申請(qǐng)書編號(hào)：

1、申請(qǐng)書編號(hào)：項(xiàng)目類別投送學(xué)科代碼所屬領(lǐng)域指南代碼計(jì)劃項(xiàng)目編號(hào)面上農(nóng)業(yè)2103福建省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目申 請(qǐng) 書項(xiàng)目名稱：青枯病生防菌蠟狀芽孢桿菌gfp標(biāo)記及其在番茄根際定殖機(jī)理的研究申 請(qǐng) 者：車建美 助理研究員工作單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所通訊地址：福州市五四北路247號(hào)郵 編：350003電 話子信箱：chejm2002申請(qǐng)日期：2005年11月30日福建省科學(xué)技術(shù)廳二五年填 報(bào) 說(shuō) 明 一、申請(qǐng)項(xiàng)目必須符合福建省自然科學(xué)基金資助范圍。申請(qǐng)書各項(xiàng)內(nèi)容，要求實(shí)事求是，逐條認(rèn)真填寫，表達(dá)要明確、嚴(yán)謹(jǐn)，外來(lái)語(yǔ)同時(shí)用原文和中文表達(dá)。 二、申請(qǐng)書一式六份，采

2、用a4幅面，于左側(cè)裝訂成冊(cè)。各欄空格不夠時(shí)，請(qǐng)自行加頁(yè)。封面上“順序號(hào)”和“項(xiàng)目編號(hào)”申請(qǐng)者不必填寫，但“項(xiàng)目類別”、“投送學(xué)科代碼”和“應(yīng)用領(lǐng)域”要認(rèn)真填寫。 三、簡(jiǎn)表的內(nèi)容應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定填寫。凡選擇性欄目，請(qǐng)?jiān)谔崾痉鸻、b、c上打“”，其余欄目說(shuō)明如下：項(xiàng)目名稱要確切反映研究?jī)?nèi)容，字?jǐn)?shù)最多不超過(guò)30個(gè)漢字（包括標(biāo)點(diǎn)符號(hào)）。所屬學(xué)科根據(jù)申請(qǐng)項(xiàng)目所屬學(xué)科，嚴(yán)格按國(guó)家自然科學(xué)基金申請(qǐng)項(xiàng)目分類目錄及代碼填寫。起止年月申請(qǐng)資助年限一般在三年以內(nèi)，最長(zhǎng)不超過(guò)五年，起始年月從申請(qǐng)項(xiàng)目年份的五月份算起。申請(qǐng)者如系兩人以上聯(lián)合申請(qǐng)的項(xiàng)目只填寫第一申請(qǐng)者情況。所在單位名稱須按單位公章填寫全稱。項(xiàng)目主要研究?jī)?nèi)容與

3、預(yù)期研究成果摘要表述要通俗、精練，總字?jǐn)?shù)不得超過(guò)120個(gè)漢字，包括標(biāo)點(diǎn)符號(hào)（占一格）。無(wú)法用漢字表達(dá)的外文用印刷體書寫，數(shù)字用阿拉伯字，每格2個(gè)字符。簡(jiǎn) 表研 究 項(xiàng) 目名 稱類 別a.面上 b.重點(diǎn) 所屬領(lǐng)域a. 電子信息 b.農(nóng)業(yè) c.醫(yī)藥與生物 d.資源與環(huán)境e.材料與工程所屬學(xué)科名稱1農(nóng)學(xué)名稱2生物學(xué)代碼1210代碼2180起止年限2007年 5月 2010年 5月申請(qǐng)金額 4 萬(wàn)元申 請(qǐng) 者姓 名車建美性別女出生年月1977.11身份證號(hào) 歷研究生學(xué) 位碩士授予國(guó)別中國(guó)職 稱助理研究員留學(xué)時(shí)間年 月 年 月留學(xué)國(guó)別所 在單 位名稱福建省農(nóng)科院生

4、物技術(shù)研究所郵編350002性質(zhì) a高等院校 b科研單位 c其他電 目 組參加單位數(shù)總?cè)藬?shù)高級(jí)中級(jí)初級(jí)其中博士后博士生碩士生3122主要成員(不含申請(qǐng)者）姓 名身 份 證 號(hào) 碼職 稱所 在 單 位林抗美350102501025032研究員福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所曹 理研究員福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所成果摘要120字研究?jī)?nèi)容和預(yù)期利用gfp基因標(biāo)記的番茄青枯病生防菌蠟狀芽孢桿菌，實(shí)時(shí)跟蹤該生防菌在番茄植株根際和不同土壤條件定殖的數(shù)量、時(shí)間、空間動(dòng)態(tài)變化及對(duì)番茄植株內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)和根際土壤微生態(tài)的影響，闡明該生防菌的定殖機(jī)理

5、和對(duì)番茄青枯病抑制效果，為應(yīng)用提供理論依據(jù)。主題詞1.主題詞數(shù)量不多于五個(gè)；2.主題詞之間空一格一、本研究項(xiàng)目的科學(xué)依據(jù)和意義（包括科學(xué)意義和應(yīng)用前景，國(guó)內(nèi)外研究概況、水平和發(fā)展趨勢(shì)，學(xué)術(shù)思想，立論根據(jù)，特色或創(chuàng)新之處，主要參考文獻(xiàn)目錄和出處）（一）科學(xué)意義和應(yīng)用前景1、科學(xué)意義1.1 番茄青枯病防治存在的困難青枯病對(duì)茄科植物的危害甚為嚴(yán)重，一般田塊發(fā)病率為2530%，嚴(yán)重田塊可達(dá)80100%。特別在番茄結(jié)果期，適逢高溫高濕的雨季，可引起毀滅性的危害。在我國(guó)南方各省發(fā)生普遍且嚴(yán)重，無(wú)特效的化學(xué)防治方法（鄭福慶，1998），加之化防易產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染，因此對(duì)青枯病菌的生物防治引起了國(guó)內(nèi)外

