激光共聚焦顯微鏡技術(shù)1_百度文庫講解

1、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)The tech niq ues and applicati ons of Con focal Laser Scanning Microscopy激光共聚焦顯微鏡（LSCM的發(fā)展簡史1957年，Marvi n Min sky提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理，獲得了美 國的專利。1978年，阿姆斯特丹大學(xué)的G J .Brake nhoff首次展示了改善了分辨率 的共焦顯微鏡。1985年，Wijnaendtsvan Resand推出了第一臺對熒光標(biāo)記的材料 進(jìn)行光切的共焦顯微鏡 激光共聚焦顯微鏡（LSCM的發(fā)展簡史? 80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦顯微鏡 ,英國的

2、Bio-Rad公司的MRC系列，德國Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。?近二十年來，從濾片型到光譜型，人們對共焦高分辨率，采集圖像快速，技 術(shù)的改進(jìn)及應(yīng)用開發(fā)不斷進(jìn)行，出現(xiàn)了很多新的技術(shù)。如雙光子，F(xiàn)CS,FLIM ,STED 等。共焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25 ym電子顯微鏡分辨率：0.2 nm共焦顯微鏡分辨率：0.18 卩:共焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)?電子顯微鏡的缺陷:1.只能觀察固定樣品2. 樣品制備過程（固定、包埋、切片）造成的假象?熒光顯微鏡的缺陷1. 可以觀察活細(xì)胞或組織，但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊。2. 熒光具有強(qiáng)散射性，造成圖像實(shí)

3、際清晰度的大大下降。3. 熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。4. 如果熒光濾片選配不當(dāng)，多熒光標(biāo)記樣品圖像的采集很困難，且很難抑制光 譜交叉。共焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)?共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1. 抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)?共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別3增加側(cè)向分辨率conven ti on al con focalShirky J Wright al.AWide fieldCoverslip Spcomefi激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)Fluoresce nt Micros

4、cope vs con focal激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)掃描方式激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)原理小結(jié)：Confocal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照 明和點(diǎn)探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點(diǎn) 上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測針孔內(nèi)，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻 擋。照明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測點(diǎn)即為 共焦點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面即為共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測點(diǎn)顯示 在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上 掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只

5、要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨 著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn)：1. 點(diǎn)照明。2. 具有照明pinhole和探測pinhole。3. 照明pinhole和探測pinhole共軛（共焦,共焦點(diǎn)即被探測點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的 平面為共焦平面。4. 具有掃描系統(tǒng)一一逐點(diǎn)掃描成像。5. 具有多個（五個）熒光通道，可同時探測多個被標(biāo)記物6. 使用AOTF(Acousto-Optical Tunable Filter進(jìn)行激光波長和強(qiáng)度的選擇，并以 極超快速控制激光開和關(guān)，從

6、而實(shí)現(xiàn)任意形狀感興趣區(qū)域掃描的功能 ，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時 快速檢測。7. AOBS(Acousto-Optical Beam Splitter：更好的減少了激發(fā)光對發(fā)射熒光的干 擾。8. 光譜檢測器：任意選擇接受光譜的波長和帶寬。AOBS(Acousto-Optical Beam SplitterAOBS的作用?特定波長的激發(fā)光經(jīng)過AOBS后發(fā)生偏轉(zhuǎn)進(jìn)入光路?樣品產(chǎn)生的熒光直接通過 AOBS到達(dá)檢測器，而反射回來的激發(fā)光經(jīng)過 AOBS后發(fā)生偏轉(zhuǎn)不能到達(dá)檢測器。?優(yōu)點(diǎn)：與傳統(tǒng)的二色光分光鏡相比，增大了熒光的接受率。?更好的阻止了激發(fā)光對發(fā)射熒光的干擾。光譜檢測器棱鏡分光，光譜檢測激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)?

