觀察等，因此應(yīng)配有超凈工作臺、co：培養(yǎng)箱、倒 置顯微鏡、小型低速離心機、冰箱、玻璃柜等。緩沖室則是供工作人員進(jìn)入培養(yǎng)室前換消毒 衣服、鞋、帽等之用。培養(yǎng)室一般3mX3m已夠用，要求淸潔、干燥、不通風(fēng)、光線適宜。 操作間必須墻壁光滑并裝有空調(diào)器，操作間與外間實驗室之間最好有傳遞窗，以便傳遞臨時 需用的實驗用品。培養(yǎng)室空氣消毒可采取紫外線消毒或空氣凈化。 細(xì)胞學(xué)處理室 細(xì)胞學(xué)處理室需要配備普通離心機、恒溫水浴箱及恒溫電烤箱（烤片用）等， 主要用于染色體的收獲

4、與顯帶。 暗室 暗室用于對熒光原位雜交技術(shù)結(jié)果的觀察和分析，配備熒光顯微鏡和分析系 統(tǒng)。 中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國家 重點實驗室 作業(yè)指導(dǎo)書 文件編號 版本/修訂號 各類儀器設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 發(fā)布日期 實施日期 1目的 規(guī)范各類儀器的正常使用和保養(yǎng)，延長儀器的使用壽命，確保各結(jié)果的準(zhǔn)確 性。 2儀器使用環(huán)境： 1）無灰塵、通風(fēng)環(huán)境良好。 2）避免陽光直射。 3）室內(nèi)溫度1830C,變化不超過2C 4）室內(nèi)濕度280%RH。 5）電源電壓變化再20V10V之內(nèi)，5m內(nèi)不能有配電器。 3使用儀器程序 超凈工作臺 超凈工作臺是H前實驗室內(nèi)普遍應(yīng)用的無菌操作裝置，在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行 無菌操作，

5、可明顯地減少細(xì)菌污染的機會。超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機 驅(qū)動空氣，通過高效空氣微粒濾層凈化，使操作范圍形成無菌環(huán)境。 培養(yǎng)箱 實驗室一般應(yīng)置備二臺co：培養(yǎng)箱，將來自同一標(biāo)本的培養(yǎng)瓶分兩線放入不 同的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以保證細(xì)胞培養(yǎng)的成功率。co,培養(yǎng)箱常見的是隔水式培養(yǎng) 箱。培養(yǎng)的細(xì)胞需要一個恒定的溫度，過低或過高的環(huán)境溫度均可導(dǎo)致細(xì)胞死亡, 因此對培養(yǎng)箱的靈敏度要求在土C。此外，一定濃度的co,也是細(xì)胞培養(yǎng)所必需 的。CO,培養(yǎng)箱可恒定地提供細(xì)胞所需的CO：（通常是5%）,使培養(yǎng)液的pH值保 持穩(wěn)定，適用于開放性培養(yǎng)。使用時應(yīng)注意每三個月定期校正，如有異常應(yīng)及時 調(diào)整。培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須保

6、持清潔，應(yīng)定期用酒精擦拭消毒，消毒時每層隔板均 需洗刷干凈，并用75%酒精紗布擦拭。每周定期更換箱底水盤中的水，以保持 相對濕度。為防污染可在水盤內(nèi)加入1%。新潔爾滅。箱內(nèi)高效空氣過濾器堵塞時, 指示燈提示后需及時更換 烤箱 烤箱用于玻璃器皿的烘干和干熱滅菌，一般以650mmX500mmX500mm的比較 適用。烤箱都裝有鼓風(fēng)裝置，鼓風(fēng)與升溫同時開始。干熱滅菌物品時一般為180C 維持，滅菌后應(yīng)待箱內(nèi)溫度下降至80C時方可開門，以免驟冷而致玻璃器皿損 壞。應(yīng)注意的是橡皮制品、塑料培養(yǎng)板、有機玻璃制品禁用烤箱滅菌。 恒溫水浴鍋 恒溫水浴鍋是實驗室不可缺少的設(shè)備。主要用于顯帶處理和培養(yǎng)基的加溫。

7、由專人負(fù)責(zé)每周更換蒸憎水并添加防腐劑。 I 水純化裝置 離體培養(yǎng)的細(xì)胞對水的要求特別高，培養(yǎng)細(xì)胞用的器皿清洗最后一道程序應(yīng) 用二蒸水沖洗，培養(yǎng)基的配制也應(yīng)用二蒸水或超純水。LI前常用的有自動雙重純 水蒸鐳器（石英管加熱），因為普通的橡皮對細(xì)胞是有毒的，所以制備好的二蒸 水應(yīng)避免通過橡皮管放出。 冰箱 實驗室必須配備有普通冰箱和低溫冰箱（-20C）,普通冰箱用于培養(yǎng)液、生 理鹽水、Hanks溶液等試劑和標(biāo)本短期的存放，低溫冰箱用于貯存需要冷凍保持 生物活性及長時間存放的試劑如血清等。 細(xì)胞冷凍貯存器 細(xì)胞冷凍裝置一般分為運輸用和儲存用二種液氮罐，用于細(xì)胞株和標(biāo)本的保 存，液氮罐雙層結(jié)構(gòu)中間為真空

8、層，其內(nèi)膽頸部與體部經(jīng)焊接相連，故搬動和裝 入液氮時，應(yīng)緩慢加入，使容器內(nèi)的溫度均勻下降，有條件可配備有程控降溫儀 的液氮儲存系統(tǒng)，該系統(tǒng)的特點是可自動控制冷凍箱的降溫速度。 離心機 細(xì)胞培養(yǎng)需要經(jīng)常消化分離細(xì)胞、漂洗制備細(xì)胞懸液和進(jìn)行傳代以及染色體 的收獲，因此接種培養(yǎng)室與細(xì)胞處理室內(nèi)可各配置一臺可調(diào)速的小型臺式離心機。 高壓蒸汽滅菌裝置 高壓滅菌是利用高壓蒸汽使細(xì)菌體內(nèi)蛋白凝固而達(dá)到滅菌，是最常用的滅菌 方法。在。C, 30分鐘就能殺死所有繁殖型細(xì)菌的芽胞。高壓蒸汽滅菌比其它滅 菌方法效果都好。山于蛋口質(zhì)的凝固需有水分存在，當(dāng)細(xì)菌體內(nèi)含有水分在25% 以下時，蛋白質(zhì)的凝固溫度如下： 水分含

9、量凝固溫度 25%74-80 C 8%80-90 C 6%145 C 山此可見，在細(xì)菌體內(nèi)有水分存在的條件下可以大大降低滅菌所需的溫度。 高壓滅菌主要用于細(xì)胞培養(yǎng)所需的二蒸水、 皮類等。 生理鹽水、手術(shù)器械、布類、橡 4顯微鏡與細(xì)胞遺傳圖象分析工作站 顯微鏡是分析染色體的必備工具，一般要求每位實驗室技術(shù)人員配備一臺。 有條件的實驗室可配備細(xì)胞遺傳圖象分析工作站。 維護(hù)保養(yǎng)記錄 每日保養(yǎng) 每日登記各儀器的運行和使用情況，保證每臺儀器的正常運行。 每周保養(yǎng) 每周對各儀器進(jìn)行清潔維護(hù)，檢查各儀器是否存在各類使用的隱患。 每月保養(yǎng) 每月不定期的對各儀器進(jìn)行抽樣檢查運行使用情況的檢查。 5小型設(shè)備 天平