6、的高度重視，芽孢桿菌、假單孢桿菌和鏈霉菌等有益微生物及生態(tài)有機(jī)肥是常被用于青枯病生物防治的重要因子。1.2 生防菌的作用存在的問(wèn)題生防菌作用效果的不穩(wěn)定性一直在困擾我們，而要發(fā)揮其生防作用的先決條件是必須能在植物上進(jìn)行有效的定殖。因此，研究并揭示具有生防及促生作用的生防菌在自然界中的生態(tài)分布以及在植物體表、體內(nèi)的定殖、擴(kuò)展、分布規(guī)律，是闡明其生防及促生作用機(jī)制并提高其作用效果的重要方面。但是長(zhǎng)期以來(lái)一直缺乏直觀有效的技術(shù)手段對(duì)其定殖規(guī)律及作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究，從而制約了其進(jìn)一步發(fā)展。傳統(tǒng)的抗生素標(biāo)記及放射性同位素標(biāo)記等技術(shù)手段受其區(qū)分土著微生物和接種物的有效性或者使用的安全性的限制，其使用具

7、有一定的局限性。1.3 基因標(biāo)記的應(yīng)用及意義發(fā)光基因標(biāo)記系統(tǒng)的出現(xiàn)為實(shí)時(shí)、原位監(jiān)測(cè)微生物在環(huán)境中的生態(tài)分布以及研究微生物和宿主間相互作用機(jī)制等提供了一套靈敏可靠的研究方法。其中，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，gfp）標(biāo)記系統(tǒng)具有基因?。s800bp）、靈敏度高（可檢測(cè)單個(gè)的菌體）、穩(wěn)定性好，可實(shí)時(shí)、原位監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在研究微生物與環(huán)境、宿主相互作用，基因表達(dá)調(diào)控等方面得到廣泛的應(yīng)用，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。1.4 項(xiàng)目的研究意義項(xiàng)目組在以往的研究過(guò)程中，已經(jīng)獲得了大量的關(guān)于番茄青枯病方面的資料和基礎(chǔ)。從番茄根際土壤分離獲得一個(gè)生防菌株蠟狀芽孢桿菌（bacill

8、us cereus）anti8098a菌株。試驗(yàn)表明，該菌株對(duì)福建番茄的田間平均防效為75%-85%。在研究過(guò)程中，項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)，在番茄根際土壤中存在著蠟狀芽胞桿菌和大量的其它芽胞桿菌，這給研究anti8098a在根際的定殖帶來(lái)了困難。目前缺乏蠟狀芽孢桿菌（bacillus cereus）在番茄根際定殖的追蹤分析，以及與青枯病病原菌生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)作用的動(dòng)態(tài)的研究。利用gfp基因標(biāo)記anti8098a及其在番茄根際定殖規(guī)律的研究，可以實(shí)現(xiàn)生防菌定殖的追蹤分析，進(jìn)行與青枯病病原菌生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)作用的動(dòng)態(tài)觀察，從而為更加深入地研究番茄青枯病的生防菌防病促生的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。2、應(yīng)用前景研究并揭示具有生防及促生作

9、用的生防菌在自然界中的生態(tài)分布以及在植物體表、體內(nèi)的定殖、擴(kuò)展、分布規(guī)律，是闡明其生防及促生作用機(jī)制并提高其作用效果的重要方面。利用gfp基因標(biāo)記法以實(shí)現(xiàn)生防菌定殖的追蹤分析，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生防菌定殖的準(zhǔn)確靈敏檢測(cè)；對(duì)提高防治水平以及更好利用生物防治措施等將具有重大的指導(dǎo)意義，對(duì)開發(fā)生物制劑新產(chǎn)品等也將起到推動(dòng)作用。本項(xiàng)目的研究有助于進(jìn)一步揭示生防菌與宿主植物內(nèi)在的相互作用規(guī)律，為更加深入地研究植物微生態(tài)學(xué)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，建立一個(gè)gfp標(biāo)記革蘭氏陽(yáng)性的芽抱桿菌的方案。這可能對(duì)其它科研工作者也有一定的借鑒意義。（二）國(guó)內(nèi)外研究概況、水平和發(fā)展趨勢(shì)1、青枯病的生物防治現(xiàn)狀及存在問(wèn)題番茄青枯病是由

10、青枯假單胞桿菌（pseudomonas solanacearum）引起的一種毀滅性的植物病害（郭堅(jiān)華，1994），在我國(guó)南方各省發(fā)生普遍且嚴(yán)重，無(wú)特效的化學(xué)防治方法（鄭福慶，1998）。利用微生物特別是芽孢桿菌防治青枯病受到了重視，用于防治青枯病試驗(yàn)的芽孢桿菌有：多粘芽孢桿菌fu6（bacillus polymyxa）（aspiras et al., 1985）、枯草芽孢桿菌（b. subtilis）（phae et al., 1993）、凝固芽孢桿菌ba24 (b. coagulans)、蠟狀芽孢桿菌ba3 （b. cereus）（silveira et al., 1995）、巨大芽孢桿菌b

