激光掃描共焦顯微鏡2講解

1、激光掃描共焦顯微鏡技術的應用Confocal主要應用特點：形態(tài)學觀察與檢測：亞細胞器定位，如最簡單的核定位二維定位、定量三維定位、圖像重組生理學測量：動態(tài)測量：實時檢測靜態(tài)測量：活細胞或組織內游離 Ca2+分布和濃度的變化測量（Mg2+、Zn+、Na+、K+）（動態(tài) /靜態(tài)）律自由基的檢測（動態(tài)/靜態(tài)）*藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量療蛋白質的轉位（動態(tài)/靜態(tài)）激光掃描共焦顯微鏡技術的應用活細胞內H+濃度（pH值）的測量（動態(tài)/靜態(tài)）線粒體膜電位的測量（動態(tài) /靜態(tài)）光譜測量蛋白質功能檢測熒光漂白恢復（FRAP ）的測量和FLIP熒光能量共振轉移（FRET）的測量（動態(tài)/靜態(tài)）光活化和

2、光轉化檢測其他應用激光掃描共焦顯微鏡技術的應用一、形態(tài)學觀察與檢測免疫熒光標記（單標、雙標或三標）女口：細胞膜受體、某種蛋白或酶的分布與表達，細胞骨架的分布、兩種或三種蛋白的共存與 共定位、蛋白與亞細胞器的共定位、核轉錄因子轉位、細胞的增值、分化細胞凋亡：AnnexinV-fitc + PI末端原位雜交-fitc + PI8-氧脫氧鳥苷激光掃描共焦顯微鏡 技術的應用熒光原位雜交：染色體基因定位單細胞凝膠電泳GFP融合蛋白的表達蛋白的核轉位熒光標記1）細胞表面抗原、胞內某種蛋白免疫熒光標記：與抗體耦聯(lián)，直標：一抗+熒光探針 間標：二抗+熒光探針如：微管蛋白tublin （ 抗tublin抗體+熒

3、光探針）TubulinTracker? : Oregon Green? 488 Taxol bis-acetate :紫衫醇 肌動蛋白actin （ Palloidine+熒光探針 Tritc）2）細胞膜表面受體與胞內受體（活細胞）配體+熒光探針如：nAchR、mAchR、多巴胺受體（D1,D2）標記 Gm1:霍亂毒素受體：霍亂毒素+FITC標記 Ip3 受體： Heparin + FITCTfR受體：轉鐵蛋白+ TRITC熒光染料的重要特性光譜特性：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜光量子產率：特定條件下為常數(shù)，每個染料分子的熒光強度與光量子產率成正比。摩爾吸光系數(shù)：代表染料對激發(fā)光的吸收能力光穩(wěn)定性，光漂

4、白性PH穩(wěn)定性特異性和毒性定位、定量研究中常用熒光探針GreenFITC494/518RedTRITCFar-Red544/572Cy5650/690（異硫氰基熒光素)（四甲基異硫氰基羅丹明)Alexa Fluor 488488/530PE565/578Cy5.5532（藻紅蛋白）Cy7633Texas Red595/615350（德州紅）405Cy3558/568BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR543/569 BODIPY TR592/618Alexa Fluor 染料Alexa Fluor染料一是一系列高亮度的卓越染料，他們的優(yōu)點如下:亮度 Alexa Fluor

5、比相似發(fā)射光譜的染料的熒光更強。光穩(wěn)定性 Alexa Fluor 比其他的熒光染料的光穩(wěn)定性好，可更長時間采集圖像顏色可選擇性好 Alexa Fluor 提供從藍色到紅色不同的顏色可選擇。強度不受 PH 值影響 Alexa Fluor 在寬的 PH 值范圍內有強熒光水溶性好 Alexa Fluor 染料的水溶性好， 在細胞體系中可不使用有機溶劑， 在儲存中抗沉淀 Alexa Fluor 染料BODIPY 類熒光染料對酸堿不敏感。 熒光量子產率一般都比較高，有的甚至在水中的熒光量子產率可以接近1 0。具有相對較好的光穩(wěn)定性。熒光光譜半峰寬較窄，作為熒光標識時有很好的靈敏度。BODIPY 染料的摩

