生物化學(xué)蛋白質(zhì)之一

1、1.了解蛋白質(zhì)的分類，掌握蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)。 2.掌握蛋白質(zhì)的基本構(gòu)件分子：氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)， 從各氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上理解氨基酸的分類。 3.掌握氨基酸的理化性質(zhì)，重點(diǎn)掌握兩性電離與等 電點(diǎn)含義、茚三酮反應(yīng)及其應(yīng)用。 目的與要求 一、 蛋白質(zhì)分類 1.催化蛋白（酶)： 2.調(diào)節(jié)蛋白：如胰島素、生長素； 3.轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：如血紅蛋白、載脂蛋白、運(yùn)鐵蛋白等。 4.運(yùn)動(dòng)蛋白：肌肉收縮，如肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白。 （一）根據(jù)功能分類 2.1 蛋白質(zhì)分類 5.防御蛋白: 如免疫球蛋白； 6.毒蛋白：如溶血蛋白； 7.受體蛋白: 如味覺蛋白、視覺蛋白； 8.支架蛋白：如SH2; 9.結(jié)構(gòu)蛋白： 10.異常蛋白

2、：如甜味蛋白、毒素蛋白等都具 有特異的生物學(xué)功能。 （二）、根據(jù)分子形狀分類 1.球狀蛋白質(zhì) 2.纖維狀蛋白質(zhì) 3.膜蛋白質(zhì) （三）、根據(jù)分子組成分類 （1）簡單蛋白質(zhì)：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、 醇溶谷蛋白、組蛋白、精蛋白、硬蛋白。 （2）結(jié)合蛋白質(zhì)：色素蛋白、金屬蛋白、磷蛋 白、核蛋白、脂蛋白、糖蛋白。 1.完全蛋白質(zhì) 2.不完全蛋白質(zhì) （四）、根據(jù)營養(yǎng)價(jià)值分類 二、蛋白質(zhì)的水解 1.酸水解 條件：5-10倍的20%的鹽酸煮沸回流16-24小時(shí)， 或加壓于120水解2小時(shí)。 優(yōu)點(diǎn)：可蒸發(fā)除去鹽酸，水解徹底，終產(chǎn) 物為L-氨基酸，產(chǎn)物單一，無消旋現(xiàn)象。 缺點(diǎn)：色氨酸破壞，腐黑質(zhì)，水解液呈黑色。

3、 2. 堿水解 條件：4mol/L Ba(OH)2或6mol/L NaOH煮沸6小時(shí)。 優(yōu)點(diǎn)：水解徹底，色氨酸不被破壞，水解液清亮。 缺點(diǎn)：產(chǎn)生消旋產(chǎn)物，破壞的氨基酸多，一般很少使 用。 3. 蛋白酶水解 條件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常溫37- 40， pH值5-8。 優(yōu)點(diǎn)：氨基酸不被破壞，不發(fā)生消旋現(xiàn)象。 缺點(diǎn)：水解不完全，中間產(chǎn)物多。 蛋白質(zhì)酸堿水解常用于蛋白質(zhì)的組成分析，而 酶水解用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。 2.2 蛋白質(zhì)的分子組成-氨基酸 一、蛋白質(zhì)的元素組成 蛋白質(zhì)是有機(jī)化合物，離不開C、H、O三種元素， 還含有N、P、S、金屬元素等。 含量 (%) 50-556-720-231

4、5-170.3-3微量 或無 元素 組成 CHONS其它 蛋白質(zhì)中N是特征元素，且含量恒定，為16%左右， 即16克氮/100克蛋白質(zhì)，故可以用凱氏定氮法測定樣 品中總氮含量和無機(jī)氮含量, 求出樣品中蛋白質(zhì)含量; 即： 蛋白質(zhì)含量 =(總氮含量-無機(jī)氮含量) 6.25 式中6.25，即16%的倒數(shù)，為1g氮相當(dāng)于蛋白質(zhì)的量 （克數(shù)）。 有些蛋白質(zhì)含有其他微量元素：P、Fe、Cu、Mn、 Zn、Co、Mo、I 等。 二、蛋白質(zhì)分子的基本組成單位-氨基酸 （一）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式： 1、構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨 基酸均為L-氨基酸 。 2、除R為H（甘氨酸 ）外，其余氨基酸均具 有旋光性。 3、各種氨基酸的區(qū)