7、分辨率1. 光學(xué)分辨率只與物鏡的數(shù)值孔徑NA和檢測波長有關(guān)xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x傳統(tǒng)顯微鏡：Rxy=0.61入/NA( 0.25卩mCon focal: Rxy=0.4入 /(NA18 卩 m2. 采樣分辨率固定物鏡倍率下，Zoom相同時，無論采樣密度大小，采樣面積是固定的。理論上，固定面積下，采樣密度越高，即采樣點(diǎn)越多，圖像越細(xì)膩。但是，采樣密度越高，掃描一幅圖像的速度越慢，熒光強(qiáng)度越低，樣品也越容易被 淬滅。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)?圖像亮度1. 與物鏡NA有關(guān)。物鏡鏡像亮度與數(shù)值孔徑的平方呈正比，與總放大率的 平方呈反比。L = NA2/ M2 , NA大小相同，倍率越高，鏡像亮

8、度越低2. 與 pinhole 大小有關(guān)。 M 2 = ( M1 MK2 2Pi nhole大小的選擇理論上，最佳 Pinhole = Airy Disk = 1實(shí)際上，應(yīng)根據(jù)樣品標(biāo)記的實(shí)際情況來選擇Pi nhole的大小3. 與激發(fā)光強(qiáng)度有關(guān)4. 與接受發(fā)射熒光波長的帶寬有關(guān)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)?光切厚度和光切步距光學(xué)切片厚度取決于：物鏡的NA、針孔大小、發(fā)射波長等光學(xué)切片厚度二光切步距(Step Size(0.88 入 em? dz= 22 ( n? V2 Ph NA n-(n -NA 21/2Z軸的最小移動步距：40nm, 15 nm, 3 nm理論Z軸分辨率：dz=0.35 ym激光

9、掃描共焦顯微鏡技術(shù)?樣品的最大厚度：大約1- 2mm(10X/0.4物鏡取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離激光的穿透力、樣品的透明度Z軸的最大移動范圍(SP2 166卩m Z-wide,8mm(sp5 500/1500y1mmm/2mm,15 nm stepsize在觀察較厚的樣品，如腦片時，應(yīng)該選用怎樣的物鏡?激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)?技術(shù)指標(biāo)（Leica TCS :1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x傳統(tǒng)顯微鏡：Rxy=0.61入/NA（ 0.25卩mCon focal: Rxy=0.4 入 /NA18 卩 m2. 樣品的最大厚度：物鏡取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離激光的穿透力、樣品的

10、透明度Z軸的最大移動范圍（166卩m Z-wide 8mm sp2（500um/1500um/3nm , Z-wide 13mm Sp540n m,SP23. 樣品的最小光切厚度：（載物臺最小移動距離為 取決于:物鏡的NA、針孔大小、發(fā)射波長等Z軸的最小移動步距：40nmZ軸的分辨率：0.35 ym激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)? Pin hole （探測針孔）大小影響：1圖像的亮度2光學(xué)切片的厚度? Pinhole大小的選擇理論上，最佳 Pinhole = Airy Disk = 1實(shí)際上，應(yīng)根據(jù)樣品標(biāo)記的實(shí)際情況來選擇 Ph的大小。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)4. 激光器Ar 激光器:458nm, 47

11、6nm, 488nm, 514nmGreNe : 543nm; HeNe: 633nmAr 激光器（UV: 351 nm, 361 nm固體激光器：561 nm,405nm?激光器的特點(diǎn)：1方向性好：激光基本延直線傳播2單色性好:?入=10nm3高亮度：激光方向性好，其在空間上的能量分布是高度 集中的4偏振性:激光為平面偏振光，光纖耦合。5光譜的不連續(xù)性。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)5. 五個熒光通道，一個透射光通道即除了可同時采集多標(biāo)記熒光圖像外還可以同時采集透射光圖像，但透射光圖像為非共焦圖像。注：對未標(biāo)記的標(biāo)本，可采集反射光圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)?掃描速度：CONVENTIONAL 28

12、00 lines/s 512 ? 512 5/S Resonant 16000 lines/s 51251225/S ?掃描密度：64? 64128? 128512? 512, 512? 64, 512? 321024? 10242048? 2048 SP5 8192? 8192 4096 ? 4096? 掃描方式： xyz, xyt, xzt, xt, xyzt, xy 入,x 入,xz 入,xzy, xyz 入，激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)?共焦顯微鏡的類型：1點(diǎn)（慢掃描共焦顯微鏡：分辨率高，圖像清晰；噪音低；采集圖像速度慢；目鏡中觀察不到共焦圖像2.線（狹縫掃描共焦顯微鏡（video rate