6、爾吸光系數(shù) &很大，通常大于80 000 L/( mol cm)，吸光效率比較高。BODIPY FL 503/512BODIPY TMR 543/569BODIPY TR 592/618標記細胞器熒光探針1) 線粒體 MitochondriaRodamin 123505/534 ，可染活細胞，陽離子 , 可檢測線粒體膜電位。在多數(shù)正常細胞中停留時間長，在腫瘤細胞 中停留時間短。因此，可用來研究腫瘤細胞的 多藥抗藥性。JC1 線粒體膜電位低時為單體， 490/527 發(fā)綠光 線粒體膜電位高時為多聚體， 490/590 發(fā)紅光 可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針。MitoTrack

7、er probes 的光譜特性 標記細胞器熒光探針Mitotracker 這類染料可被動擴散入胞內，染活細胞線粒體，在細胞固定和通透后，染料仍停 留在細胞內，保留活細胞時的原樣。可與 GFP 、免疫熒光等進行多重標記。MitoFluor Green Probe 是 MitoTracker Green FM的衍生物，可著染活細胞中的線粒體，固定后熒光不能保持。比羅丹明 123 的熒光強且光穩(wěn)定性好。紅色的 MitoFluor 熒光探針包括 MitoFluor Red 589 、MitoFluor Red 594 MitoFluor Red 589 探針在線粒體聚集，且不受線 粒體膜電位的影響。

8、MitoFluor Red 594 probe 是對線粒體膜電位敏感的染料 。MitoSOX Red 線粒體過氧化的標記物MitoSOX Red 線粒體 ROS 探針 是一種高選擇性的活細胞線粒體過氧化物檢測的熒光染料。 它可以通透活細胞并靶向線粒體。一旦在線粒體中被過氧化物氧化，發(fā)出明亮的紅色熒光并與 核酸結合。（激發(fā) /發(fā)射峰為 510/580 nm ） MitoSOX Red 探針易于被過氧化物氧化，但不能被 其他 ROS 或氮自由基（ RNS ）產生系統(tǒng)氧化，并且氧化過程被超氧化物歧化酶所阻斷。這種 染料使研究者能夠在活細胞的線粒體中直接測量其產生的過氧化物而不必分離線粒體。 標記細胞

9、器熒光探針2） 溶酶體 Lysosome 中性紅 541/640: 微偏堿性 , 可標記溶酶體等酸性器官 為非特異性AO :LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細胞，固定和通透后，仍保持原樣停留在細胞內。LysoTracker Red DND-99 用于溶酶體損傷，細胞凋亡和受 體及通道蛋白的亞細胞地位的研究Lysosensor 是一種嗜酸性的染料，其熒光強度隨溶酶體酸性 的提高而升高。用于測定溶酶體的 PH 值標記細胞器熒光探針3）高爾基體 Golgi apparatusNBD C6-ceramide 466/536, 可染活或死細胞Bodipy FL C

10、5-ceramide 、 Bodipy TR C5-ceramideBodipy FL C5-神經酰胺的熒光特性有濃度依賴性。高濃度時，發(fā)射峰可從515nm變?yōu)?20nm。多用于高爾基體染色。Bodipy FL C5-神經酰胺特異結合于高爾基體后，神經酰胺代謝為神經鞘磷脂，繼而與其他膜（主要是核膜和質膜 ） 結合。其他膜發(fā)綠色熒光，而高爾基體發(fā)紅色熒光。Bodipy FL C5- 神經酰胺 Ex: Em 503nm: 515nm 標記細胞器熒光探針4) 內質網 Endoplasmic ReticulumDiOC 6(3) 484/500: 非特異性 , 較高濃度標記內質網DiOC 5(3)較低

11、濃度標記線粒體ER blue white 360nm/430nm-640nm ER-Tracker Green and Red Dyes 540/587nm5) 自噬體 autophagosomeMDC 360nm/430nm 以上激光掃描共焦顯微鏡技術的應用死細胞死細胞6)細胞核PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA碘化丙啶活細胞活細胞A-T 半通透細胞EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNAHochest 33342Hochest 33258DAPI352/461 DNA A-T352/461 DNA A-T358/461 DN