11、1301（b. megaterium）（楊合同等，2002），等等，試驗(yàn)防效在45-95%。靳紹菊等（1997）報(bào)道，通過(guò)分析研究，番茄青枯雷爾氏菌的拮抗菌多數(shù)屬于熒光假單孢菌屬。經(jīng)多次分離篩選，從土壤中分離出了對(duì)作物無(wú)不良影響而對(duì)番茄青枯雷爾氏菌有拮抗作用的菌株104個(gè)。經(jīng)試驗(yàn)，利用這種拮抗菌防治番茄青枯病，當(dāng)發(fā)病株率在25%以下時(shí)，防治效果可達(dá)100%；但當(dāng)發(fā)病株率達(dá)45%時(shí)，防治效果僅為50%左右。鄭福慶等（1998）從廣東省不同地方、不同作物的根圍及根際土壤中，篩選到對(duì)番茄青枯病病菌具抑菌效果的菌株20個(gè)，盆栽試驗(yàn)表明，這些菌株可推遲番茄青枯病發(fā)生10-35天，防治效果高達(dá)80%。法國(guó)

12、trigalet和 demery（1990）發(fā)現(xiàn)有6個(gè)tn5誘變產(chǎn)生的無(wú)致病力青枯突變株，它們能在番茄莖、葉部定殖，它們與強(qiáng)致病菌株以等量或低量接種時(shí)，可阻止致病菌的增殖，具有較好的生防前景。frey等（1996）也得到了相似的結(jié)果。項(xiàng)目研究組從番茄病株篩選到青枯病生防菌anti-8098菌株，對(duì)番茄青枯病有較好的防效（劉波等，2000），經(jīng)農(nóng)業(yè)部藥檢所指定的田間藥效測(cè)定表明：對(duì)茄子青枯病的防效在75-85%（未發(fā)表），菌株經(jīng)德國(guó)菌種保存中心（dsmz）鑒定為蠟狀芽孢桿菌（bacillus cereus，strain anti-8098a，鑒定號(hào)：id-01-1000），并對(duì)番茄青枯病菌的致病

13、力分化以及生防菌形態(tài)特征、生化特性、培養(yǎng)特性、抑菌機(jī)理、生產(chǎn)工藝、生物測(cè)定、大田試驗(yàn)進(jìn)行了研究。2、芽抱桿菌在植物病害生物防治中的應(yīng)用早在1921年，hartely利用有拮抗作用的真菌防治碎倒病從而開創(chuàng)了植物病害生物防治的先河。1973年澳人利亞植物病理學(xué)家kerr等用放射土壤桿菌(agrobacterium radiobacter)k84成功的對(duì)一些植物的根癌病進(jìn)行防治，這使生防菌在防治植物病害中的地位進(jìn)一步得到確立。目前生產(chǎn)上比較成功的應(yīng)用于防治植物病害的生防菌有土壤桿菌屬(agrobacterium)、芽抱桿菌屬(bacillus)、歐文氏菌屬(erwinia)、黃單孢菌屬、假單抱菌屬等

14、。其中芽抱桿菌由于能產(chǎn)生抗逆性極強(qiáng)的內(nèi)生抱子一芽抱，從而更有利于商品化菌劑的生產(chǎn)、運(yùn)輸和保存，并且相對(duì)于其它細(xì)菌類和真菌類的菌劑其使用效果較為穩(wěn)定并且與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配使用的相容性更好。芽抱桿菌屬微生物廣泛的存在于自然界中，在土壤、植物的根部、植物的體表及體內(nèi)均分離到大量的芽抱桿菌。目前用生防芽抱桿菌防治植物病害在生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛的應(yīng)用。在美國(guó)gb03、mbi600、qst713和fzb24等生防菌株已獲得環(huán)保局商品化或有限商品化應(yīng)用許可。gb03和mb160o在根部或拌種使用可防治fusarium、aspergillus、alternaria和rhizoctonia等引起的豆類、麥類、棉花、花

15、生的根部病害。3、番茄青枯病的發(fā)生及其病原菌致病機(jī)理的研究 青枯病對(duì)茄科植物的危害甚為嚴(yán)重，一般田塊發(fā)病率為2530%，嚴(yán)重田塊可達(dá)80100%。番茄在生長(zhǎng)過(guò)程經(jīng)常受到青枯病的危害，特別在番茄結(jié)果期，適逢高溫高濕的雨季，可引起毀滅性的危害。近年來(lái)隨著大棚番茄的面積擴(kuò)大，特別是連片大棚番茄的種植，棚內(nèi)溫濕度高，通氣條件差，使番茄青枯病在不同地區(qū)發(fā)生及為害加重。該病害常在開花坐果期發(fā)生，來(lái)勢(shì)兇猛，發(fā)展迅速，重病田、病株率達(dá)80100，初果期發(fā)病植株死亡率高，嚴(yán)重威脅大棚番茄生產(chǎn)安全，已成為限制著我國(guó)作物生產(chǎn)發(fā)展重要因素。青枯雷爾氏菌（ralstonia. solanacearum）在一般條件下是從

