1細胞生物學實驗技術

1、 洋蔥表皮細胞顯微結(jié)構(gòu)洋蔥表皮細胞顯微結(jié)構(gòu) 骨骼肌超微結(jié)構(gòu)骨骼肌超微結(jié)構(gòu) 脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)模型脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)模型 從從16世紀后期到世紀后期到19世紀世紀30年代，是細胞發(fā)現(xiàn)和細胞知識的積累階段。年代，是細胞發(fā)現(xiàn)和細胞知識的積累階段。 通過對大量動植物的觀察，人們逐漸意識到不同的生物都是由形形色色通過對大量動植物的觀察，人們逐漸意識到不同的生物都是由形形色色 的細胞構(gòu)成的。的細胞構(gòu)成的。 Hooke觀察到的軟木結(jié)構(gòu)觀察到的軟木結(jié)構(gòu)Hooke使用的顯微鏡使用的顯微鏡 從從19世紀世紀30年代到年代到20世紀初期，細胞學說形成后，開始了在顯微水世紀初期，細胞學說形成后，開始了在顯微水 平研究細胞的結(jié)

2、構(gòu)與功能。形態(tài)學、胚胎學和染色體知識的積累，平研究細胞的結(jié)構(gòu)與功能。形態(tài)學、胚胎學和染色體知識的積累， 使人們認識了細胞在生命活動中的重要作用。使人們認識了細胞在生命活動中的重要作用。 1893年年Hertwig的專著的專著細胞與組織細胞與組織（Die Zelle und die Gewebe） 出版，標志著細胞學的誕生。出版，標志著細胞學的誕生。 1896年哥倫比亞大學年哥倫比亞大學Wilson編著的編著的細胞發(fā)育與遺傳細胞發(fā)育與遺傳（The Cell in Development and Heredity）、）、1920年墨爾本大學年墨爾本大學Agar編著的編著的細胞細胞 學學（Cytol

3、ogy ）都是這一領域最早的教科書。）都是這一領域最早的教科書。 從從20世紀世紀30年代到年代到70年代，電子顯微鏡技術出現(xiàn)后，把細胞學帶入年代，電子顯微鏡技術出現(xiàn)后，把細胞學帶入 了第三大發(fā)展時期，這短短了第三大發(fā)展時期，這短短40年間不僅發(fā)現(xiàn)了細胞的各類超微結(jié)構(gòu)，而年間不僅發(fā)現(xiàn)了細胞的各類超微結(jié)構(gòu)，而 且也認識了細胞膜、線粒體、葉綠體等不同結(jié)構(gòu)的功能，使細胞學發(fā)展且也認識了細胞膜、線粒體、葉綠體等不同結(jié)構(gòu)的功能，使細胞學發(fā)展 為細胞生物學。為細胞生物學。De Robertis等人等人1924年出版的年出版的普通細胞學普通細胞學 （General Cytology）在）在1965年第四版的

4、時候定名為年第四版的時候定名為細胞生物學細胞生物學 （Cell Biology），這是最早的細胞生物學教材之一。），這是最早的細胞生物學教材之一。 線粒體結(jié)構(gòu)示意圖線粒體結(jié)構(gòu)示意圖線粒體超微結(jié)構(gòu)線粒體超微結(jié)構(gòu) 從從20世紀世紀70年代基因重組技術的出現(xiàn)到當前，細胞生物學與分子生年代基因重組技術的出現(xiàn)到當前，細胞生物學與分子生 物學的結(jié)合愈來愈緊密，研究細胞的分子結(jié)構(gòu)及其在生命活動中的作用物學的結(jié)合愈來愈緊密，研究細胞的分子結(jié)構(gòu)及其在生命活動中的作用 成為主要任務，基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、腫瘤生物學、細胞分化和凋亡是成為主要任務，基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、腫瘤生物學、細胞分化和凋亡是 當代的研究熱點。當代

5、的研究熱點。 細胞凋亡示意圖細胞凋亡示意圖細胞信號轉(zhuǎn)導途徑細胞信號轉(zhuǎn)導途徑細胞分化示意圖細胞分化示意圖 可把物體放大可把物體放大1500倍，分辨的最小倍，分辨的最小 極限為極限為0.2m。 用高速電子束代替光束，放大倍數(shù)達用高速電子束代替光束，放大倍數(shù)達80 萬倍萬倍，分辨率最小極限達，分辨率最小極限達0.10.2nm。 AB AB AB F2 F1 鏡座鏡座 鏡柱鏡柱 鏡臂鏡臂 鏡筒鏡筒 物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡轉(zhuǎn)換器 鏡臺鏡臺 調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)器 粗準焦螺旋粗準焦螺旋 細準焦螺旋細準焦螺旋 機械部分機械部分 照明部分照明部分 反光鏡反光鏡 聚光器聚光器 光圈光圈 光學部分光學部分 目鏡目鏡 物鏡物鏡 鏡頭

6、鏡頭放大倍數(shù)放大倍數(shù)鏡身鏡身數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑工作距離工作距離/mm 低倍鏡低倍鏡10短短0.37 高倍鏡高倍鏡40較長較長0.50.5 油鏡油鏡100長長1.30.2 不同放大倍數(shù)物鏡不同放大倍數(shù)物鏡 的工作距離的工作距離 l看不到物象的可能原因：看不到物象的可能原因： 物鏡未對正通光孔，對正后再觀察；物鏡未對正通光孔，對正后再觀察； 標本未放到視野內(nèi)，移動標本至通標本未放到視野內(nèi)，移動標本至通 光孔中央；光孔中央； 調(diào)節(jié)器轉(zhuǎn)動太快，超過焦點，應重調(diào)節(jié)器轉(zhuǎn)動太快，超過焦點，應重 新調(diào)焦；新調(diào)焦； 視野內(nèi)光線太強，不易觀察到未染視野內(nèi)光線太強，不易觀察到未染 色的標本片，將光線調(diào)暗再觀察。色的標