12、A青色熒光蛋白CFP綠色熒光蛋白GFP黃色熒光蛋白YFP紅色 DsRedChromomycin A3AOTOTO-1SYTO1116 2024SYTO1116 2024SYTO 17熒光蛋白示蹤綠色熒光蛋白 不同種類的熒光蛋白藍色熒光蛋白 BFP450/470 DNA G-C500/526 DNA560/650 RNA514/533 DNA488/ 520521/ 556621/634活細胞死細胞活細胞活細胞活細胞熒光蛋白主要應用對活細胞中的某種蛋白進行準確定位及動態(tài)觀察 可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時 空表達 , 如某種轉錄因子的核轉位、蛋白激酶

13、C 的膜轉位等。GFP 基因與分泌蛋白基因連接后轉染細胞 , 可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程GFP 基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內質網、高爾基體、線粒體等細胞器的結構可用于觀察分子的運動（ FRAP ） 蛋白之間的相互作用（ FRET ）在選擇鈣探針時應考慮的因素探針的形式 （鹽, AM ester 甲基乙酸酯或者葡聚糖結合物 ）探針的形式影響細胞負載的方式和 探針在細胞內的分布和存留。鹽和葡聚糖形式的探針用顯微注射，微粒轟擊或者電穿孔等方法 進入細胞，而甲基乙酸酯有細胞膜通透性，可被動擴散進入細胞，在細胞內由酯酶裂解。測定方式：取決于離子濃度的定量

14、還是定性的測定。探針在與離子結合后出現(xiàn)光譜轉移的可 用比值法測定鈣離子的濃度擴散系數(shù) （Kd）, 與所測定區(qū)域的鈣濃度范圍相當。探針的可測量的離子濃度范圍在 0.1Kd 到 10 X Kd 之間。鈣探針的 Kd 值受許多因素的影響，包括PH ，溫度，離子強度，Kd白質結合和是否存在鎂離子和其它離子。發(fā)射波長測量細胞內鈣變化的探針熒光探針激發(fā)波長FLuo3-AM506nm525nm390nMFluo4506nm525nm345nMCalcium Green-1507nm530nm190nMCalcium Green-2507nm535nm550nMFura red420/480nm637nm14

15、0nMOregon Green 488 494nm520nm20,000nMCalcium Crimso583nm602nm328nMIndo-1356nm405/458nm230nMFura-2340/380476nm145nM檢測線粒體鈣的探針Rhod-2, Rhod-5N , Rhod-FF , X-rhod-1 , X-rhod-5F , X-rhod-FF 。是一系列細胞通透的 陽離子鈣探針，在某些細胞中局限分布于線粒體，主要是通過電位驅動的膜攝取形成的。線粒 體鈣離子攝取能力強，因此需要低親和性的鈣探針來精確的測量其鈣濃度。pH值的檢測探針 膜電位的探針 標記膜電位探針 慢反應）（

16、每1mV 1%）530/590nm573nm500nmJC1 (線粒體)510nmDioc5(3)548nmDioc6(3)484nm快反應探針(每100mV 210%)Di-4-ANEPPS496nm703nmDi-8-ANEPPS498nm713nm細胞膜靜息膜電位：-70mV線粒體膜電位：-150mV自由基的檢測H2DCF-DA （ 504nm/529nm）2-氫，2氯熒光素乙酰乙酸鹽：檢測胞質內自由基水平胞外H2DCF-DA擴散入細胞內酯酶脫乙酰DCF-H（不熒發(fā)光）DCF （發(fā)熒光）*樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察Dihydroethidium （DHE）:胞漿內為藍色，氧化后為紅色

17、，與DNA結合線粒體內自由基探針Dihydrorhodamine 123 （ 507nm/529nm）被動擴散入細胞內在細胞內被氧化成rodamine123 （發(fā)光）MitoTracker Red CM-H ?XRos : （ 578/599 nm）被動擴散入細胞后，在胞漿內被氧化為一種發(fā)出紅色熒光的物質，并聚集在線粒體中，適于檢 測線粒體內自由基MitoSOX Red 線粒體 ROS 探針：（510/580 nm）是一種高選擇性的活細胞線粒體過氧化物檢測的熒光染料。它可以通透活細胞并靶向線粒體。 在線粒體中被氧化，發(fā)出明亮的紅色熒光并與核酸結合。腫瘤細胞的黏著斑蛋白和微絲（Acti n）8氧