16、植株根部傷口侵入，但不能從植物氣孔侵入。病菌進(jìn)入寄主組織后即可繁殖，并進(jìn)入維管束，繼續(xù)向其他組織擴(kuò)展蔓延，同時(shí)分泌果膠酶、纖維素毒等，分解寄主的中膠層，使寄主皮層和髓部組織殘廢腐爛。寄主組織破壞腐爛后，病菌落入土壤中或堆肥中越冬，來(lái)年碰到有利條件，繼續(xù)侵入寄主為害。4、芽孢桿菌在番茄青枯病防治中的應(yīng)用前景由于用化學(xué)藥物難以控制青枯病菌，加之化防易產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染，因此對(duì)青枯病菌的生物防治引起了國(guó)內(nèi)外的高度重視，生物防治可作為解決土傳病害的一條有希望的途徑。近幾十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)番茄青枯病的生防做了許多研究。印度anuratha和gnanamanikam(1990)用三種菌株pseu

17、domonas fluorescens(pfcp)和bacillus spp(b33，b36)分別進(jìn)行多種作物青枯病的防效試驗(yàn)。其中對(duì)番茄青枯病效果，溫室試驗(yàn)分別為95、20、33，田間分別為36、3、20。葉云飛等（2005）用不同接種方法測(cè)定番茄內(nèi)生芽孢桿菌b47菌株對(duì)番茄青枯病的室內(nèi)防效，結(jié)果表明，接種b47菌17d后再接種茄青枯雷爾氏菌的植株能較好地防治番茄青枯病，防治效果為81.25；b47菌和茄青枯雷爾氏菌同時(shí)接種的植株對(duì)該病的防效較低，僅為1667。b47菌株與根圍鏈霉菌st103菌株混合施用室內(nèi)對(duì)番茄青枯病的防效為62.52，田間防效為81.82。5、基因標(biāo)記在植物病害生物防治

18、機(jī)理研究中的應(yīng)用運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基因標(biāo)記方法，把標(biāo)記好的生防菌接種植物（一般用綠色熒光蛋白基因進(jìn)行標(biāo)記），可以很直觀地觀察到生防菌是否進(jìn)入了植物體，不同生防菌的侵染特性及其動(dòng)力學(xué)，侵入部位、在宿主中的定殖部位以及在植物的整個(gè)生活史的動(dòng)態(tài)變化，實(shí)現(xiàn)研究過(guò)程的可跟蹤化。利用基因標(biāo)記研究生防菌的應(yīng)用已經(jīng)引起了許多學(xué)者的興趣。lo等（1998）以葡糖醛酸酶和潮霉素b作為選擇標(biāo)記，用基因槍法進(jìn)行了t. harzianum 菌株1295-22的遺傳轉(zhuǎn)化，并以帶標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子研究了該菌在匍匐葦草（creeping bentgrass）根際和葉面的定殖和分布情況。bae &、knudsen（20

19、00）以葡糖醛酸酶和綠色熒光蛋白為選擇標(biāo)記，用peg介導(dǎo)法進(jìn)行了t. harzianum isolate thzid1的遺傳轉(zhuǎn)化，并用篩選出的帶標(biāo)記基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子檢測(cè)了該生防菌在土壤中的定殖、生長(zhǎng)。atkins等（2000）以mdpc和綠色熒光蛋白作為選擇標(biāo)記，轉(zhuǎn)化了根結(jié)線蟲生防真菌p.chlamydospora，但未獲得穩(wěn)定的標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化子。大量的實(shí)驗(yàn)表明，借助于gfp標(biāo)記技術(shù)研究細(xì)菌的定殖規(guī)律具有很多優(yōu)越性。自1994年chalfie等首次在果蠅、大腸桿菌等生物體內(nèi)成功表達(dá)gfp起，作為分子標(biāo)記物，gfp標(biāo)記技術(shù)只有l(wèi)0年的歷史，如今已有越來(lái)越多的研究人員將其作為又一快速高效的研究工具。

20、gfp標(biāo)記在實(shí)時(shí)、原位研究微生物的空間定位、微生物與環(huán)境及宿主相互作用等方面展示了良好的應(yīng)用前景。6、gfp在微生物與宿主相互作用研究中的應(yīng)用 早期的研究者用熒光抗體檢測(cè)宿主中的微生物，后來(lái)發(fā)明了用熒光染料直接包被微生物以研究其在活體細(xì)胞中作用方式。由于這些方法嚴(yán)重影響微生物的生理功能，而且在細(xì)菌分裂的過(guò)程中熒光信號(hào)會(huì)不斷的減弱，所以很難實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的長(zhǎng)期跟蹤。gfp標(biāo)記系統(tǒng)和熒光顯微鏡的出現(xiàn)使研究者能夠?qū)ξ⑸锖退拗飨嗷プ饔眠M(jìn)行長(zhǎng)期的、直接的監(jiān)測(cè)。raphael等在19%年構(gòu)建了兩套加基因表達(dá)系統(tǒng)，分別在鼠傷寒桿菌和海分枝桿菌中高效表達(dá)gfp。他們用落射式熒光顯微鏡對(duì)病菌侵染宿主(哺乳動(dòng)物細(xì)

