DNA提取與鑒定

1、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師 劉曉穎劉曉穎 張萍萍張萍萍 陳彥陳彥 王劍峰王劍峰 李紹飛李紹飛 2012-02 生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn) 生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一：動(dòng)物基因組的制備及其鑒定1 實(shí)驗(yàn)二：動(dòng)物基因組的制備及其鑒定2 實(shí)驗(yàn)三：動(dòng)物基因組的制備及其鑒定3 實(shí)驗(yàn)四：糖類化合物的提取及TLC分析1 實(shí)驗(yàn)五：糖類化合物的提取及TLC分析2 實(shí)驗(yàn)六：Sephadex-G50層析法分離蛋白質(zhì) 實(shí)驗(yàn)七：SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量 實(shí)驗(yàn)八：聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測(cè)定蛋 白質(zhì)的等電點(diǎn) 生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一：動(dòng)物基因組的制備及其鑒定1 實(shí)驗(yàn)二：動(dòng)物基因組的制備及其鑒

2、定2 實(shí)驗(yàn)三：動(dòng)物基因組的制備及其鑒定3 實(shí)驗(yàn)四：糖的分離鑒定硅膠G薄層層析 實(shí)驗(yàn)五：Sephadex-G50層析法分離蛋白質(zhì) 實(shí)驗(yàn)六：蛋白質(zhì)的FPLC分離與定量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)要求 （1）實(shí)驗(yàn)前要預(yù)習(xí)相關(guān)的內(nèi)容實(shí)驗(yàn)前要預(yù)習(xí)相關(guān)的內(nèi)容，弄懂原理，了解實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路，找出實(shí)驗(yàn) 操作的關(guān)鍵步驟，試劑的配制方法及用量，數(shù)據(jù)處理的方法等。 （2）實(shí)驗(yàn)過程中，要認(rèn)真，規(guī)范的操作。學(xué)會(huì)安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)順序。如 實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的現(xiàn)象和數(shù)據(jù)。 （3）使用儀器時(shí)要按照說明書去做。發(fā)現(xiàn)故障應(yīng)停止使用。節(jié)約試劑。公用 試劑用完后，要及時(shí)放回原處。 （4）實(shí)驗(yàn)報(bào)告要及時(shí)完成。報(bào)告上要注明實(shí)驗(yàn)日期及溫度。在報(bào)告的結(jié)果討

3、中，對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，結(jié)果和數(shù)據(jù)等可進(jìn)行分析；也可對(duì)實(shí)驗(yàn)中遇到的問題及 實(shí)驗(yàn)中需要改進(jìn)的地方進(jìn)行討論。 （5）一般試劑都應(yīng)用蒸餾水或無離子水(即離子交換水)配制，有特殊要求的 除外。 （6）試劑(特別是液體)一經(jīng)取出，不得放回原瓶，以免因量器或藥勺不清潔 而沾污整瓶試劑。取固體試劑時(shí)，必須使用潔凈干燥的藥勺。 （7）使用易燃、易爆、有腐蝕性甚至有毒的化學(xué)藥品時(shí)應(yīng)注意安全，必要時(shí) 應(yīng)戴手套，帶口罩或防毒面罩，并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。 （8）實(shí)驗(yàn)紀(jì)律：不遲到和缺席。實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生要輪流值日。 成績(jī)?cè)u(píng)定成績(jī)?cè)u(píng)定 平時(shí)成績(jī)：考勤 實(shí)驗(yàn)技能測(cè)試和實(shí)驗(yàn)報(bào) 告等 70 60% 期末理論考試： 30 40% 動(dòng)物組織的動(dòng)物

4、組織的 提取與鑒定提取與鑒定 劉曉穎劉曉穎 張萍萍張萍萍 分離純化核酸原則與要求分離純化核酸原則與要求 1. 1.應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本 要求要求) ) 2.2.排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染 純化的核酸樣品不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑純化的核酸樣品不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑 或過高濃度的金屬離子，蛋白質(zhì)、脂類、多糖分子或過高濃度的金屬離子，蛋白質(zhì)、脂類、多糖分子 的污染應(yīng)降低到最低程度；的污染應(yīng)降低到最低程度； 無