18、鳥苷-fitc標記測定細胞凋亡Mitotracker顯示的293細胞的線粒體Lysotracker顯示的細胞內溶酶體MDC標記的細胞自噬體PC12細胞JC1測線粒體膜電位PC12細胞100mMGLU 處理后的線粒體膜電位DCFDA標記A549細胞的自由基變化NF-kB核轉位激光掃描共焦顯微鏡技術的應用動態(tài)測量Physiology:細胞內離子動態(tài)變化測量游離Ca2+濃度變化的相對測量檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與 Ca2+結合時不發(fā)熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內，被細胞內酯酶水解后并與胞內游離鈣結合后發(fā)出熒光。Kd值為 Ca

19、2+解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍：0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有關，如pH、 Mg 2+、與蛋白的結合、溫度等。細胞內生理Ca2+濃度值（10-100n M），細胞內Ca2+超載濃度值（基礎 Ca2+濃度的倍左右） 激光掃描共焦顯微鏡技術的應用測量過程1）顯微鏡下找到合適的細胞，最好用透射光尋找，避免汞燈的長時間照射。多數(shù)細胞在負載 Fluo-3后熒光較穩(wěn)定，但大鼠心肌細胞在汞燈長時間照射下熒光會增強，且細胞受到損傷。2）確定采集圖像的條件，包括針孔的大小、光電倍增管的增益、濾片系統(tǒng)的選擇、掃描速度 和掃描密度等，掃描速度和掃描密度要精心選擇，它直接影響采樣頻率，即會影響

20、測量結果。3）根據細胞種類和所加的藥物等實驗要求，確定采集頻率，即采集每一幅圖像的間隔時間。當需要采樣頻率較高時，采集每一幅圖像的時間間隔可設定為零，此時采樣頻率的快慢取決于 掃描速度和掃描密度。如果仍然不能滿足 Ca2+快速變化的要求，應加快掃描速度和減少掃描密 度，或采用線掃描。然后根據掃描的總時程，確定共需采集多少幅圖像。4）開始采集圖像，加藥前采集1分鐘作為靜息水平對照，加藥后繼續(xù)掃描。程序設定加藥的等待時間。5）采集圖像之后或采集之前，勾畫感興趣的細胞或細胞內某個區(qū)域（核周、胞漿、胞核或突 起等），計算機會描繪出時間-熒光強度曲線。激光掃描共焦顯微鏡技術的應用激光掃描共焦顯微鏡技術的

21、應用Ca2+濃度的絕對測量細胞內生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M ）細胞內Ca2+超載濃度值（基礎 Ca2+濃度的10倍左右）1）標準曲線法根據儀器條件和負載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer（EGTA- Ca2+做標準曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強度。2）比例熒光的測量.雙波長（比例熒光：ratio）Indo1（360, 420/480）, fura2（340/380, 440）2+Ca I =K d（RR min）/（R maxR）F f2/Fs2鈣濃度的測定方法2+Ca i =Kd（R-Rmin）/（R max- R）F f2/F s2Kd :鈣熒光探針的解離常數(shù)

22、Rmin:細胞內無鈣時雙發(fā)射熒光強度的比值（MnCl2）Rmax：細胞內鈣飽和時雙發(fā)射熒光強度的比值（A23187）Ff2 :細胞內無鈣時分母的熒光強度Fs2：細胞內鈣飽和時分母的熒光強度檢測Rmin時，在培養(yǎng)皿中需加入 MnCl2 ,Mn2+可與Ca2+競爭結Fluo-3，Mn 2+與Fluo-3 結合后，F(xiàn)luo-3不發(fā)熒光，這時檢測的熒光強度值相當于無Ca2+時的熒光強度。檢測 Rmax時,在培養(yǎng)皿中加入 A23187或Triton X-100，使胞內Ca2+濃度與胞外Ca2+濃度平衡。通常按生理 環(huán)境配置的胞外含 Ca2+緩沖液的Ca2+濃度比胞內Ca2犒出1000倍以上。標準曲線法激