21、胞)的過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)追蹤。實(shí)驗(yàn)表明，gfp的表達(dá)沒(méi)有對(duì)細(xì)菌的存活造成不利影響，也沒(méi)有降低其侵染能力及在吞噬細(xì)胞中的存活能力。qazi等(2000)把從枯草芽抱桿菌中克隆到核糖體識(shí)別位點(diǎn)、木聚糖啟動(dòng)子(入yla)與gfp基因連接，在革蘭氏陽(yáng)性菌中(李斯特單核增生菌、金黃葡萄桿菌、枯草芽抱桿菌等)成功表達(dá)出gfp，并對(duì)李斯特單核增生菌侵染哺乳細(xì)胞的全過(guò)程進(jìn)行跟蹤。7、gfp在研究開放環(huán)境中微生物的應(yīng)用近年來(lái)，研究人員構(gòu)建出多種gfp表達(dá)系統(tǒng)用于在開放環(huán)境中微生物的研究。1996年，burlage等用tns轉(zhuǎn)座子將gfp基因插入惡臭假單胞菌的染色體以研究細(xì)菌的遷移規(guī)律。實(shí)驗(yàn)證明，可以用熒光分光光度計(jì)精

22、確地檢測(cè)細(xì)菌的遷移率。eberl等(1997)用gfp基因標(biāo)記惡臭假單胞菌以研究其在活性污泥中的存活。在接種后，他們很快就觀察到在活性污泥絮狀物間自由游動(dòng)的接種菌。兩分鐘后觀察到原生動(dòng)物捕食標(biāo)記的細(xì)菌。3天后，雖然在絮凝物中有大量的微生物，但是在絮凝物之外卻幾乎觀察不到標(biāo)記的細(xì)菌。這表明絮凝物起到保護(hù)細(xì)菌不被原生動(dòng)物捕食的作用。olofsson等結(jié)合使用落射式熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡研究gfp基因標(biāo)記的大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌在活性污泥中的定殖。研究發(fā)現(xiàn)，菌體表面的疏水性物質(zhì)是決定其在絮凝物上黏附能力的關(guān)鍵因子；三維的圖像顯示兩種菌在絮凝物上的附著模式完全不同；細(xì)菌可以通過(guò)孔洞穿過(guò)絮凝物

23、。他們的研究揭示了細(xì)菌在活性污泥中的附著機(jī)制，有助于提高污水處理的效率晰。1999年unge等使用gfp-lux雙標(biāo)記系統(tǒng)對(duì)標(biāo)記菌的代謝活性和熒光強(qiáng)度同時(shí)進(jìn)行原位檢測(cè)，展示了雙標(biāo)記系統(tǒng)在環(huán)境樣本原位檢測(cè)中的應(yīng)用前景。這些研究表明，用分子生物學(xué)的方法可以清晰的區(qū)分接種菌和環(huán)境中的土著菌，與傳統(tǒng)的抗生素抗性標(biāo)記相比其靈敏度和精確度要高的多。gfp分子標(biāo)記法己成為研究微生物在環(huán)境中存活、繁殖、擴(kuò)展以及空間定位的重要手段。但是其樣品制備和技術(shù)操作也比較復(fù)雜，這可能成為妨礙快速分析微生物與環(huán)境相互作用的限制因子。（三）項(xiàng)目的學(xué)術(shù)思想、立論根據(jù)1、學(xué)術(shù)思想1.1為了更加深入地研究生防菌防病促生的作用機(jī)理，

24、對(duì)其進(jìn)行g(shù)fp標(biāo)記，并對(duì)其在番茄根際定殖機(jī)理進(jìn)行研究。預(yù)期可以實(shí)現(xiàn)直接觀察anti-8098a與宿主的相互作用，有助于進(jìn)一步揭示生防菌與宿主植物內(nèi)在的相互作用規(guī)律，為更加深入地研究植物微生態(tài)學(xué)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，建立gfp標(biāo)記革蘭氏陽(yáng)性的芽孢桿菌的參考體系。這可能對(duì)其它科研工作者也有一定的借鑒意義。1.2利用基因標(biāo)記法實(shí)現(xiàn)生防菌定殖的追蹤分析，進(jìn)行與青枯病病原菌生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)作用的動(dòng)態(tài)觀察。1.3 利用脂肪酸測(cè)定技術(shù)研究生防菌anti8098a對(duì)番茄內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化的影響，結(jié)合番茄植株抗病性相關(guān)酶活性的影響，確定其對(duì)植株生長(zhǎng)及抗逆性的促進(jìn)作用。2、立論依據(jù)2.1項(xiàng)目組在以往的研究過(guò)程中

25、，已經(jīng)獲得了大量的關(guān)于番茄青枯病方面的資料和基礎(chǔ)。從番茄根際土壤分離獲得一個(gè)生防菌株-蠟狀芽孢桿菌（bacillus cereus）anti8098a菌株。試驗(yàn)表明，該菌株對(duì)野生型青枯雷爾氏菌具有較強(qiáng)的抑制作用，通過(guò)農(nóng)業(yè)部指定的福建省農(nóng)藥檢定所和上海市農(nóng)科院植保所田間藥效檢驗(yàn)，平均防效為75%-85%。2.2在研究的過(guò)程中，項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)，在番茄根際土壤中存在著蠟狀芽胞桿菌和大量的其它芽胞桿菌，這給研究anti8098a在根際的定殖帶來(lái)了困難。目前缺乏蠟狀芽孢桿菌（bacillus cereus，anti8098a）在番茄根際定殖的追蹤分析，以及ant-8098a與青枯病病原菌生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)作用的動(dòng)態(tài)的