10、 普通稱量0. 1克的電子天平以及分析天平是實驗室所必需的，要求每年做 一次校正。 真空泵 培養(yǎng)液的配制都用過濾的方法進(jìn)行除菌，一般30升旋轉(zhuǎn)式的真空泵即 可。 酸度計 乂稱為氫離子測定計或pH th是測定各種液體酸堿度的必須工具，要 求每半年做一次校正。 加樣器 加樣器是細(xì)胞培養(yǎng)不可缺少的用具，其規(guī)格有、lO-lOOul. 100-1000ul, 末端可安裝不同容量吸管，吸入和注入液體較方便。使用時吸入的液體量不能在 其設(shè)定范圍之外，而且要求每半年做一次校正。 常用玻璃器皿及器械培養(yǎng)器JHL是供細(xì)胞接種生長等用的器皿，可用透明度好, 中性硬質(zhì)的玻璃制成。另外，還可使用透明、平滑、無毒、干凈并

11、經(jīng)放射性核素 照射滅菌密封包裝的一次性使用塑料培養(yǎng)器皿，其優(yōu)點是打開包裝即可用于培養(yǎng) 操作，缺點是費用較高。目前國內(nèi)一般實驗室使用的還是玻璃器皿。 溶液瓶 其規(guī)格常為500ml. 250ml、100ml的配膠塞的鹽水瓶和配塑料螺旋蓋的 盛液瓶，用于貯存各種試劑等。 調(diào)pH等用；彎頭吸管用 于吹打分散和混懸細(xì)胞用。 離心管 有玻璃和塑料二種，主要用于離心、漂洗和分離細(xì)胞，常用的規(guī)格有 50ml,10ml, 5ml三種規(guī)格，此外還有微量離心管，規(guī)格有，1ml,以供貯 存少量試劑或其它實驗用。 器械主要用于取材和原代培養(yǎng)中切割組織。常用的器械有：組織剪、銀子等。 使用過程中應(yīng)注意保護(hù)刀鋒，用畢擦凈、

12、晾干、以防生銹，消毒以煮、高壓滅菌 或75%酒精浸泡。 其它 如配制溶液的量筒、容量瓶以及試管、高壓消毒用貯槽、鋁飯盒、各種膠 塞、凍存管、鋁制吸管筒、各種試管架、研缽、各種橡皮塞、洗耳球、滴頭、燒 杯、玻棒、各種大小規(guī)格不同的試劑瓶、載玻片、蓋玻片、針頭式塑料抽濾器、 醋酸纖維膜、酸缸、各種泡酸用的耐酸尼龍網(wǎng)袋、銅絲筐、耐酸手套、試劑瓶沖 洗器、記號筆、染色缸、染色架、玻片板、酒精燈。 湘學(xué)家室 學(xué)醫(yī)國驗 大院學(xué)實 南醫(yī)傳點 中雅遺重 作業(yè)指導(dǎo)書 文件編號 版本/修訂號 培養(yǎng)用品的清洗及準(zhǔn)備 發(fā)布日期 實施日期 第二章 培養(yǎng)用品的清洗及準(zhǔn)備 1洗滌液的配制 重輅酸鉀清潔液的配制 配制方法 按

13、比例稱取置于特制的耐酸酸缸內(nèi)（50克重珞酸鉀加1000ml水），加熱使 其溶解，冷卻后再慢慢加入工業(yè)粗硫酸（90ml粗硫酸），注意切不可將水加入硫 酸中，邊加邊攪拌。配好的清潔液為深褐色。 清潔液的配制，可分為強酸溶液與弱酸溶液（見表）可視需要而選用 表清潔液的配方 成分 強酸溶液 弱酸溶液 重鉆酸鉀(g) 120g 50g 濃硫酸(ml) 160ml 90ml 蒸憎水(ml) 1000ml 1000ml 配制清潔液的注意事項: 1. 戴防護(hù)面罩、手套、圍裙等。 2. 如不慎將清潔液灑出，應(yīng)用沙土吸附，用塑料簸箕收起，然后用水沖洗。 3. 配制時切記千萬不要以水加入硫酸，以防大量產(chǎn)熱使容器爆裂

14、而造成事 故。 4. 一定待清潔液冷卻后再放入容器中，以免熱脹冷縮而使容器破裂，造成 事故。 使用硫酸清潔液的注意事項： 1. 硫酸為強吸水性物質(zhì)，故泡酸的器皿一定要晾干，不要帶水太多，這樣 可延長使用時間。 2. 用堿處理過的器皿必須沖洗干凈才可放入清洗細(xì)胞培養(yǎng)專用的酸缸。 3. 硫酸比重大，應(yīng)注意安全，不可單手握裝滿洗滌液的量筒等，以防掉在 地上打破容器。 4. ( 5 如不小心將硫酸濺到眼里，要盡快用水沖，并用眼杯裝3%NaHC03溶液 清洗。 5. 當(dāng)清潔液的顏色發(fā)綠或混濁時，說明使用過久，效力降低，應(yīng)重新配制。 2玻璃器皿的清洗 細(xì)胞培養(yǎng)中，玻璃器皿的清洗是個十分重要的環(huán)節(jié)，清洗后的

15、玻璃器皿不僅 要求干凈透明，無油跡，且不能殘留任何有毒物質(zhì)，一般玻璃器皿的清洗包括刷 洗、浸酸和沖洗三個步驟。 刷洗 將待清洗的玻璃器JII1在洗滌液中煮沸30分鐘后進(jìn)行刷洗，刷洗時應(yīng)注意二 點，一是要選用軟毛毛刷，刷洗時用力要輕，使用多次的毛刷要更換，防止損傷 器皿表面或造成劃痕；二是刷洗時不能留下死角，刷洗后，用自來水徹底沖洗, 稍晾干，浸酸。 浸酸 浸酸是將刷洗和晾干后的玻璃器皿浸泡到山重輅酸鉀、濃硫酸和蒸鐳水配制 的清潔液中，利用強氧化作用清除瓶皿表面可能殘留的有機物，浸泡時一定要使 器皿完全浸入清潔液中，器皿中不能有氣泡，浸泡時間4小時以上。 沖洗 浸酸后的器皿必須用自來水沖洗干凈，

16、沖8-10次后再用一蒸水沖二次，二蒸水沖一次， 整個沖洗過程應(yīng)連續(xù)進(jìn)行。 3膠塞和塑料用品的清洗 膠塞 新購置的膠塞有大量滑石粉應(yīng)先用自來水沖洗干凈后，再作常規(guī)處理。常規(guī) 清洗方法是每次用完的膠塞要置入水中浸泡，然后用洗潔精或2%NaOH煮沸10 分鐘，自來水沖洗晾干后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘到4小時，用自來水沖洗 干凈，最后分別用一蒸水和二蒸水各煮沸兩次，二蒸水沖洗，晾干備用。 塑料用品 塑料用品使用后也要用水浸洗，嚴(yán)防附著物干結(jié)，如殘留有附著物，要即時 用紗布拭掉，用流水沖洗干凈后在2%NaOH溶液中浸泡過夜，自來水沖液，再用 1%稀鹽酸浸泡30分鐘，用自來水沖洗干凈，最后分別用一蒸水