5、其他核酸分子的污染，例如提取無其他核酸分子的污染，例如提取DNADNA分子時(shí)，應(yīng)去分子時(shí)，應(yīng)去 除除RNARNA分子分子 3.3.減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解 避免過堿、過酸對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操避免過堿、過酸對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操 作多在作多在pH 4pH 41010條件下進(jìn)行條件下進(jìn)行 4. 4. 減少物理因素對(duì)核酸的降解減少物理因素對(duì)核酸的降解 強(qiáng)烈振蕩、攪拌，將細(xì)胞突置于低滲液中，細(xì)胞裂解、強(qiáng)烈振蕩、攪拌，將細(xì)胞突置于低滲液中，細(xì)胞裂解、 反復(fù)凍貯等造成的機(jī)械剪切力以及高溫煮沸等條件都反復(fù)凍貯等造成的機(jī)械剪切力以及高溫煮沸等條件都 能明顯破壞大分子量

6、的線性能明顯破壞大分子量的線性DNADNA分子對(duì)于分子量小分子對(duì)于分子量小 的環(huán)狀質(zhì)粒的環(huán)狀質(zhì)粒DNADNA及及RNARNA分子，威脅相對(duì)小一些分子，威脅相對(duì)小一些 。 5. 5. 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解 細(xì)胞內(nèi)、外各種核酸酶作用于磷酸二酯鍵，直接破壞核細(xì)胞內(nèi)、外各種核酸酶作用于磷酸二酯鍵，直接破壞核 酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。DNADNA酶需要酶需要MgMg2+ 2+， ，CaCa2+ 2+的激活，因此 的激活，因此 實(shí)驗(yàn)中常利用金屬二價(jià)離子螯合劑實(shí)驗(yàn)中常利用金屬二價(jià)離子螯合劑EDTAEDTA，檸檬酸鹽，檸檬酸鹽， 可基本抑制可基本抑制DNADNA酶的活性酶的活性 RNARN

7、A酶不但分布廣泛，極易污染，而且耐高溫、耐酸酶不但分布廣泛，極易污染，而且耐高溫、耐酸 堿，不易失去活性，所以生物降解是堿，不易失去活性，所以生物降解是RNARNA提取過程的提取過程的 主要危害因素。進(jìn)行核酸分離時(shí)最好用新鮮生物組織主要危害因素。進(jìn)行核酸分離時(shí)最好用新鮮生物組織 或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于 液氮或一液氮或一7070的冰箱中。的冰箱中。 DNADNA在細(xì)胞內(nèi)的分布在細(xì)胞內(nèi)的分布 核酸包括核酸包括DNADNA、RNARNA兩種分子，在細(xì)胞中兩種分子，在細(xì)胞中 都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。

8、真核生物的染色體真核生物的染色體DNADNA為雙鏈線性分子，原為雙鏈線性分子，原 核生物的染色體核生物的染色體DNADNA、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器 DNADNA為雙鏈環(huán)狀分子；有些噬菌體為雙鏈環(huán)狀分子；有些噬菌體DNADNA為單為單 鏈環(huán)狀分子；鏈環(huán)狀分子； 9595的真核生物的真核生物DNADNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，其他其他5 5為為 細(xì)胞器細(xì)胞器DNADNA，如線粒體、葉綠體等，如線粒體、葉綠體等 RNARNA分子主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占分子主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占7575，另有，另有1010 在細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中，1515在細(xì)胞器中。在細(xì)胞器中。 大多數(shù)