26、研究。利用基因標(biāo)記法和盆栽試驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)記基因?qū)崿F(xiàn)生防菌定殖的追蹤分析，進(jìn)行與青枯病病原菌生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)作用的動(dòng)態(tài)觀察，可以更加深入地研究生防菌防病促生的作用機(jī)理。2.3現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為生防菌的準(zhǔn)確靈敏檢測(cè)提供了理論基礎(chǔ)和操作手段。本項(xiàng)目研究的申請(qǐng)者曾在瑞典農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物系，在著名科學(xué)家janet教授指導(dǎo)下，進(jìn)行了不同菌株的gfp轉(zhuǎn)化研究，具有較為豐富的研究經(jīng)驗(yàn)，成功地進(jìn)行了青枯雷爾氏菌（ralstonia solanacearum）、大腸桿菌k88（escherichia coli k88），短短芽孢桿菌（brevibacillus brevis）等的標(biāo)記，并獲得穩(wěn)定表達(dá)菌株，實(shí)現(xiàn)研究過(guò)程的可跟

27、蹤化。并在生防菌蠟狀芽孢桿菌（bacillus cereus，anti8098a）gfp標(biāo)記上取得重要進(jìn)展， 2.4利用微生物膜間脂肪酸組成特征，可在大量的微生物樣品中準(zhǔn)確到地鑒定到種，同時(shí)，可將其應(yīng)用于植物和土壤菌群落動(dòng)態(tài)變化及生防菌生防機(jī)制的研究。本項(xiàng)目組已利用該技術(shù)對(duì)分離到的生防菌和青枯病病原菌進(jìn)行了脂肪酸特異性分析。（四）項(xiàng)目特色和主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)1. 利用gfp基因標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)生防菌anti8098a定殖過(guò)程以及生防作用過(guò)程的追蹤分析，進(jìn)行與青枯病病原菌生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)作用的動(dòng)態(tài)觀察，可以更加深入地研究生防菌防病促生的作用機(jī)理。2. 利用微生物膜間脂肪酸組成特征，利用脂肪酸測(cè)定技術(shù)，分析植株和土壤菌

28、群的群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化；3. 揭示生防菌anti8098a與宿主植物內(nèi)在的相互作用規(guī)律，為更加深入地研究植物微生態(tài)學(xué)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。（五）參考文獻(xiàn)：見(jiàn)附件參考文獻(xiàn)1) yi, y.k. 1991. protection of tobacco plants from bacterial wilt with avirulent bacteriocin-producing strains of pseudomonas solanacearum. journal of the korean society of tobacco science. 13:42-47.2) hara, h., and k

29、. ono. 1991. effect of weakly-virulent bacteriocin-producing strain of pseudomonas solanacearum on the protection of tobacco plants from bacterial wilt.3) chen, w.y., and c.c. hung. 1991. differences in susceptibility of introduced cultivars to the bacterial wilt of tobacco and their agronomic chara

30、cteristics in taiwan. bulletin of taiwan tobacco research institute, taiwan tobacco and wine monopoly bureau:53-60.4) chen, y., y. ye, d. hong, w. zhuang, y.s. chen, y.x. ye, d.z. hong, and w.d. zhuang. 1999. characterization and evaluation of groundnut germplasm in fujian. journal of fujian academy

31、 of agricultural sciences. 14:12-16.5) zheng, j.f., j.h. zhang, and j.q. chi. 1992. reactions of tobacco leaves from different varieties (lines) to the inoculated tobacco bacterial wilt pathogen pseudomonas solanacearum. plant protection. 18:10-126) wagih, e.e. 1991. neither indole acetic acid nor b

32、acteriocin is apparently involved in the in vitro antagonism between the virulent and the avirulent strains of pseudomonas solanacearum. journal of phytopathology. 132:153-160.7) abd el ghafar, n.y. 1998. control of potato bacterial wilt using crop rotation. annals of agricultural science cairo. 43:

33、575-5878) akiew, s., p.r. trevorrow, and j. kirkegaard. 1996. mustard green manure reduces bacterial wilt. bacterial wilt newsletter:5-6.9) babu, k.n., k. samsudeen, and p.n. ravindran. 1992. direct regeneration of plantlets from immature inflorescence of ginger (zingiber officinale rosc.) by tissue

34、 culture. journal of spices and aromatic crops. 1:43-48.10) baginska, h., and m. kordyla bronka. 1998. pseudomonas solanacearum e. f smith (syn. ralstonia solanacearum (smith) yabuuchi et. al.) - the potential thread to crops in poland. progress in plant protection. 38:480-483.11) arwiyanto, t., k.

35、sakata, m. goto, s. tsuyumu, and y. takikawa. 1994. induction of tomatine in tomato plant by an avirulent strain of pseudomonas solanacearum. annals of the phytopathological society of japan. 60:288-294.12) asada, y., m. miyake, j. miyake, r. kurane, and y. tokiwa. 1999. photosynthetic accumulation

36、of poly-(hydroxybutyrate) by cyanobacteria-the metabolism and potential for co2 recycling. int j biol macromol. 25:37-42.13) bhushan, b., s.k. samanta, a. chauhan, a.k. chakraborti, and r.k. jain. 2000. chemotaxis and biodegradation of 3-methyl- 4-nitrophenol by ralstonia sp. sj98. biochem biophys r

37、es commun. 275:129-33.14) bingo, m., h. toyoda, y. matsuda, m. dogo, y. kato, y. naoki, and s. ouchi. 1998. evaluation of fruit qualities in self-pollinated progenies of tomato callus-derived bacterial wilt resistant lines and establishment of the method for evaluating bacterial wilt resistance in h