17、和二蒸水沖洗， 晾干備用。 4清洗后物品的包裝 目的 清洗烘干后的培養(yǎng)物品應(yīng)即時包裝，以備消毒滅菌。 物品準(zhǔn)備： 包裝常用牛皮紙、鋁盒，貯槽、專用金屬消毒筒等。 方法： 對于較大的培養(yǎng)用品如溶液瓶、濾器等可用雙層牛皮紙將瓶口緊密包起來, 包好后用線繩扎緊，進(jìn)行局部包裝。 對于小型的培養(yǎng)用品，如培養(yǎng)瓶、圓瓶、離心管、試管、吸管、培養(yǎng)皿、膠 塞等可先裝入鋁盒，貯槽或?qū)Ｓ媒饘傧就病?5培養(yǎng)用品的消毒和滅菌 目的 防止污染、保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。 方法 1、物理滅菌法，包括紫外線、干熱、濕熱（高壓蒸汽），過濾等手段。 2、化學(xué)滅菌法主要指使用化學(xué)消毒劑滅菌。 原理及用途 1、紫外線是一種低能量的電磁

18、輻射，可以殺死多種微生物。 2、干熱滅菌法主要用于玻璃器皿的消毒，溫度180C維持90分鐘，才能殺死 細(xì)菌芽抱，達(dá)到滅菌LI的。 3、干熱滅菌法主要用于玻璃器皿的消毒，溫度180C維持90分鐘，才能殺死 細(xì)菌芽抱，達(dá)到滅菌目的。 4、濕熱滅菌法即高壓蒸汽滅菌，用于布類、膠塞、金屬器械、濾器、玻璃器 皿以及培養(yǎng)用液的滅菌。 5、過濾除菌是將液體用具有微孔的薄膜過濾，大多數(shù)培養(yǎng)用液如人工合成培 養(yǎng)基、血清、酶溶液等，山于在高溫下會發(fā)生變化，而失效，所以必須采取過濾 除菌，常用的濾器有各種不同孔徑的玻璃砂芯濾器。 6、化學(xué)滅菌法主要指化學(xué)消毒劑。化學(xué)消毒法是利用化學(xué)消毒劑消毒那些不 能用物理消毒等方

19、法進(jìn)行消毒的物品和場地，如接種培養(yǎng)室的空間，操作臺面以 及操作者的皮膚。 具體標(biāo)準(zhǔn)及要求 細(xì)胞培養(yǎng)實驗最危險的是發(fā)生包括細(xì)菌、真菌和病毒等微主物的污染，它們都 能直接影響實驗結(jié)果，污染主要產(chǎn)生在操作者的疏忽，如培養(yǎng)室未定期消毒，操 作臺表面或周圍空氣不潔，培養(yǎng)器具消毒滅菌不徹底，或者放的用具時間過長等 因素，因此細(xì)胞培養(yǎng)的每一個環(huán)節(jié)都要高度謹(jǐn)慎，認(rèn)真。 紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺死多種微主物，主要用于培養(yǎng)室內(nèi) 空氣、操作臺面及地面的消毒，掛在離地10尺的高度，使得各地最少每平方尺 有30微瓦特的照射，才能發(fā)揮有效作用。干熱滅菌法主要用于玻璃器皿的消毒， 溫度180C維持90分鐘，才能

20、殺死細(xì)菌芽泡，達(dá)到滅菌LI的。濕熱滅菌法即高 壓蒸汽滅菌，用于布類、膠塞、金屬器械、濾器、玻璃器肌以及培養(yǎng)用液的滅菌， 實驗室一般使用需求配備1-2臺高壓蒸汽滅菌器。培養(yǎng)用液、橡膠制品、濾器一 般10磅15分鐘，布類、玻璃制品、金屬器械等一般15磅20分鐘。過濾除菌是 將液體用具有微孔的薄膜過濾，大多數(shù)培養(yǎng)用液如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶溶 液等，山于在高溫下會發(fā)生變化，而失效，所以必須采取過濾除菌，常用的濾器 有各種不同孔徑的玻璃砂芯濾器。另外還有一次性濾器，品種極多，使用方便, 我室目前主要使用一次性濾器。 化學(xué)滅菌法主要指化學(xué)消毒劑?；瘜W(xué)消毒法是利用化學(xué)消毒劑消毒那些不能 用物理消毒等方法

21、進(jìn)行消毒的物品和場地，如接種培養(yǎng)室的空間，操作臺面以及 操作者的皮膚。化學(xué)制劑包括新潔爾滅、過氧乙酸和酒精等，乳酸可用于接種培 養(yǎng)室內(nèi)和周圍環(huán)境的定期空氣消毒，過氧乙酸消毒能力極強，在%濃度10分鐘可 將芽抱殺滅，可用作各種物品的表面消毒。1%。的新潔爾滅是細(xì)胞培養(yǎng)室常用的， 可用于操作者的皮膚消毒，器械的浸泡，物品的清洗，操作臺面的擦拭等 第三章 常用實驗溶液試劑的配制 湘學(xué)家室 學(xué)醫(yī)國驗 大院學(xué)實 南醫(yī)傳點 中雅遺重 作業(yè)指導(dǎo)書 文件編號 版本/修訂號 發(fā)布日期 實施日期 常用實驗溶液試劑的配置 1目的 規(guī)范試劑的配制，為臨床實驗的可黑性提供質(zhì)量保障。 2原則 專人負(fù)責(zé)，一劑一皿，一配一錄

22、，雙人核簽。定期校對，可溯源。 3性能特征 規(guī)范試劑的配制，為臨床提供準(zhǔn)確穩(wěn)定有效的試劑，減少人為因素對臨床試驗 結(jié)果的影響。 4方法 化學(xué)實驗試劑的配制方法 5試劑與耗材 量筒、燒杯、玻棒、電子稱、量杯、容量瓶、定容瓶、油紙、藥勺、lOOul 加樣槍、lOOul槍頭 6操作步驟 生理鹽水 準(zhǔn)確稱取氯化鈉（NaCl）（生產(chǎn)商xxxx,批號xxxx有效期xxx） g,加：蒸水 溶解定容至1L,待充分溶解混勻裝瓶，貼標(biāo)簽（配置日期、藥品名稱、濃度、 用途、有效期、配制雙人），記錄雙人簽名 0. 075M氯化鉀溶液 氯化鉀（KC1） 5.587g ,加二蒸水至1000ml,室溫保存，用于細(xì)胞低滲處