5、 別在于側(cè)基R基上。 從氨基酸的結(jié)構(gòu)通 式可以看出： H3N C COO RH H3NC COO R H 透視式 投影式 （二）氨基酸的構(gòu)型： 構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸除甘氨酸外，均含有 -碳原子，在空間各原子有兩種排列方式： L-構(gòu)型與D-構(gòu)型，互為鏡像關(guān)系。 （三）氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類 1.按氨基酸分子中羧基與氨基的數(shù)目分： （1）酸性氨基酸及酰胺：一氨基二羧基氨基酸， 有：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺; （2）堿性氨基酸：二氨基一羧基氨基酸，有：賴 氨酸、精氨酸、組氨酸; （3）中性氨基酸：一氨基一羧基氨基酸。 天冬氨酸 （Asp,D） 天冬酰胺 （Asn,N） 谷氨酰胺 （Gln,Q）

6、 谷氨酸 （Glu,E） 酸性氨基酸及酰胺 堿性氨基酸 賴氨酸 （Lys,K） 精氨酸 （Arg,R） 組氨酸 （His,H） 中性氨基酸 甘氨酸 (Gly,G） 丙氨酸 （Ala,A） 纈氨酸 （Val,V） 亮氨酸 （Lue,L） 異亮氨酸 （Ile,I） 絲氨酸 （Ser,S） 蘇氨酸 （Thr,T） 半胱氨酸 （Cys,C） 甲硫氨酸 (Met,M） 中性氨基酸 2、按側(cè)基R基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分： （1）脂肪族氨基酸 （2）芳香族氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、 酪氨酸 （3）雜環(huán)氨基酸：脯氨酸、組氨酸 中性脂肪族氨基酸 甘氨酸 (Gly,G） 丙氨酸 （Ala,A） 纈氨酸 （Val,V） 亮氨

7、酸 （Lue,L） 異亮氨酸 （Ile,I） 含羥基或硫脂肪族氨基酸 組氨酸 （His,H）脯氨酸（Pro,P） 雜環(huán)氨基酸 苯丙氨酸 （Phe,F） 酪氨酸 （Tyr,Y） 色氨酸 （Trg,W） 芳香族氨基酸 3、按側(cè)基R基與水的關(guān)系分： （1）非極性氨基酸：有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸。 （2）極性不帶電氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、絲 氨酸、蘇氨酸。 （3）極性帶電氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸 、精氨酸、組氨酸。 4、按氨基酸是否能在人體內(nèi)合成分： （1）必需氨基酸：指人體內(nèi)不能合成的氨基酸，必 須從食物中攝取，

8、有八種：賴氨酸、色氨酸、甲硫 氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇 氨酸。 （2）非必需氨基酸：指人體內(nèi)可以合成的氨基酸。 有十種。 （3）半必需氨基酸：指人體內(nèi)可以合成但合成量不 能滿足人體需要的氨基酸，有：組氨酸、精氨酸。 注：二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 支鏈氨基酸：纈氨酸、亮氨酸，異亮氨酸 含羥基的氨基酸：絲氨酸、蘇氨酸 含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巰基）、 甲硫氨酸（含硫甲基） 含苯環(huán)的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸 注：二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 含胍基的氨基酸：精氨酸 含咪唑基的氨基酸：組氨酸 亞氨基酸：脯氨酸 含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺 含吲哚基的氨基酸：色氨酸 含-氨基

9、的氨基酸：賴氨酸 （四）蛋白質(zhì)中不常見的氨基酸 羥-脯氨酸 羥-賴氨酸 r-羧基谷氨酸 6-氮-甲基賴氨酸 （五）非蛋白氨基酸 鳥氨酸 胍氨酸 高半胱氨酸 高絲氨酸 -丙氨酸 -氨基丁酸等 三.氨基酸的理化性質(zhì) （一）物理性質(zhì) 1.形態(tài)：均為白色結(jié)晶或粉末，不同氨基酸的晶型結(jié) 構(gòu)不同。 2.溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于 丙酮，在稀酸和稀堿中溶解性好。 3.熔點(diǎn)：氨基酸的熔點(diǎn)一般都比較高，一般都大于 200，超過熔點(diǎn)以上氨基酸分解產(chǎn)生胺和二氧化碳。 4.旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。 5.光吸收：氨基酸在可見光范圍內(nèi)無光吸收，在近紫 外區(qū)含苯環(huán)氨基酸有光的吸收。 （二）化