7、本片，將光線調(diào)暗再觀察。 1 2 3 4 5 6 相差顯微鏡光路圖示相差顯微鏡光路圖示 1-目鏡；目鏡；2-物鏡；物鏡；3-標本片標本片 4-聚光器；聚光器；5-相板；相板；6-環(huán)狀光闌環(huán)狀光闌 環(huán)狀光闌環(huán)狀光闌 環(huán)狀光闌位于光源與聚光器之間，是環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直環(huán)狀光闌位于光源與聚光器之間，是環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直 徑和孔寬與不同物鏡相匹配。大小不同的環(huán)狀光闌成一轉(zhuǎn)盤。更換放徑和孔寬與不同物鏡相匹配。大小不同的環(huán)狀光闌成一轉(zhuǎn)盤。更換放 大率不同的物鏡時，要同時更換相應的環(huán)狀光闌。其作用是使照明光大率不同的物鏡時，要同時更換相應的環(huán)狀光闌。其作用是使照明光 線從環(huán)狀的透明區(qū)進入聚光

8、鏡，再斜射到標本上。線從環(huán)狀的透明區(qū)進入聚光鏡，再斜射到標本上。 相差物鏡相差物鏡(鏡頭上標有鏡頭上標有PC或或PH字樣字樣) 物鏡的后焦平面上裝有相板，相板上和環(huán)狀光闌相對應的環(huán)狀部分物鏡的后焦平面上裝有相板，相板上和環(huán)狀光闌相對應的環(huán)狀部分 大多數(shù)涂有吸收膜和推遲相位膜，其他部分完全透明。從標本上射過大多數(shù)涂有吸收膜和推遲相位膜，其他部分完全透明。從標本上射過 來的光線，繞射光部分穿過透明區(qū)；直射光則穿過相板的環(huán)狀部分，來的光線，繞射光部分穿過透明區(qū)；直射光則穿過相板的環(huán)狀部分， 一般所用的相板推遲相位一般所用的相板推遲相位1/4波長，吸收波長，吸收80%的直射光，使直射光和的直射光，使直

9、射光和 繞射光的強度接近，明暗反差增大。由于透明標本內(nèi)部構(gòu)造的折射率繞射光的強度接近，明暗反差增大。由于透明標本內(nèi)部構(gòu)造的折射率 不同，產(chǎn)生繞射光的相位有不同程度的推遲，繞射光和直射光的干涉不同，產(chǎn)生繞射光的相位有不同程度的推遲，繞射光和直射光的干涉 作用將相位差變成振幅差。作用將相位差變成振幅差。 綠色濾光片綠色濾光片 在環(huán)狀光闌下面置綠色濾光片于光路中，它可吸收紅色和藍色光，在環(huán)狀光闌下面置綠色濾光片于光路中，它可吸收紅色和藍色光， 使波長范圍小的單色光線進行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲使波長范圍小的單色光線進行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲 得良好的效果。一般選用中心波長得良好

10、的效果。一般選用中心波長546nm的綠色濾光鏡，濾光鏡插入的綠色濾光鏡，濾光鏡插入 后對比度就提高。后對比度就提高。 合軸調(diào)整望遠鏡合軸調(diào)整望遠鏡 為使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線上，必須拔出目鏡，為使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線上，必須拔出目鏡， 裝上特別的低倍望遠鏡，使相板的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的明環(huán)重合對齊，裝上特別的低倍望遠鏡，使相板的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的明環(huán)重合對齊， 才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。 倒置顯微鏡倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，物組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，物 鏡安裝在載物臺的下方，光源及聚光

11、器安裝在載物臺的上方。鏡安裝在載物臺的下方，光源及聚光器安裝在載物臺的上方。倒置相倒置相 差顯微鏡差顯微鏡用于觀察培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的活細胞的細微結(jié)構(gòu)，由于工作用于觀察培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的活細胞的細微結(jié)構(gòu)，由于工作 距離的限制，最大放大率為距離的限制，最大放大率為60，一般研究用倒置相差顯微鏡配置有，一般研究用倒置相差顯微鏡配置有 4、10、20及及40相差物鏡。相差物鏡。 。 熒光染料熒光染料激發(fā)光激發(fā)光熒光顏色熒光顏色應用范圍應用范圍 溴化乙錠（溴化乙錠（EB）藍紫藍紫紅紅DNA HO33258紫外紫外藍白藍白DNA 吖（吖（）啶橙（）啶橙（AO）藍光藍光綠綠(DNA)、紅、紅(RNA)DNA、RNA 派洛寧派洛寧Y綠光綠光紅紅RNA 異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC）藍光藍光黃綠黃綠蛋白質(zhì)、抗體標記蛋白質(zhì)、抗體標記 四乙基羅丹明四乙基羅丹明綠光綠光橘紅橘紅抗體標記抗體標記 四甲基異硫氰酸羅丹明四甲基異硫氰酸羅丹明綠光綠光橘紅橘紅抗體標記抗體標記 二乙酸酯熒光素（二乙酸酯熒光素（FDA）藍光藍