23、理。 12XSSC溶液 氯化鈉（NaCl） 105. 3g 檸檬酸鈉（NgCO：5比0）52. 94g 加二蒸水至1000ml,室溫保存，臨用時用二蒸水稀釋至所需濃度。 %胰蛋白酶溶液（Trypsin） 胰蛋白酶粉末（1:250） 250mg 無 Ca2*, Mg2*的 PBS 加至 100ml 先用少許消毒的PBS將胰蛋口酶粉末溶解，再補足PBS至100ml,攪拌混勻， 置4C冰箱4小時，用微孔濾膜除菌，分裝成小瓶于-20C保存，用于消化細(xì)胞。 Giemsa染色液 Giemsa儲備液： 配制：Giemsa粉末lg加少許甘油混合研碎一共計加入甘油66ml,充分混勻 f倒入燒杯中在5o-60C水

24、浴中加熱2小時一冷卻一加入屮醇66ml,充分混 合一在室溫中靜置2-3周，過濾貯存于棕色瓶中，可長期使用。 6%Giemsa IE作液：47ml蒸館水中加入Giemsa儲備液3ml,用于染色體標(biāo)本 的染色，一般染色時間為10-20分鐘。 無鈣鎂離子溶液 氯化鈉（N 低滲處理：秋水仙素處理完畢后，小心地從溫箱取出培養(yǎng)瓶，用吸管吸取培養(yǎng)物 入離心管，離心（loOOrpm, 10min）o然后加入37C溫育的L的KC1低滲溶液8ml, 用吸管吹打成細(xì)胞懸液，置37C水浴處理35min； 預(yù)固定：在每個離心管中加入的固定液，繼續(xù)37C水浴，5-10min： 離心：loOOrpm lOmin,棄上清液;

25、 固定：在離心管中加入固定液6-8ml,立即用吸管輕輕吹打，單個細(xì)胞懸液， 在37C水浴中固定5-10min后，離心，loOOrpm, lOmin,棄上清液;再固 定：重復(fù)第6步； 制片：在離心管中滴入新固定液毫升，用吸管將淋巴細(xì)胞團(tuán)輕輕吹打成細(xì)胞懸液, 從冰箱的冷凍室內(nèi)取出冰片，每片滴加懸液1-2滴，75C烤3小時； 染色：用胰酶消化后用Giemsa染液染色（消化時間和染色時間因環(huán)境變化有 差別，因此每次顯帶染色應(yīng)進(jìn)行預(yù)實驗），然后用鑲子夾出玻片，用自來水 輕輕沖洗兩面，室溫干燥或電吹風(fēng)吹干； 鏡檢：待玻片干后，在顯微鏡下檢查。先用低倍鏡尋找良好的分裂相，然后用高 倍油鏡觀察。 9參考范圍

26、染色體數(shù)U： 46,XN ；染色體結(jié)構(gòu)：無明顯結(jié)構(gòu)異常 10潛在變異來源 1）不排除細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生突變的可能性，從而導(dǎo)致染色體數(shù)U或結(jié)構(gòu)改變， 因此應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行1-2線平行操作，以發(fā)現(xiàn)因培養(yǎng)過程導(dǎo)致的結(jié)果異常。 2）接種所用器皿要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理。 3）秋水仙素處理時間過長，分裂細(xì)胞多，染色體短??；反之，則少而細(xì)長。都 不宜觀察形態(tài)及訃數(shù)。故秋水仙素的濃度及時間要準(zhǔn)確掌握。 4）低滲使紅細(xì)胞膜破裂，淋巴細(xì)胞膨脹，低滲處理濃度及時間要適當(dāng)。且低滲 后混勻細(xì)胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。 5）固定液應(yīng)在使用詢臨時配制，要求新鮮，否則將形成脂類，從而影響固定效 果 11環(huán)境安全 1）試

27、劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑，請勿直接接觸皮膚、眼睛、黏膜，一旦接觸，立 即用大量清水沖洗；受檢標(biāo)本均應(yīng)假定含有傳染性病原菌，其廢棄過程應(yīng)遵循實 驗室生物安全管理程序進(jìn)行處理； 2）實驗過程中應(yīng)嚴(yán)格控制環(huán)境及實驗儀器/設(shè)備的溫度、濕度等相關(guān)條件，以確 保實驗條件穩(wěn)定。 中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國家 重點實驗室 作業(yè)指導(dǎo)書 文件編號 版本/修訂號 口血病外周血細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制 備 發(fā)布日期 實施日期 1目的 反映那些病理細(xì)胞的染色體改變，為臨床提供輔助診斷。 2實驗方法 密閉培養(yǎng)/手工收獲。 3實驗原理 在不受外界抗原的刺激下，通過短期培養(yǎng)和直接制片法可以觀察到血液病患 者外周血中的異常腫瘤細(xì)

28、胞的核型。 4性能特征 經(jīng)G顯帶處理后可見300-550條顯帶 5.樣本類型及受檢者準(zhǔn)備 外周血用5ml滅菌注射器吸取注射用肝素(6230U/ml) ml濕潤管壁。消毒 皮膚，于肘靜脈采血約5ml,立即送檢。 6試劑 完全培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基4ml,小牛血清lml,肝素，雙抗：青霉素 和鏈霉素，終濃度為100U/ml,最后用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH為；秋水仙素：濃度20 U g/ml,低滲液：L的KC1溶液，卡諾固定液,% EDTA-trypsin： A液:將的trypsin 溶于100ml的PBS中，B液：另將的EDTA溶于100的PBS中， EDTA-trypsin： A：B二 1：1

29、(V/V)； 10ml 溫育液：1ml % EDTA-trypsin. 9ml mol/LKClo 7試劑與耗材 超凈工作臺、待檢標(biāo)本、酒精燈，燒杯，天平，離心機，恒溫培養(yǎng)箱，冰盒， 載玻片，玻片盒，光學(xué)顯微鏡，滅菌注射器(oml),離心管，無菌吸管，量筒, 培養(yǎng)瓶，試劑瓶等。 8實驗步驟 短期培養(yǎng)法 取血液病患者外周血，1640或Hank s液離心洗脫2次，去除脂肪顆粒，根據(jù) 口細(xì)胞量的多少來確定接種細(xì)胞量，無菌注入裝有5ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，37C 培養(yǎng)24或48小時； 加入秋水仙素(終濃度為)，繼續(xù)培養(yǎng)55分鐘，收獲； 將標(biāo)本移入離心管,loOOrpm離心10min,去上清，加入L的KC

30、1 ,37C低滲30min； 預(yù)固定：加固定液，輕混勻，水浴5分鐘。 固定:加固定液至7ml,輕混勻，1500rpm, lOmin,去上清。 再固定：加固定液至7ml ,輕混勻，15OOrpm, lOmin,去上清。 視細(xì)胞量調(diào)整懸液，滴片，烤片3小時，顯帶。 直接制備法 取1-2毫升血液病患者外周血加入RPMI-1640液或Hank1 s液8毫升混勻離心 loOOrpm, 10分鐘洗脫2次，去除脂肪顆粒。 棄上清，加1毫升% EDTA-trypsin與9毫升M KC1混合液至10毫升吹打混勻； 加秋水仙素（使終濃度為Pg/ml）,混勻； 放至水浴箱，37C低滲30分鐘： 加固定液預(yù)固定，水浴