9、生物體內(nèi)大多數(shù)生物體內(nèi)RNARNA分子均為單鏈線性分子并具有不同分子均為單鏈線性分子并具有不同 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如真核生物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如真核生物mRNAmRNA分子多數(shù)在分子多數(shù)在3 3端帶有端帶有 polyApolyA結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 DNADNA的性質(zhì)的性質(zhì) DNADNA是很惰性的化學(xué)物質(zhì)，雙鏈由氫鍵緊密相連，其是很惰性的化學(xué)物質(zhì)，雙鏈由氫鍵緊密相連，其 堿基對(duì)外側(cè)受磷酸和糖的保護(hù)，并由于其內(nèi)部的堿基堿基對(duì)外側(cè)受磷酸和糖的保護(hù)，并由于其內(nèi)部的堿基 堆積力而進(jìn)一步加強(qiáng)，使堆積力而進(jìn)一步加強(qiáng)，使DNADNA在細(xì)胞內(nèi)比其他成分更在細(xì)胞內(nèi)比其他成分更 具化學(xué)耐久性。具化學(xué)耐久性。 因此在氯仿等使蛋白質(zhì)變性

10、的條件下，因此在氯仿等使蛋白質(zhì)變性的條件下， DNADNA分子仍然穩(wěn)定。分子仍然穩(wěn)定。 真核生物中的染色體真核生物中的染色體DNADNA與堿性蛋白與堿性蛋白( (組蛋白組蛋白) )結(jié)合而結(jié)合而 成核蛋白成核蛋白(DNP)(DNP)形式而存在于核內(nèi)。形式而存在于核內(nèi)。DNPDNP溶于水和濃溶于水和濃 鹽溶液鹽溶液(1-2mol/L (1-2mol/L 氯化鈉氯化鈉) )，但不溶于生理鹽溶液中，但不溶于生理鹽溶液中 (0.14mol/L (0.14mol/L 氯化鈉氯化鈉) )，而，而RNPRNP此時(shí)的溶解度較大，因此此時(shí)的溶解度較大，因此 可利用這一性質(zhì)，將可利用這一性質(zhì)，將DNPDNP與與RN

11、PRNP分離。分離。 DNADNA在乙醇中形成絮狀沉淀，使在乙醇中形成絮狀沉淀，使DNADNA最終得以分離最終得以分離 真核生物基因組真核生物基因組DNADNA分離純化的基本步驟分離純化的基本步驟 真核生物的一切有核細(xì)胞真核生物的一切有核細(xì)胞( (包括培養(yǎng)細(xì)胞包括培養(yǎng)細(xì)胞) )都可都可 以用來制備基因組以用來制備基因組DNADNA。提取方法包括兩步：。提取方法包括兩步： 1 1、先溫和裂解細(xì)胞及溶解、先溫和裂解細(xì)胞及溶解DNPDNP，而后使，而后使DNPDNP與與RNPRNP 分離，再使核蛋白解離，釋放出分離，再使核蛋白解離，釋放出DNA.DNA. 真核細(xì)胞的破碎有各種手段，包括超聲波破碎法、

12、勻漿真核細(xì)胞的破碎有各種手段，包括超聲波破碎法、勻漿 法、液氮破碎法、低滲法等物理方法及蛋白酶法、液氮破碎法、低滲法等物理方法及蛋白酶K K和去污劑和去污劑 溫和處理法，為獲得大分子質(zhì)量的溫和處理法，為獲得大分子質(zhì)量的DNADNA，一般多采用后者，一般多采用后者 溫和裂解細(xì)胞。溫和裂解細(xì)胞。 高分子質(zhì)量高分子質(zhì)量DNADNA在物理上仍是易碎的，在溶液中，長(zhǎng)在物理上仍是易碎的，在溶液中，長(zhǎng) 而彎曲的而彎曲的DNADNA分子隨機(jī)卷曲，并因堿基堆積力和磷酸分子隨機(jī)卷曲，并因堿基堆積力和磷酸 基團(tuán)間的靜電排斥力變得粘滯，容易受到吸液、振蕩、基團(tuán)間的靜電排斥力變得粘滯，容易受到吸液、振蕩、 攪拌等引起的