23、光掃描共焦顯微鏡技術的應用快速Ca2+變化的測量1. 改變掃描速度2. 采用雙向掃描3. 減少采樣點數(shù)（犧牲空間分辨率）4. 采用線掃描（xt）樣品制備Ca2+負載所需材料和試劑：?培養(yǎng)在蓋玻片或 glass-bottom培養(yǎng)皿中（MatTek公司）融合程度達到 70-80%的細胞。?Tyrode 鹽溶液：5mM Hepes，136mM NaCl，2.7mM KCl，1mM MgCl2，1.9mM CaCl2，5.6mM Glucose,用 Tris 調整 pH 值至 7.4。?Tyrode-BSA:加 0.1% 的 BSA 到 Tyrode 鹽溶液。?Hanks鹽溶液。?使用滲透壓計，測量含

24、 BSA和不含BSA緩沖液的滲透壓，用蔗糖調滲透壓至310mOsm。?將 Fluo-3或其它Ca2+探針（Molecular Probes公司）溶于DMSO 至1mM ,制成冷凍儲藏液， 再溶于Tyrode-BSA溶液或Hank s鹽溶液中，終濃度為 5M15M。樣品制備負載方法：?將將細胞培養(yǎng)在蓋薄片上或培養(yǎng)在glass-bottom培養(yǎng)皿中的細胞用2ml Tyrode s鹽溶液或Hanks鹽溶液洗細胞三次。?取 60-100川Fluo-3置于glass-bottom培養(yǎng)皿的凹曹處，或將 50-100屮Fluo-3置于蓋薄片細胞 表面上，用封口膜將液體展平，室溫孵育45-60min，37 C

25、孵育30min （注意使細胞保釋，處于生理狀態(tài)）。?負載后，用Tyrode-BSA洗細胞兩次，再用 Tyrode洗細胞兩次；或直接用Hanks液洗細胞三次。?將負載好的細胞再放置室溫15min，以使酯酶充分水解激光掃描共焦顯微鏡技術的應用借助細胞內Ca2+的檢測可研究：1肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)2. 神經遞質的釋放3. 學習記憶的增強4. 卵子受精5細胞分裂和再生6細胞調亡7. 細胞間通訊8. 細胞膜受體的功能9. 細胞離子通道的功能10. 細胞信號傳導11. DNA合成12. 基因表達PC12細胞鈣變化線粒體內自由基的動態(tài)檢測線粒體內自由基的動態(tài)檢測藥物進入細胞的過程轉鐵蛋白的運動腸系膜動靜

26、脈血流的動態(tài)觀察光譜掃描的應用檢測樣品自發(fā)熒光的光譜新熒光探針的發(fā)射光譜在標記過程中造成的熒光探針的光譜轉移光譜拆分：主要用于植物樣品激光掃描共焦顯微鏡技術的應用定位與定量測量應注意的問題定位：1. 可以根據樣品的實際情況，調整獲取圖像的參數(shù)。以獲取真實、清晰漂亮的照片為主。2. 根據實際情況選擇 pinhole的大小，一般情況下應盡可能小。3. 確認共定位時要取兩個通道熒光相互干擾（crosstalk）的對照圖像，并采用補償或順序掃描的方法排除干擾。4. 排除自發(fā)熒光、非特異性標記的影響，避免獲取假陽性信號圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術的應用定量（靜態(tài)）：1. 儀器的各個條件必須一致 （Pin

27、hole、PMT、offset、laser、檢測波長范圍）。2. 必須用原始圖像進行定量測量（不能用三維疊加圖定量）。3. Pinhole盡可能的大。4. 盡可能采用兩種熒光強度的比值或兩個不同位 置的熒光強度比值。5. 無法用比值進行計算時，每次檢測都必須有對照組，且不同次的檢測，對照組要一致。樣品制備免疫熒光標記步驟1）免疫熒光單標記方法免疫熒光單標記是指只標記一種蛋白分子，方法比較簡單，只要按照染色步驟去做， 通常不存在太多的問題，但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會直接影響染 色結果。具體染色方法如下：所需材料與試劑：?培養(yǎng)在蓋薄片或 glass-bottom培養(yǎng)皿中（M