31、5分鐘，輕混勻； ,室溫，10分鐘，去上清； 加固定液至7毫升，輕混勻； ,室溫，10分鐘，去上清； 重復(fù)固定一次； 視細(xì)胞量調(diào)懸液，滴片，烤片3小時，顯帶。 9潛在變異來源 1）采取標(biāo)本注意抗凝，根據(jù)血象調(diào)整接種密度； 2）直接法主要用于急性白血病 10環(huán)境和安全控制 1）試劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑，請勿直接接觸皮膚、眼晴、黏膜，一旦接觸, 立即用大量清水沖洗； 2）受檢標(biāo)本均應(yīng)假定含有傳染性病原菌，其廢棄過程應(yīng)遵循實驗室生物安 全管理程序進(jìn)行處理； 3）實驗過程中應(yīng)嚴(yán)格控制環(huán)境及實驗儀器/設(shè)備的溫度、濕度等相關(guān)條件， 以確保實驗條件穩(wěn)定。 中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國家 重點實驗室 作業(yè)

32、指導(dǎo)書 文件編號 版本/修訂號 外周血淋巴細(xì)胞建株 發(fā)布日期 實施日期 1目的 規(guī)范外周血淋巴細(xì)胞建株操作過程，通過建立永生化大量增殖的類淋巴母細(xì) 胞系，為保存家族性疾病家系成員特有的基因組資源及臨床研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。 2方法 EB病毒轉(zhuǎn)化 3原理 環(huán)抱霉素（CYA）是一種能在GO-G1期之間選擇性地抑制T淋巴細(xì)胞RNA聚合酶 II的免疫抑制劑，與EBV同時加入時可有效地阻止T淋巴細(xì)胞對EBV的應(yīng)答反 應(yīng)，防止已轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞受T淋巴細(xì)胞攻擊而退化。 病毒一般感染B淋巴細(xì)胞，通過受體CD21進(jìn)入宿主細(xì)胞后可自行環(huán)化以游離體 的形式長期存在于宿主細(xì)胞體內(nèi)，形成潛伏感染。EB病毒潛伏感染人外周血

33、B 淋巴細(xì)胞后可活化B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)靜息期的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為永生化大量增殖的類 淋巴母細(xì)胞系（LCL）o 4實驗性能 轉(zhuǎn)化結(jié)果 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)1周后，倒置顯微鏡下觀察可見聚集的細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞透明發(fā)亮, 體積明顯增大，細(xì)胞外壁有不規(guī)則毛刺狀突起，即為淋巴母細(xì)胞樣B細(xì)胞；3周 后，鏡下可見轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆明顯增多；1個月以后，細(xì)胞增殖旺盛，形成生長密 集的大克隆，標(biāo)志轉(zhuǎn)化成功。 凍存細(xì)胞復(fù)蘇后生長情況 分別于凍存10 d、1個月、3個月后進(jìn)行了復(fù)蘇，所有凍存后的細(xì)胞復(fù)蘇成 功率都為100%,復(fù)蘇后3d即可傳代培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)正常，所有細(xì)胞 株依然保持旺盛的增殖特性，表明成功獲得永生細(xì)胞株。 細(xì)胞生物學(xué)特性

34、 染色體核型分析：采用染色體核型分析技術(shù)比較轉(zhuǎn)化后永生細(xì)胞與來自同個體 新鮮外周血淋巴細(xì)胞染色體的G帶，未發(fā)現(xiàn)有任何變異，表明轉(zhuǎn)化后的B淋巴細(xì) 胞保留了正常的染色體核型，未發(fā)生畸變，即保留了原有細(xì)胞的遺傳特性。 細(xì)胞表型分析：轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞經(jīng)熒光抗體CD3 / CD19o染色，用流式細(xì)胞儀分析， 結(jié)果100%表達(dá)成熟B淋巴細(xì)胞CD19。 5樣本類型及受檢者準(zhǔn)備 在無菌條件下采集靜脈fflL3ml（肝素抗凝，空腹為宜），立即送至實驗室。 6儀器及耗材 離心機，C0：培養(yǎng)箱，離心管（15ml, 50ml）, 10ml吸管，電動槍，大中小 Tip頭及移液槍，25cm:培養(yǎng)瓶，m針式過濾器，10ml注射

35、器，凍存液，凍存 管。 7實驗試劑 1）環(huán)泡霉素：用無血清培養(yǎng)基RPMI-1610配制成200Mg/ml,分裝到小離心管 中凍存于-20 C,有效期2個月。 2）EB病毒：B95-8細(xì)胞常規(guī)接種至25cm培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，放置5-7天不換液 后方可凍存。將細(xì)胞與培養(yǎng)液一起放入一次性的15ml離心管中，直接置 -70 C冰箱保存。使用前將其取岀反復(fù)凍融三次。 3）RPMI-1640培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基：75ml RPMI-1640加25ml FBS,無菌試 驗陰性后方可使用。 4）淋巴細(xì)胞分離液。 5）凍存液的配制:25% FBS 1640 / DMSO =9/1 （V:V）需使用前新鮮配制。 8操作

36、步驟 在離心管中將外周血用無血清RPMI-1640按1:1稀釋，另取一離心管，加入適 量淋巴細(xì)胞分離液，然后用吸管將血液輕輕懸浮于淋巴細(xì)胞分離液上，注意不要 將兩者混和，比例是2:1。 用水平離心機于20-25 C,離心2500rpm, 10分鐘。 用吸管吸取淋巴細(xì)胞層到6-8ml無血清的RPMI-1640中，并輕輕吹打淋巴細(xì)胞。 洗脫：室溫，離心1500rpm, 10分鐘。 再洗脫：去掉上清，加6-8ml無血清的1640重復(fù)步驟（4）。 棄上清，加2ml的25%FBS的完全培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞形成單個淋巴細(xì)胞懸液。 接種于一個25cm培養(yǎng)瓶中。 再加入40 1環(huán)抱霉素和。 側(cè)放在37 C, 5

37、% C0：培養(yǎng)箱中開放式培養(yǎng)。 待三天后觀察，如果細(xì)胞形態(tài)較好，培養(yǎng)基顏色變成金黃色，則細(xì)胞增殖明顯, 可加入 含25%FBS的1640于培養(yǎng)瓶中；如果細(xì)胞形態(tài)不好，瓶底可見一層紅細(xì) 胞，鏡下可見成堆的死細(xì)胞碎片，則需要重新做分離，重新接種培養(yǎng)。 以后每隔2-3天需觀察一次，細(xì)胞處理視情況而定（原則上建株前一段時間宜緩 慢加培養(yǎng)基，并讓其液體保持偏酸性為佳）。 待其培養(yǎng)基液體增加到10-15ml,可選擇半量換液，細(xì)胞密度較大時則需要傳代。 等細(xì)胞長到50ml左右，一般以1X10 消化：將皮膚剪成碎塊，放入裝有30-50倍組織量的 EDTA-trypsin的離心管 中，37C下消化10-15mi