13、分辨率低；噪音 高；掃描速度快240幅/秒;目鏡中可觀察到共焦圖像3.Nipkov轉(zhuǎn)盤式掃描共焦顯微 鏡 性能介于上述兩者之間 Spinning disk con focal Spinning disk con focal Spinning disk confocal 每個視場約1000個激光點(diǎn)，總計(jì)約20000個針孔（針孔尺寸固定在50卩m適合100x/1.4油鏡針孔間的空隙可避免信號相互干擾約有70%的激發(fā)光到達(dá)樣品I盤轉(zhuǎn)速1500到10000轉(zhuǎn)/秒，成像速度300到2000幀/秒f激發(fā)光譜400-650nm檢測光譜420-兀血山Spiling disk conibcal采用雙轉(zhuǎn)盤，微透鏡

14、EM CCD作為探測器采樣速度快，3oo 20優(yōu)氐 適合于記錄活細(xì)胞樣品的快速變化 沒有電子放大，不適合觀察細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)。發(fā)射波長使用濾片選擇。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用 The application of激光掃描共焦顯微鏡技 術(shù)的應(yīng)用 Confocal Laser ScannmgMicroscopy Confocal 基本應(yīng)用FRET、FRAP和FLIP應(yīng)用 與Con focal相關(guān)技術(shù)的進(jìn)展 激光掃描共焦顯微鏡 技術(shù)的應(yīng)用 功能. 1.多重?zé)晒鈽?biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT真正的三維重組4.假三維圖的顯示5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz

15、平 面）方向進(jìn)行光切6.定量分析7.時間序列掃描：xyt、xyzt和xt掃描8.圖像處理9.旋轉(zhuǎn)掃描10感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描-光譜拆分熒光強(qiáng)度的測量 熒光強(qiáng)度=熒光效率乂激發(fā)光強(qiáng)度測量原理（Boehm 1861 1-1叫Cl-10-kcd =I0Q（1- lilted10：激發(fā)光強(qiáng)度；I:發(fā)射光強(qiáng)度Q：熒光量子產(chǎn)率，對于特定熒光物質(zhì)，該值為常數(shù)。當(dāng)c較小時，I C 若用計(jì)算機(jī)采集熒光圖像，計(jì)算機(jī)灰度級可直接代表熒光強(qiáng)度。旋轉(zhuǎn)掃描 除用于xy平面旋轉(zhuǎn)以調(diào)整樣品的方位之外，主要用于xt線掃描方式。由于只沿x方向掃描一條線（相當(dāng)與在x方向的 512個點(diǎn)，已經(jīng)丟失了很多空間信息，如果這時所被掃

16、描的細(xì)胞長軸與x方向不一致，將更進(jìn)一步丟失空間信息。為此，需進(jìn)行旋轉(zhuǎn)掃描，旋轉(zhuǎn)掃描即可以使掃描方向旋轉(zhuǎn)到與細(xì)胞長軸一致，然后沿細(xì)胞長軸方向進(jìn)行掃描。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用感興趣區(qū)域掃描一般情況下，激光掃描共焦顯微鏡系統(tǒng)掃描的區(qū)域形狀通常是固定的方形或長方形，如果x方向和y方向的采樣點(diǎn)數(shù)相同，如：512512, 256256，128X128,則掃描區(qū)域的形 狀為方形。如果x方向和y方向的 采樣點(diǎn)數(shù)不同，如：5120 4,則掃描區(qū)域的形狀為長方形。而感興趣區(qū)域掃描是使用者可以根據(jù)實(shí)際情況，用鼠標(biāo)勾畫任意形狀感興趣的區(qū)域進(jìn)行掃描。感興趣區(qū)域掃描還可以用于熒光漂白恢復(fù)測量及熒光能量共振轉(zhuǎn)移時淬滅區(qū)域的選擇。 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用光譜拆分如果兩種熒光標(biāo)記物光