10、學(xué)性質(zhì) 1. 兩性電離及等電點(diǎn)： 氨基酸既含有氨基，可接受H+，又含有 羧基，可電離出H+，所以氨基酸具有酸堿 兩性性質(zhì)。通常情況下，氨基酸以兩性離 子的形式存在，如下圖所示： 從上圖可知：氨基酸在酸性環(huán)境中，主要以陽離 子的形式存在，在堿性環(huán)境中，主要以陰離子的形式 存在。在某一pH環(huán)境下，以兩性離子（兼性離子）的 形式存在。該pH稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。所以氨基酸 的等電點(diǎn)可以定義為：氨基酸所帶正負(fù)電荷相等時(shí)的 溶液pH。 氨基酸的水溶液既可被酸滴定，又可 被堿滴定，應(yīng)該具有兩性電離的性質(zhì)， 現(xiàn)以甘氨酸為例來說明氨基酸兩性電離 的特點(diǎn)。 一氨基一羧基一氨基一羧基AA的等電點(diǎn)的等電點(diǎn) 計(jì)算：計(jì)

11、算： pI= 2 pK 1+pK 2 左圖是甘氨酸的電離酸堿 滴定曲線，從左向右是用 NaOH滴定的曲線，溶液的 pH由小到大逐漸升高；從 右向左是用鹽酸滴定的曲 線，溶液的pH由大到小逐 漸降低。曲線中從左向右 第一個(gè)拐點(diǎn)是氨基酸羧基 解離50%的狀態(tài)，第二個(gè)拐 點(diǎn)是氨基酸的等電點(diǎn)，第 三個(gè)拐點(diǎn)是氨基酸氨基解 離50%的狀態(tài)。 一氨基二羧基一氨基二羧基AA的的 等電點(diǎn)計(jì)算：等電點(diǎn)計(jì)算： pI= 2 pK 1+pK 2 二氨基一羧基二氨基一羧基AA的的 等電點(diǎn)計(jì)算：等電點(diǎn)計(jì)算： pI= 2 pK 2+pK 3 谷氨酸（A）和賴氨酸（B）滴定曲線和等電點(diǎn)計(jì)算 在酸性條件下，丙氨酸以陽離子形式存在

12、，可以 看作是一個(gè)二元弱酸，有兩個(gè)可以解離的H+，即COOH 上的H+和NH3上的H+。 物質(zhì)的解離常數(shù)是用滴定曲線的實(shí)驗(yàn)方法求得，畫 出曲線。 加入酸堿使丙氨酸的凈電荷等于0時(shí)，丙氨酸所帶 的正負(fù)電荷相等，這時(shí)的pH值就是丙氨酸的等電點(diǎn)。 PI:兩性電解質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等時(shí)溶液的pH值。 PI=兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團(tuán)的PK值之和的一半 （2.34+5.69）/2=6.02 中性氨基酸： pI=(pK1 + pK2)/2 pK1為-羧基的解離常數(shù), pK2為-氨基的解離常數(shù)。 氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算 2.由-氨基參加的反應(yīng)： (1) 與亞硝酸反應(yīng)：放出氮?dú)猓獨(dú)獾囊话雭碜园?基氮，一半來自亞硝酸，

13、在通常情況下測定生成的 氮?dú)獾捏w積量可計(jì)算氨基酸的量，此反應(yīng)可用于測 定蛋白質(zhì)的水解程度。 (2) 與甲醛的反應(yīng)： 用過量的中性甲醛與氨基酸反應(yīng)，可游離 出氫離子，然后用NaOH滴定，從消耗的堿量可 以計(jì)算出氨基酸的含量。此法稱為間接滴定法。 2.由-氨基參加的反應(yīng)： (3) 與2,4-二硝基氟苯（2,4-DNFB）的反應(yīng) （Sanger反應(yīng)）：生成黃色的二硝基苯-氨基酸衍 生物。 (4) 與苯異硫氰酸酯（PITC）反應(yīng)（Edman反應(yīng)）： 生成苯乙內(nèi)酰硫脲-氨基酸。 (5) 與丹磺酰氯（DNS-Cl）的反應(yīng)：生成熒光物 質(zhì)DNS-氨基酸。 (3)、(4)、(5)反應(yīng)用于蛋白質(zhì)的N-末端的測定