38、n后加含血清培養(yǎng)基終止消化； 將離心管中的組織溶液1500rpm點離； 取上清離心，loOOrpm, lOmin： 去上清，加入含血清培養(yǎng)基5ml, 37C 5%C02培養(yǎng)箱中行開放式培養(yǎng)。 貼壁法 將經(jīng)消化法點離后的組織沉淀移入25cm2培養(yǎng)瓶中，均勻平鋪于培養(yǎng)瓶的細(xì) 胞貼壁面,于對側(cè)瓶壁加入皮膚培養(yǎng)基（pH為），37C培養(yǎng)6小時或過夜，待組 織貼壁牢固后，即可輕輕翻瓶，使組織塊浸泡在培養(yǎng)基中，37C,5%C02培養(yǎng) 箱中行開放式培養(yǎng)。 細(xì)胞培養(yǎng)及制片 7. 3.1 37C5%C02 放培養(yǎng)，每天觀察，一般3-4天可見成纖維細(xì)胞呈梭形生 長。根據(jù)生長情況換液。一般培養(yǎng)10-15天，待細(xì)胞生長

39、旺盛時，按下列 程序處理： 加入秋水仙素，約4-6小時行細(xì)胞學(xué)處理； 將培養(yǎng)液倒入離心管中，加入PBS或生理鹽水2-3毫升，洗凈完全培養(yǎng)基， 加%EDTA-trypsin約2ml消化3-5min,含血清培養(yǎng)基終止消化。置離心管中離心， 1500rpm , lOmin； 低滲：加入KC1 4-6ml,吸管吹打，37C水浴5-10min（或0. 4%檸檬酸鈉1:1 作為低滲液，每管8ml,低滲lOmin）； 預(yù)固定：加入：1（甲醇：冰醋酸）固定液,輕混勻37C水浴5min,離心,1500rpm, lOmin； 固定：加入3:1 （甲醇：冰酷酸）固定液8ml左右，輕混勻，37C水浴lOmin： 室溫

40、15OOrpm離心lOmin,去上清，約留； 重復(fù)固定：同笫6步； 離心，loOOrpm, lOmin,去上清； 視管底細(xì)胞量適當(dāng)加入兒滴新鮮固定液； 滴片:每片1-2滴; 烤片：75C烤箱烘烤3小時； 第二天行顯帶處理，G顯帶。 8注意事項 取材消毒用酒精應(yīng)揮發(fā)干凈，取材一定要取帶有生發(fā)層細(xì)胞，是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。 在用 EDTA-trypsin消化之前盡量將瓶壁血清洗凈，更有利于快速消化，消化 時間要把握準(zhǔn)確，太長對細(xì)胞損傷較大，細(xì)胞生長狀態(tài)不好，太短組織塊消化不 充分，難以獲得大量細(xì)胞。 用過量沖洗標(biāo)本并嚴(yán)格無菌操作，最后維持雙抗?jié)舛炔荒艹^lOOU/mlo 中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)

41、國家 作業(yè)指導(dǎo)書 文件編號 版本/修訂號 實體瘤細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備 發(fā)布日期 重點實驗室 實施日期 1目的 規(guī)范實體瘤細(xì)胞培養(yǎng)與染色體制備過程，為臨床實體瘤細(xì)胞染色體核型分析 可靠性提供質(zhì)量保證。 2測定方法 C02培養(yǎng)/手工收獲 3測定原理 患者外周血培養(yǎng)細(xì)胞主要說明全身染色體狀況，而不能說明腫瘤標(biāo)本的染色 體改變，因此通過對實體瘤細(xì)胞培養(yǎng)可獲得大量的腫瘤細(xì)胞，再用秋水仙素處理 就可獲得大量中期分裂相的細(xì)胞，制片后可以清楚地對染色體進(jìn)行觀察。 4性能特征 經(jīng)G顯帶處理后可見300-550條顯帶。 5儀器與耗材 酒精燈，燒杯，天平，離心機，恒溫培養(yǎng)箱，冰盒，載玻片，玻片盒，光學(xué) 顯微鏡，滅菌

42、注射器（5ml）,離心管，無菌吸管，量筒，培養(yǎng)瓶，試劑瓶，眼科 鑲，眼科剪，牙科探針，一次性平皿等。 6試劑 100ml DMEM含10%血清培養(yǎng)基 RPMI-1640含10%血清培養(yǎng)基 秋水仙素濃度：20 u g/ml 低滲液：L的KC1溶液 卡諾固定液 6. 6 % EDTA-trypsin 生理鹽水 膠原酶IVlmg / lmlDMEM 7操作步驟 短期培養(yǎng)法 取腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞分布較多的部分。 在無菌條件下，將腫瘤組織放入玻璃平皿中，用含400U/ml雙抗的生理鹽水反復(fù) 沖洗腫瘤組織2-3次以去除血液，然后吸凈生理鹽水。 在一次性平皿中用眼科手術(shù)剪將組織剪成l-2mm3小塊，放入裝有

43、25 ml組織消 化液的50ml 一次性離心管中。 消化：空氣搖床,200rpm, 37C 20-40min 將50ml 次性離心管中的組織溶液裝入離心管，離心，lOOOrpm, lOmin。去上 清，加入20ml PBS,打勻。 離心，lOOOrpm, lOmino 去上清，加入20 ml PBS,打勻。 細(xì)胞計數(shù)后以106/25接種。 5%C02開放培養(yǎng)，每天觀察，一般3天可見腫瘤細(xì)胞生長。根據(jù)生長惜況每隔3 天換液一次。一般培養(yǎng)6天，待細(xì)胞生長旺盛時，按下列程序處理： 1）加入秋水仙素（終濃度），約4-6小時左右。 2）將培養(yǎng)液倒入離心管中，加入PBS或生理鹽水2-3毫升，洗凈含血清培養(yǎng)

44、基, 加 EDTA-trypsin約2ml消化3-5min,含血清培養(yǎng)基終止消化。置離心管中離 心，loOOrpm , lOmino 3）低滲：加入KC1 4-6ml,吸管吹打，37C水浴10-30min。 4）預(yù)固定:加入約固定劑,輕混勻37C水浴5min,離心,1500rpm, 10min 5）固定：加入固定劑8ml左右，輕混勻，37C水浴15min。 6）室溫1500rpm離心10min,去上清，約留。 7）重復(fù)固定：同第5步。 8）離心,loOOrpm, 10min,去上清。 9）視管底細(xì)胞量適、勺加入兒滴新鮮固定劑。 10）滴片：每片1-2滴。75C烤箱烤片3小時，第二天行顯帶處理。

45、 直接制片法 取腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞分布較多的部分。 在無菌條件下，將腫瘤組織放入一次性平皿，用含400U/ml雙抗的生理鹽水反復(fù) 沖洗腫瘤組織2-3次以去除血液，然后吸凈生理鹽水。 在一次性平皿中用眼科手術(shù)剪將組織剪碎，吸至裝有10ml37C溫育的 DMEM培養(yǎng)液和秋水仙素（終濃度為lPg/ml培養(yǎng)液）的離心管中，置37C水浴 60min,在此時內(nèi)每6-8min用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞，以使細(xì)胞間相互充分解離。 離心，1500rpm, lOmin,去上清,加入KC1 4-6ml,吸管吹打，37C水浴lOmin。 重復(fù)步驟4 預(yù)固定：在每個離心管中加入的固定液，繼續(xù)37C水浴，5 min。 離心:lo