13、流體剪切力作用而斷裂，因此，基因組攪拌等引起的流體剪切力作用而斷裂，因此，基因組 DNADNA容易成片斷獲取，但所需分子質(zhì)量越大，獲得的容易成片斷獲取，但所需分子質(zhì)量越大，獲得的 難度也相應(yīng)增加，大于難度也相應(yīng)增加，大于150 kb150 kb的的DNADNA分子在常規(guī)分離分子在常規(guī)分離 方法中多被切斷。方法中多被切斷。 去除蛋白質(zhì)常用酚、氯仿抽提，反復(fù)抽提操作對(duì)去除蛋白質(zhì)常用酚、氯仿抽提，反復(fù)抽提操作對(duì)DNADNA 鏈機(jī)械剪切機(jī)會(huì)較多，因此有人使用鏈機(jī)械剪切機(jī)會(huì)較多，因此有人使用8080甲酰胺解聚甲酰胺解聚 核蛋白聯(lián)合透析的方法，可得小于核蛋白聯(lián)合透析的方法，可得小于200 kb200 kb

14、的的DNADNA片段。片段。 2. 2. 采用化學(xué)或酶學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、采用化學(xué)或酶學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、RNARNA及其及其 他大分子他大分子 豬脾臟豬脾臟DNADNA提取與鑒定提取與鑒定 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握濃鹽法提取與鑒定動(dòng)物組織掌握濃鹽法提取與鑒定動(dòng)物組織DNADNA的原的原 理和方法。理和方法。 【實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理】 核酸類化合物都溶于水而不溶于有機(jī)溶劑。所以核核酸類化合物都溶于水而不溶于有機(jī)溶劑。所以核 酸可用水溶液提取，而用有機(jī)溶劑沉淀法沉淀分離。酸可用水溶液提取，而用有機(jī)溶劑沉淀法沉淀分離。 在細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)，RNARNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖核蛋白與蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖核蛋白 （

15、RNPRNP），），DNADNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成脫氧核糖核蛋白與蛋白質(zhì)結(jié)合成脫氧核糖核蛋白 （DNPDNP）。）。 在在.14 mol.14 molL L的氯化鈉溶液中，的氯化鈉溶液中， RNPRNP的溶解度相的溶解度相 當(dāng)大，而當(dāng)大，而DNPDNP的溶解度僅為在水中溶解度的的溶解度僅為在水中溶解度的1 1； 當(dāng)氯化鈉的濃度達(dá)到當(dāng)氯化鈉的濃度達(dá)到1 1 molmolL L的時(shí)候，的時(shí)候， RNPRNP的溶解的溶解 度小，而度小，而DNPDNP的溶解度比在水中的溶解度大的溶解度比在水中的溶解度大2 2倍。倍。 所以常選用所以常選用.14 mol.14 molL L的氯化鈉溶液提取的氯化鈉溶液提取R

16、NPRNP ， 而選用而選用1 1 molmolL L的氯化鈉溶液提取的氯化鈉溶液提取DNPDNP 。 核酸提取液中含有核酸提取液中含有 的蛋白質(zhì)、多糖等可以的蛋白質(zhì)、多糖等可以 用沉淀分離法除去。用沉淀分離法除去。 在核酸提取液中加在核酸提取液中加 入氯仿入氯仿- -異戊醇或氯仿異戊醇或氯仿- - 辛醇，振蕩一段時(shí)間，辛醇，振蕩一段時(shí)間， 使蛋白質(zhì)在氯仿一水界使蛋白質(zhì)在氯仿一水界 面上形成凝膠狀沉淀而面上形成凝膠狀沉淀而 離心除去，核酸仍留在離心除去，核酸仍留在 水溶液中。水溶液中。 核酸都不溶于有機(jī)溶劑，可在核酸提取核酸都不溶于有機(jī)溶劑，可在核酸提取 液中加入親水有機(jī)溶劑（乙醇），使液中加

17、入親水有機(jī)溶劑（乙醇），使 DNADNA或或RNARNA呈絮狀沉淀析出。呈絮狀沉淀析出。 【實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料】 1 1材料材料 新鮮新鮮( (冰凍冰凍) )豬脾臟。豬脾臟。 2 2器材器材 高速組織搗碎機(jī)，恒溫水浴，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，錐形瓶，高速組織搗碎機(jī)，恒溫水浴，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，錐形瓶， 具塞三角瓶，試管具塞三角瓶，試管 3 3試劑試劑(2(2人人/ /組組) ) (1) 0.1mol/L NaCI-0.05 mol/L(1) 0.1mol/L NaCI-0.05 mol/L檸檬酸鈉混合液：稱取檸檬酸鈉混合液：稱取0.58g 0.58g NaClNaCl和和1.47g1.47g檸檬酸三鈉，用