38、ydroponic culture. bulletin of the institute for comprehensive agricultural sciences, kinki university:73-81.15) deslandes, l., f. pileur, l. liaubet, s. camut, c. can, k. williams, e. holub, j. beynon, m. arlat, and y. marco. 1998. genetic characterization of rrs1, a recessive locus in arabidopsis

39、thaliana that confers resistance to the bacterial soilborne pathogen ralstonia solanacearum. mol plant microbe interact. 11:659-67.16) gopalakrishnan, t.r., and k.v. peter. 1991. screening and selection for bacterial wilt resistance in chilli. indian journal of genetics and plant breeding. 51:332-33

40、4.17) gorenflo, v., g. schmack, r. vogel, and a. steinbuchel. 2001. development of a process for the biotechnological large-scale production of 4-hydroxyvalerate-containing polyesters and characterization of their physical and mechanical properties. biomacromolecules. 2:45-57.18) jetiyanon, k., j.w.

41、 kloepper, and j. kanchalee. 2002. mixtures of plant growth-promoting rhizobacteria for induction of systemic resistance against multiple plant diseases. biological control. 24:285-29119) kichise, t., t. fukui, y. yoshida, and y. doi. 1999. biosynthesis of polyhydroxyalkanoates (pha) by recombinant

42、ralstonia eutropha and effects of pha synthase activity on in vivo pha biosynthesis. int j biol macromol. 25:69-77.20) kim, b., j. cheung, y. cha, h. hwang, b.s. kim, j.d. cheung, y.s. cha, and h.s. hwang. 1998. resistance to bacterial wilt of introduced peppers. korean journal of plant pathology. 1

43、4:217-21921) leonard, d., c.b. youssef, c. destruhaut, n.d. lindley, and i. queinnec. 1999. phenol degradation by ralstonia eutropha: colorimetric determination of 2-hydroxymuconate semialdehyde accumulation to control feed strategy in fed-batch fermentations. biotechnol bioeng. 65:407-15.22) leveau

44、, j.h., f. konig, h. fuchslin, c. werlen, and j.r. van der meer. 1999. dynamics of multigene expression during catabolic adaptation of ralstonia eutropha jmp134 (pjp4) to the herbicide 2, 4-dichlorophenoxyacetate. mol microbiol. 33:396-406.23) ma, q.s. 1990. molecular biology and research on pseudom

45、onas solanacearum. aciar proceedings series:32-38.24) maas, j.l., g.j. galletta, h.a.t.v.d. scheer, f. lieten, and j. dijkstra. 1997. recent progress in strawberry disease research. 1997, no:769-77925) mendoza, h.a., f. rousselle bourgeois, and p. rousselle. 1992. breeding potatoes for combined resi

46、stance or tolerance to the main biotic and abiotic stresses. in proceedings of the joint conference of the eapr breeding & varietal assessment section and the eucarpia potato section, landerneau, france, 12 17 january 1992. 1992, 123 130; 8 ref. inra; ploudaniel; france.26) meneses, r., m. moreira,

47、j.m. jimenez, and e. bustamante. 1990. responses of table tomato lines to pseudomonas solanacearum during winter in costa rica. turrialba. 40:222-228.27) merlin, c., d. springael, and a. toussaint. 1999. tn4371: a modular structure encoding a phage-like integrase, a pseudomonas-like catabolic pathwa

48、y, and rp4/ti-like transfer functions. plasmid. 41:40-54.28) messiaen, c.m., t.d. griggs, and b.t. mclean. 1989. environmental influences on the severity of tomato bacterial wilt in the french west indies: interactions with varietal resistance. in tomato and pepper production in the tropics. proceed

49、ings of the international symposium on integrated management practices, tainan, taiwan, 21 26 march 1988. 1989, 235 238; 6 ref. asian vegetable research and development center (avrdc); taipei; taiwan.29) miah, a.j., and k.b. alam. 1992. effect of soil texture on the incidence of bacterial wilt of to

50、mato. bangladesh journal of plant pathology. 8:23-26.30) 王芳，焦新安，劉文博，張如寬，劉秀梵. 表達(dá)綠色熒光蛋白的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌的構(gòu)建與鑒定. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24（2）：119-12231) 張慶華，陳營(yíng)，陸承平.綠色熒光蛋白標(biāo)記的嗜水氣單胞菌在溫暖水體的存活及穩(wěn)定性. 水生生物學(xué)報(bào)，2001，25（3）：251-25532) 陳營(yíng)，夏曉勤，陸承平.綠色熒光蛋白標(biāo)記可移動(dòng)載體質(zhì)粒的構(gòu)建及其在嗜水氣單胞菌的表達(dá).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1999，7（4）：329-33233) 郭堅(jiān)華，李瑾. 植物細(xì)菌性青枯病的生物防治.