28、atTek公司）匯合程度達到 70-80%的細胞 ?一抗，二抗+熒光素（FITC 或TRITC ）?4%多聚甲醛固定液?封閉液?0.01M PBS緩沖液樣品制備?取出培養(yǎng)有細胞的蓋薄片或glass-bottom培養(yǎng)皿，PBS洗2-3遍?加入 0.3% 的 Triton X-100 , 37 C , 30 分鐘?加入4%多聚甲醛室溫固定30分鐘?正常羊血清封閉30分鐘?加入一抗，37 C孵育1小時或4 C過夜?0.3% Triton X-100 洗 5 分鐘；PBS（0.01）洗 5 分鐘；0.3% Triton X-100 洗 5 分鐘;PBS（0.01M ）洗5分鐘?加入二抗+ FITC 或

29、二抗+ TRITC , 37 C，孵育1小時?0.3% Triton X-100 洗 5 分鐘，PBS (0.01M )洗 5 分鐘；0.3% Triton X-100 洗 5 分鐘，PBS (0.01M )洗5分鐘，用濾紙吸干。?90%甘油PBS封片。樣品制備免疫熒光雙標記免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內兩種蛋白分子，方法稍微復雜一些，首先應注意兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應重疊且盡量遠離，通?？梢赃x擇二FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5或Cy3和Cy5等來組合。染色時，通常情況下，兩種一抗可以同 時孵育，然后同時孵育兩種二抗，但當染色結果一種顏色非常弱，而

30、另一種顏色比較強時，應 考慮先孵育顏色較弱的一抗且延長孵育時間。其它步驟同免疫熒光單標記。同時應注意兩種一 抗的種屬來源不能相同。固定細胞核復染：Hochest33342： 1._g/ml 15min 室溫，洗 2 次。FRAP 應用熒光漂白恢復 (Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)測量淬滅區(qū)域的熒光恢復過程，從而得到分子運動的速率。主要用來檢測生物膜流動性，細胞內細胞間分子的流動，縫隙連接，分子的核漿穿梭等。FRAP的測量原理細胞膜經熒光探針標記后，選擇一個區(qū)域，用較強功率的激光進行照射，使被照射區(qū)發(fā)生光 漂白或淬滅，然后測量被漂

31、白區(qū)的熒光強度的恢復，按照下列公式可以計算出膜的側向擴散系 數(shù)D。2D= (3 豹 /11/2 ) 7:光漂白區(qū)域的半徑t1/2:熒光強度恢復到 50%時所需的時間:光漂白區(qū)域形狀修正因子FRAP常用染料細胞間縫隙連接通訊細胞間縫隙連接是細胞間微小的親水性通道，可允許相對分子質量1000以下的小分子通過。這表明細胞內的小分子，如無機鹽離子、糖、氨基酸、核苷酸和維生素等有可能通過間隙連接 的孔膝，而蛋白質、核酸、多糖等生物大分子不能通過。熒光漂白恢復技術可以研究細胞間縫隙連接，研究對象為活細胞，通常用熒光染料CDFA進行染色，熒光染料 CDFA為可以穿過細胞間縫隙連接孔道的分子。測量時，將相鄰兩個細胞中 的一個用較高功率的激光進行光漂白并測量光漂白后的熒光強度，然后測量該細胞的熒光恢復 率R。FRAP測定生物膜的流動性FRAP測量生物膜的流動性FRAPFLIPFLIP （ Fluorescence loss in photobleaching） 檢測淬滅區(qū)域外的樣品區(qū)域熒光減低的過程，間接表示出分子運動的快慢 與 FRAP 的原理基本相同F(xiàn)RET（熒光共振能量轉移）FRET,熒光共振能量轉移，是在供體和受體相互靠得很近（1-10 nm）時，從一個受激發(fā)的 熒光團（供體