18、蒸餾水溶解后稀釋至檸檬酸三鈉，用蒸餾水溶解后稀釋至 100mL100mL。 (2) 10(2) 10(1.71mol/L)NaCl(1.71mol/L)NaCl溶液溶液200ml200ml (3) (3) 氯仿氯仿: :異戊醇異戊醇(24:l ,V/V)(24:l ,V/V)，現(xiàn)用現(xiàn)配（通風(fēng)櫥中）。，現(xiàn)用現(xiàn)配（通風(fēng)櫥中）。 (4) 95(4) 95乙醇乙醇 【實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法】 1 1取新鮮取新鮮( (冰凍冰凍) )豬脾臟豬脾臟20g20g，剔去結(jié)締組織，用，剔去結(jié)締組織，用0.1mol/L 0.1mol/L NaCl-0.05mol/LNaCl-0.05mol/L檸檬酸溶液沖洗除去血水，在冰

19、浴上剪檸檬酸溶液沖洗除去血水，在冰浴上剪 成碎末。成碎末。 2 2加入加入2 2倍組織重的倍組織重的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L0.1mol/L NaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉混檸檬酸鈉混 合液合液(40mL)(40mL)置高速組織搗碎機(jī)內(nèi)破碎細(xì)胞膜置高速組織搗碎機(jī)內(nèi)破碎細(xì)胞膜( (慢檔，每慢檔，每 次次5s5s，間隔，間隔30s30s，共絞，共絞3 3次次) )，獲得組織漿液。，獲得組織漿液。靜置靜置5min5min， 期間輕輕攪拌以充分釋放期間輕輕攪拌以充分釋放RNARNA。 3 3組織漿液于組織漿液于4 43500r/min3500r/min離心離心20min20

20、min，棄去上層液，收，棄去上層液，收 集沉淀集沉淀( (包括細(xì)胞核包括細(xì)胞核) )。 4 4向細(xì)胞核沉淀中加入向細(xì)胞核沉淀中加入6 6倍組織重的倍組織重的1010(1.71mol/L)NaCl(1.71mol/L)NaCl 溶液溶液120mL120mL，充分?jǐn)噭?，置冰箱?nèi)過夜。，充分?jǐn)噭?，置冰箱?nèi)過夜。 【實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法】 5 5次日將所得到的半透明粘稠狀液體連續(xù)注入次日將所得到的半透明粘稠狀液體連續(xù)注入( (線狀、線狀、 緩慢倒入緩慢倒入) ) 預(yù)冷的預(yù)冷的1111倍體積倍體積(1320mL)(1320mL)蒸餾水中，輕輕蒸餾水中，輕輕 搖勻，搖勻，DNPDNP即呈絮狀沉淀析出，置冰箱內(nèi)

21、放置數(shù)小即呈絮狀沉淀析出，置冰箱內(nèi)放置數(shù)小 時(shí)。時(shí)。 6 6上層清液利用虹吸方法吸出，剩余含有沉淀的少上層清液利用虹吸方法吸出，剩余含有沉淀的少 量溶液經(jīng)離心量溶液經(jīng)離心(3500r/min(3500r/min，15min)15min)，收集，收集DNPDNP沉淀。沉淀。 7 7將將DNPDNP沉淀再溶于原組織重約沉淀再溶于原組織重約4 4倍體積倍體積(80mL)(80mL)的的1010 NaClNaCl溶液中，溶液中，輕輕攪拌輕輕攪拌加速溶解，加速溶解，轉(zhuǎn)移至帶蓋的轉(zhuǎn)移至帶蓋的 三角瓶中。三角瓶中。 8 8加入加入l/2l/2體積的氯仿體積的氯仿- -異戊醇溶異戊醇溶 液液(24:l ,V/