51、世界農(nóng)業(yè)，1994，（6）：31-3234) 原秀紀(jì). 利用弱毒力產(chǎn)細(xì)菌素青枯雷爾氏菌菌株預(yù)防煙草青枯病的效果. 國(guó)外農(nóng)學(xué)：植物保護(hù)，1992，（4）：40-4335) 匡傳富，羅寬. 煙草品種對(duì)青枯病抗病性及抗性機(jī)制的研究. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,28（5）：395-39836) 何禮遠(yuǎn)，康耀衛(wèi). 利用青枯雷爾氏菌無(wú)毒菌株和熒光假單胞菌誘導(dǎo)花生產(chǎn)生抗病性. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1990，17（2）：113-11637) 任欣正，羅燦輝. 根癌土壤桿菌新生物變種的鑒定. 植物病理學(xué)報(bào)，1990，20（3）：195-20038) 鄭繼法，張建華. 利用無(wú)毒產(chǎn)細(xì)菌素菌株防治煙草細(xì)菌性青枯病. 中國(guó)

52、煙草，1994（3）：21-2439) 廖伯壽，許澤永植物細(xì)菌性青枯病抗性的分子標(biāo)記研究與育種潛力中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2001，23（3）：66-6840) 孔凡明等煙草青枯病頡頑細(xì)菌的篩選及其防病效果研究中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，1999，5（4）：16-2041) 楊合同等姜瘟病生物防治初報(bào)山東科學(xué)，1990，3（4）：42-4642) 何禮遠(yuǎn)、康耀衛(wèi)利用青枯菌無(wú)毒菌株和熒光假單胞菌誘導(dǎo)花生產(chǎn)生抗病性植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1990，17（2）：113-11643) 靳紹菊，鐘士傳用熒光假單孢桿菌防治番茄青枯病農(nóng)業(yè)新技術(shù)新方法，1997（1）：27-2844) el abyad, et alinhibitory

53、effects of uv mutants of streptomyces corchorusii and streptomyces spiroverticillatus on bean and banana wilt pathogensjcanidian journal of botany，1993，71：1080-108645) hsu, s. t. and m.l. changeffect of soil amendments on survival of pseudomonas solanacerumplant protection bulletin, taiwan，1989，31：2

54、1-3346) 蔡燕飛等生態(tài)有機(jī)肥對(duì)番茄青枯病及土壤微生物多樣性的影響應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，14（3）：349-35347) 任欣正等無(wú)致病力產(chǎn)細(xì)菌素頡頑菌noe-104在番茄根部的定殖植物病理學(xué)報(bào)，1988，17（3）：129-13348) 羅寬，王莊利用桔杭的pseudomonas.spp和無(wú)致病力的p. solanacerum防治青枯病的研究植物病理學(xué)報(bào)，1983，13(1)：51-5649) 任欣正等無(wú)致病力產(chǎn)細(xì)菌素拮抗菌noe-104在番茄植株上定殖能力的研究植物病理學(xué)報(bào)，1987，17(3)：129-13350) 任欣正等番茄青枯病的生物防治南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，16（1）

55、：45-4951) 董春等利用無(wú)致病力青枯菌株防治番茄青枯病的研究華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，20（4）：1-452) hara. h.，ono. k.effect of weakly-avirulent bacteriocin-producing strain of pseudomonas solanacearum on the protection of tobacco plants from bacterial wiltannals of the phytopathological society of japan，1991，57（1）：24-3153) 鄭繼法等利用無(wú)毒產(chǎn)細(xì)菌素菌株防治

56、煙草細(xì)菌性青枯病中國(guó)煙草，199454) 劉波等生防菌對(duì)青枯雷爾氏菌的致弱特性農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2004，12（3）：32232955) 張長(zhǎng)齡等青枯菌的菌種保存植物保護(hù)，1993，19（1）：39-40二、研究?jī)?nèi)容和預(yù)期成果（研究項(xiàng)目的具體內(nèi)容和重點(diǎn)解決的科學(xué)問(wèn)題，預(yù)期成果和提供的形式。如系理論成果，應(yīng)寫明在理論上解決哪些問(wèn)題；如系應(yīng)用性成果，應(yīng)寫明其應(yīng)用前景）（一）研究?jī)?nèi)容和重點(diǎn)要解決的科學(xué)問(wèn)題1、anti8098a的gfp標(biāo)記和鑒定以及與親本菌株的微生物學(xué)特性的研究采用本研究室成熟gfp基因標(biāo)記手段，選擇質(zhì)粒pcm20，對(duì)已經(jīng)獲得的番茄青枯病生防菌蠟狀芽孢桿菌（anti8098a）進(jìn)行g(shù)

57、fp基因標(biāo)記。對(duì)標(biāo)記后的anti8098a-gfp菌株，進(jìn)行微生物學(xué)和抑菌特性研究。比較轉(zhuǎn)導(dǎo)前后菌株的生物學(xué)異質(zhì)性。1.1 anti8098a的gfp標(biāo)記和鑒定1.1.1anti8098a抗性背景調(diào)查：本研究擬采用質(zhì)粒pcm20進(jìn)行anti8098a的電擊轉(zhuǎn)化，由于質(zhì)粒pcm20上具有紅霉素，因此，需要對(duì)anti8098a進(jìn)行不同濃度紅霉素抗性的篩選，為轉(zhuǎn)基因工作奠定基礎(chǔ)。1.1.2anti8098a的gfp轉(zhuǎn)化及標(biāo)記菌株的篩選：以電擊法進(jìn)行番茄青枯病生防菌anti8098a的轉(zhuǎn)化，并對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中各種轉(zhuǎn)化條件，包括電壓，質(zhì)粒的濃度以及感受態(tài)的制備條件等進(jìn)行一些必要的摸索和優(yōu)化。電擊轉(zhuǎn)化之后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，篩選抗性平板上的發(fā)光菌落，并在抗性平板上進(jìn)行單菌落的純化以及甘油冷凍保存。1.1.3gfp標(biāo)記anti8098a的鑒定：將標(biāo)記菌株進(jìn)行單菌落的液體培養(yǎng)，