46、OOrpm,離心lOmin,棄上清液。 固定：在離心管中加入固定液6-8ml,立即用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，在室溫 中固定15min后，離心，loOOrpm, lOmin,棄上清液。 重復(fù)固定：同笫8步操作。 離心，loOOrpm, lOmin,去上清. 視管底細(xì)胞量適當(dāng)加入兒滴新鮮固定劑。 滴片：每片1-2滴，75C烤箱烤片3小時，第二天行顯帶處理。 針刺取材法（用于各種淋巴瘤） 在無菌的條件下，用10ml注射器穿入淋巴組織或淋巴后抽吸。 將每lml抽吸物注入一瓶RPMI-1640含血清培養(yǎng)基中。 細(xì)胞培養(yǎng)：直立于5%C02, 37C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14-48小時。 秋水仙素處理：培養(yǎng)終止詢在培

47、養(yǎng)基中加入濃度為20 P g/ml的秋水仙素，使最 終濃度為，置5%C02, 37C培養(yǎng)箱中處理2-4小時。 低滲處理：秋水仙素處理完畢后，小心地從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，用吸管吸取培養(yǎng) 物入離心管，離心(loOOrpm, 10min)o然后加入溫育的低滲液8ml,用吸管輕 輕吹打成細(xì)胞懸液，置37C水浴處理20-30mino 預(yù)固定：在每個離心管中加入的固定液，繼續(xù)37C水浴，5 min。 離心：loOOrpm, lOmin,棄上清液。 固定：在離心管中加入固定液6-8ml,立即用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，在室溫 中固定15min后,離心，1500rpm, lOmin,棄上清液。 再固定：同第8步。

48、 視管底細(xì)胞量適當(dāng)加入兒滴新鮮固定劑。 滴片：每片1-2滴，75C烤箱烤片3小時，第二天行顯帶處理。 胸腹水惡性細(xì)胞染色體的制作 在無菌的條件下，取新鮮的胸腹水10ml,離心，lOOOrpm, lOmin,棄上清液。 在離心管中加入10ml37C溫育的1640完全培養(yǎng)液和秋水仙素(終濃度為Mg/ml 培養(yǎng)液)，置37C水浴60-90min 離心，1500rpm, lOmin,去上清，加入KC1 4-6ml,吸管吹打,37C水浴3-5min。 預(yù)固定：在每個離心管中加入的固定液，繼續(xù)37C水浴 不5 mine 離心1500rpm,離心lOmin,棄上清液。 固定：在離心管中加入固定液6-8ml,

49、立即用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，在室溫 中固定15min后,離心，1500rpm, lOmin,棄上清液。 8注意事項 取腫瘤組織時要盡可能取腫瘤細(xì)胞分布較多的部分，避開壞死液化部分，但 有些復(fù)發(fā)性、浸潤性較強的腫瘤較難取到較為純凈的瘤體組織，其腫瘤組織與結(jié) 締組織混雜在一起，培養(yǎng)后有很多纖維細(xì)胞生長，給以后的培養(yǎng)純化增加困難。 9臨床意義 隨著細(xì)胞遺傳學(xué)在腫瘤研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，越來越多的惡性腫瘤認(rèn)為與遺 傳因素有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)人類惡性腫瘤常伴有染色體數(shù)口和結(jié)構(gòu)的異常。意味 著染色體畸變與細(xì)胞癌變之間確有某種聯(lián)系。 第五章各種顯帶技術(shù) 中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國家 重點實驗室 作業(yè)指導(dǎo)

50、書 文件編號 版本/修訂號 G式顯帶法 發(fā)布日期 實施日期 1目的 獲得染色體的分裂相，從而對染色體進(jìn)行核型分析。 2實驗方法 手工顯帶法 3實驗原理 G顯帶是最常用的顯帶方法，染色體經(jīng)胰蛋口酶處理后，然后用一種能結(jié)合 DNA的化學(xué)染料Giemsa染色，使染色體呈深淺不同的帶型，人類的24種染色體 可顯示出各自特異的帶紋。 4性能特征 各條染色體經(jīng)G顯帶后，呈現(xiàn)深淺不同的帶型。 5儀器與耗材 光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、立式染色缸、染色體玻片標(biāo)本（75C中烤片3 小時，未經(jīng)染色） 6試劑 生理鹽水或pH為的1/15M磷酸緩沖液，胰蛋白酶：用生理鹽水配成%的貯存液，冰凍 保存,Giemsa染液。 7

51、操作程序 制片 常規(guī)外周血法制備的標(biāo)本。 G顯帶 將50ml生理鹽水溶液或pH為的1/15M磷酸緩沖液倒入立式染色缸內(nèi)。 取%胰蛋口酶溶液1 ml加入lOOmlpH為的1/13M磷酸緩沖液中）。 將配制好的胰蛋口酶溶液置37C水浴箱中預(yù)熱5分鐘。 取染色體標(biāo)本片，置入胰蛋白酶溶液中，輕輕搖動60180秒。立即在生理鹽 水中漂洗兩次。 以Giemsa染色510分鐘（37C）后，用自來水沖洗、晾干。 鏡檢判斷顯帶效果，在低倍鏡下選擇分散良好，長度適中的分裂相，再轉(zhuǎn)至油 鏡下觀察。若染色體邊緣發(fā)毛，為顯帶過度；若染色體未出現(xiàn)帶紋，則為顯帶不 足。這時應(yīng)根據(jù)具體情況再試一張標(biāo)本片，適當(dāng)增減胰蛋口酶處理

52、的時間，直到 滿意為止。 8顯帶觀察。 9參考范圍 染色體數(shù)U： 46,XN。染色體結(jié)構(gòu)：無明顯結(jié)構(gòu)異常。 10潛在變異來源 玻片完全干后，才可置油鏡下進(jìn)行觀察。 每次顯帶均應(yīng)做預(yù)實驗處理，以決定正確的顯帶時間，不可盲U處理所有玻片。 顯帶效果的判斷，應(yīng)多觀察兒個長度適中的分裂相，不能僅憑1-2個分裂相的顯 帶效果決定下一步顯帶時間。 11環(huán)境和安全控制 試劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑，請勿直接接觸皮膚、眼睛、黏膜，一旦接觸，立即 用大量清水沖洗。 受檢標(biāo)本均應(yīng)假定含有傳染性病原菌，其廢棄過程應(yīng)遵循實驗室生物安全管理 程序進(jìn)行處理。 實驗過程中應(yīng)嚴(yán)格控制環(huán)境及實驗儀器/設(shè)備的溫度、濕度等相關(guān)條件，以

53、確保 實驗條件穩(wěn)定。 中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國家 重點實驗室 作業(yè)指導(dǎo)書 文件編號 版本/修訂號 G-U式顯帶法 發(fā)布日期 實施日期 1目的 用于9號染色體次縊痕多態(tài)分析、家系調(diào)查，親子鑒定等研究以及9號染色 體倒位的細(xì)胞遺傳學(xué)分析。 2實驗方法 手工顯帶法 3實驗原理 G11式顯帶是一種特異性顯示9號染色體次縊痕的顯帶方法，一般用于9號 染色體次縊痕多態(tài)分析、家系調(diào)查，親子鑒定等研究以及9號染色體倒位的細(xì)胞 遺傳學(xué)分析。 4性能特征 顯帶處理后可見特異性的9號次縊痕。 5儀器與耗材 光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、染色缸、吸管、計時器、PH試紙或PH計。 6試劑 蒸憎水、氫氧化鈉、Giems