14、。 2.由-氨基參加的反應(yīng)： 3.-羧基參加的反應(yīng)： (1)與堿反應(yīng)成鹽 (2)與醇反應(yīng)成酯 (3)與?；噭┓磻?yīng)成酰氯 4.-氨基與-羧基共同參加的反應(yīng) 與茚三酮的反應(yīng)：除脯氨酸與羥脯氨酸外，可與其它氨 基酸生成藍(lán)紫色化合物。脯氨酸與羥脯氨酸為黃色化合物。 O O O H2C H2C N H CH CH2 COOH O O CH2 H2 C N HCCH2 黃色 (1) Millon反應(yīng)：檢測Tyr或含Tyr的蛋白質(zhì)的反應(yīng)。 Millon試劑：汞的硝酸鹽與亞硝酸鹽溶液。 產(chǎn)物：紅色的化合物。 (2) Folin反應(yīng)：檢測Tyr或含Tyr的蛋白質(zhì)的反應(yīng)。 Folin試劑：磷鉬酸、磷鎢酸混合溶液

15、。 產(chǎn)物：藍(lán)色的鉬藍(lán)、鎢藍(lán)。 (3) 坂口反應(yīng)：檢測Arg或含Arg的蛋白質(zhì)的反應(yīng)。 坂口試劑：-萘酚的堿性次溴酸鈉溶液。 產(chǎn)物：磚紅色的沉淀。 5.側(cè)鏈反應(yīng)（顏色反應(yīng)）： (4) Pauly反應(yīng)：檢測His、Tyr及含His、Tyr蛋白質(zhì)的 反應(yīng)。 試劑：對(duì)氨基苯磺酸鹽酸溶液、亞硝酸鈉、碳酸鈉 混合溶液. 產(chǎn)物：橘紅色的化合物。 (5) 乙醛酸的反應(yīng)：檢測Trp或含Trp蛋白質(zhì)的反應(yīng)。 當(dāng)Trp與乙醛酸和濃硫酸在試管中疊加時(shí)，產(chǎn)生分層 現(xiàn)象，界面出現(xiàn)紫色環(huán)。 (6) Cys的反應(yīng)：Cys或含Cys蛋白質(zhì)與亞硝基亞鐵氰酸 鈉在稀氨的溶液中，產(chǎn)生一種紅色的化合物。 四.氨基酸的分離測定 （一）層

16、析法 層析法是利用被分離樣品混合物中各組分的化 學(xué)性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相 中，這兩個(gè)相一個(gè)為固定相，另一個(gè)為流動(dòng)相。當(dāng) 流動(dòng)相流進(jìn)固定相時(shí)，由于各組分在兩相中的分配 情況不同或電荷分布不同或離子親和力不同等，而 以不同的速度前進(jìn)，從而達(dá)到分離的目的。 常見的層析法有： 濾紙層析、薄層層析、離子交換層析、親和層析 （二）電泳法 電泳是指帶電的顆粒在電場中向著以其顆粒 所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。 一、 蛋白質(zhì)分類 1.催化蛋白（酶)： 2.調(diào)節(jié)蛋白：如胰島素、生長素； 3.轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：如血紅蛋白、載脂蛋白、運(yùn)鐵蛋白等。 4.運(yùn)動(dòng)蛋白：肌肉收縮，如肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白。 （一）根

17、據(jù)功能分類 2.1 蛋白質(zhì)分類 二、蛋白質(zhì)分子的基本組成單位-氨基酸 （一）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式： 1、構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨 基酸均為L-氨基酸 。 2、除R為H（甘氨酸 ）外，其余氨基酸均具 有旋光性。 3、各種氨基酸的區(qū) 別在于側(cè)基R基上。 從氨基酸的結(jié)構(gòu)通 式可以看出： H3N C COO RH H3NC COO R H 透視式 投影式 （二）氨基酸的構(gòu)型： 構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸除甘氨酸外，均含有 -碳原子，在空間各原子有兩種排列方式： L-構(gòu)型與D-構(gòu)型，互為鏡像關(guān)系。 中性脂肪族氨基酸 甘氨酸 (Gly,G） 丙氨酸 （Ala,A） 纈氨酸 （Val,V） 亮氨酸 （Lue,L） 異亮氨酸 （Ile,I） 苯丙氨酸 （Phe,F） 酪氨酸 （Tyr,Y） 色氨酸 （Trg,W） 芳香族氨基酸 注：二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 支鏈氨基酸：纈氨酸、亮氨酸，異亮氨酸 含羥基的氨基酸：絲氨酸、蘇氨酸 含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巰基）、 甲硫氨酸（含硫甲基） 含苯環(huán)的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