54、a染液。 7操作程序 制片 常規(guī)外周血法制備的標(biāo)本。 G11顯帶 3ml Giemsa原液中加入蒸憾水47ml,混勻，用氫氧化鈉調(diào)PH至11。 將染色體玻片放入其中染色5分鐘左右。 自來水沖洗，干燥。 鏡檢 觀察可見9號染色體次縊痕成紫紅色。 9參考范圍 9號長臂次縊痕顯紫色。 10注意事項 染色體玻片片齡一般不要超過一周，且在顯帶之前最好再次75C烤片5分鐘。 pH值為11是顯帶成功的關(guān)鍵 染色時間可先摸索，如整個背景為藍(lán)色、次縊痕未出現(xiàn)，可相應(yīng)地延長染色時間； 如整個背景為紫紅色、次縊痕不明顯則可相應(yīng)地縮短染色時間。 11環(huán)境和安全控制 試劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑，請勿直接接觸皮膚、眼睛、黏

55、膜，一旦接觸，立即 用大量清水沖洗。 受檢標(biāo)本均應(yīng)假定含有傳染性病原菌，其廢棄過程應(yīng)遵循實驗室生物安全管理 程序進(jìn)行處理。 實驗過程中應(yīng)嚴(yán)格控制環(huán)境及實驗儀器/設(shè)備的溫度、濕度等相關(guān)條件，以確保 實驗條件穩(wěn)定。 中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國家 重點實驗室 作業(yè)指導(dǎo)書 文件編號 版本/修訂號 R顯帶法 發(fā)布日期 實施日期 1目的 R顯帶與G顯帶相反，可顯示與G顯帶正好相反的帶紋，R顯帶技術(shù)有利于檢 測染色體的末端缺失、重排等。 2測定方法 手工顯帶，該方法溯源至醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實驗室工作手冊。 3性能特征 R顯帶技術(shù)有利于檢測染色體的末端缺失、重排等。 4實驗原理 R顯帶與G顯帶相反，染色體經(jīng)過熱

56、鹽處理,使富含AT的DNA變性，用Giemsa 染色，則可顯示與G顯帶正好相反的帶紋，即G顯帶的深帶變?yōu)闇\帶，淺帶染成 深帶。當(dāng)G顯帶顯示的染色體兩臂末端為淺帶時，如果兩臂末端發(fā)生缺失等異常, 一般難以發(fā)現(xiàn)和識別，而R帶正好能將此處顯示岀易于識別的深帶。所以，R顯 帶技術(shù)有利于檢測染色體的末端缺失、重排等。 5樣本類型及受檢者準(zhǔn)備 在無菌條件病人外周血于注射器或肝素鈉管中，約抽5-15ml,立即送檢。 6實驗用品 光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、紫外燈、培養(yǎng)皿、常規(guī)制片材料、BrdU、秋水仙 素、2XSSC溶液（L NaCl+L檸檬酸鈉）、Giemsa染液等。 7實驗方法 常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，終止前10小時

57、在培養(yǎng)基中加BrdU（使其終濃度為12Mg/ml）； 1）繼續(xù)培養(yǎng)6小時后加20Mg/ml的秋水仙素3滴（7號針頭垂直豎滴，使終濃 度為）； 2）常規(guī)收獲、處理細(xì)胞，制片； 3）在60C恒溫水浴箱中，置一培養(yǎng)皿于水面上（皿內(nèi)加1/3 2XSSC溶液，將 所制玻片浸泡在內(nèi)）。距玻片10cn）處放置一 20瓦紫外燈，照射玻片30-45 分鐘； 4）待紫外處理時間結(jié)束后，用自來水沖凈； 5）Giemsa染色5分鐘，自來水沖凈，室溫干燥后于鏡下觀察。 8顯帶觀察 可見染色體呈深、淺相間的條紋，與G帶相反。若為女性標(biāo)本，還可見淡染 的遲復(fù)制X O 9潛在變異來源 1）玻片完全干后，才可置油鏡下進(jìn)行觀察。

58、 2）每次顯帶均應(yīng)做預(yù)實驗處理，以決定正確的顯帶時間，不可盲U處理所 有玻片。 10環(huán)境和安全控制 1）試劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑，請勿直接接觸皮膚、眼睛、黏膜，一旦接觸， 立即用大量清水沖洗；受檢標(biāo)本均應(yīng)假定含有傳染性病原菌，其廢棄過程應(yīng) 遵循實驗室生物安全管理程序進(jìn)行處理； 2）實驗過程中應(yīng)嚴(yán)格控制環(huán)境及實驗儀器/設(shè)備的溫度、濕度等相關(guān)條件， 以確保實驗條件穩(wěn)定。 中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國家 重點實驗室 作業(yè)指導(dǎo)書 文件編號 版本/修訂號 R顯帶法 發(fā)布日期 實施日期 1目的 規(guī)范C顯帶的實驗室操作流程，顯示中期染色體上結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)區(qū)域，為細(xì)胞染色體 核型分析可靠性提供質(zhì)量保證。 4

59、實驗方法 手工顯帶法 5實驗原理 C顯帶技術(shù)由Arrighi和Hsu于1971年發(fā)明，是顯帶技術(shù)中最簡單的一種帶型。其方法 起源于原位雜交oArrighi和Hsu發(fā)現(xiàn)用堿處理載玻片上的染色體使DNA變性之后，再在SSC 溶液中、65C的條件下使苴復(fù)性，在受控制的條件下經(jīng)Giemsa染色可顯示出在染色體的一 定部位是深染的。70年代用原位雜交的方法證明深染的區(qū)域（C帶區(qū)）是結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)的區(qū) 域，也就是一般而言的DNA高度重復(fù)序列的區(qū)域。然而，現(xiàn)在更為流行的看法認(rèn)為氫氧化領(lǐng) 或其它堿性物質(zhì)的處理是優(yōu)先提取了非C帶區(qū)的DNA,（圖7-3） SSC的處理有助于帶型的淸 晰。 4性能特征 染色體的著絲粒

60、區(qū)域及異染色質(zhì)部位，次縊痕部位及Y染色體長臂深染。 5儀器與耗材 光學(xué)顯微鏡，恒溫水浴箱，培養(yǎng)皿，1ml注射器，擦鏡紙，小鑲子，未染色 的染色體標(biāo)本片（片齡一周以內(nèi)）。 6試劑 1-5%氫氧化釵溶液,2XSSC液，L HC1, PBS, Giemsa染液。 7操作程序 制片 常規(guī)外周血法制備的標(biāo)本。 C顯帶 氫氧化領(lǐng)處理：將標(biāo)本浸入60C的1-5% （飽和）氫氧化鈔!液中，10秒至兒分 鐘（隨氣溫和標(biāo)本齡而變動，常規(guī)：1-4分鐘；1月片齡：8-16分鐘，最好設(shè)置 梯度），堿性處理可能通過產(chǎn)生一個高水平的DA變性，促進(jìn)繼發(fā)的DA溶解。 7. 2.2 2XSSC處理：在60C的2XSSC液中處理9