22、V) 40mL(24:l ,V/V) 40mL，上下劇烈上下劇烈 振蕩振蕩2-5min2-5min ，使組蛋白分離，使組蛋白分離， 于于3500r/min3500r/min，離心，離心l5minl5min，吸，吸 出上面含有出上面含有DNADNA和和DNPDNP的水層，的水層， 棄去兩層間的變性蛋白凝膠，棄去兩層間的變性蛋白凝膠， 回收下層有機(jī)相?；厥障聦佑袡C(jī)相。 9 9上層水相再次加入上層水相再次加入20mL20mL氯仿氯仿- - 異戊醇混合液，繼續(xù)抽提去除異戊醇混合液，繼續(xù)抽提去除 蛋白，多次重復(fù)此操作（至少蛋白，多次重復(fù)此操作（至少 共共3 3次）直至兩相之間無明顯次）直至兩相之間無明顯

23、 變性蛋白質(zhì)凝膠生成。變性蛋白質(zhì)凝膠生成。 【實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法】 1010最后吸出上清液并將它連續(xù)注入兩倍體積預(yù)冷最后吸出上清液并將它連續(xù)注入兩倍體積預(yù)冷 至至44的的9595乙醇中。乙醇中。 1111用玻棒小心撈出纖維狀用玻棒小心撈出纖維狀DNADNA鈉鹽沉淀，瀝干鈉鹽沉淀，瀝干 乙醇溶液后，依次用乙醇溶液后，依次用8080和和9595乙醇洗滌，最后乙醇洗滌，最后 用少量無水乙醇洗滌，輕輕壓擠沉淀，盡量吸盡用少量無水乙醇洗滌，輕輕壓擠沉淀，盡量吸盡 乙醇后，鋪開在表面皿上。置真空干燥器內(nèi)干燥，乙醇后，鋪開在表面皿上。置真空干燥器內(nèi)干燥， 即得白色纖維即得白色纖維DNADNA鈉鹽鈉鹽。 【實(shí)驗(yàn)

24、方法實(shí)驗(yàn)方法】 【注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)】 1 1為了防止大分子核酸在提取過程中被降解，為了防止大分子核酸在提取過程中被降解， 使其分子斷裂，因而不能獲得天然的大分子核使其分子斷裂，因而不能獲得天然的大分子核 酸。提取中需要加人酸。提取中需要加人檸檬酸鈉檸檬酸鈉、EDTAEDTA、8- 8-羥羥 基喹啉等基喹啉等抑制核酸酶的活力抑制核酸酶的活力，并在，并在低溫低溫下進(jìn)行下進(jìn)行 操作，此外提取過程中應(yīng)避免加熱，強(qiáng)酸，強(qiáng)操作，此外提取過程中應(yīng)避免加熱，強(qiáng)酸，強(qiáng) 堿和劇烈振蕩等。堿和劇烈振蕩等。 本實(shí)驗(yàn)第一步進(jìn)行組織勻漿時(shí)，不宜過于劇本實(shí)驗(yàn)第一步進(jìn)行組織勻漿時(shí)，不宜過于劇 烈，時(shí)間不能太長(zhǎng)，避免部分細(xì)胞核

25、被破壞，烈，時(shí)間不能太長(zhǎng)，避免部分細(xì)胞核被破壞， 導(dǎo)致導(dǎo)致DNADNA釋放而被斷裂，這將關(guān)系到最后是否釋放而被斷裂，這將關(guān)系到最后是否 能獲得纖維狀能獲得纖維狀DNADNA。 2 2除去蛋白質(zhì)時(shí)，若振蕩劇烈可使部分除去蛋白質(zhì)時(shí)，若振蕩劇烈可使部分DNADNA斷裂，斷裂， 乙醇沉淀后，除能纏繞粘附在玻棒上的纖維狀乙醇沉淀后，除能纏繞粘附在玻棒上的纖維狀 DNADNA外，溶液中還會(huì)有絮狀沉淀，即為斷裂的外，溶液中還會(huì)有絮狀沉淀，即為斷裂的 DNADNA。但若振蕩不夠，蛋白質(zhì)不能很好除去，。但若振蕩不夠，蛋白質(zhì)不能很好除去， 則影響則影響DNADNA制品的質(zhì)量。制品的質(zhì)量。 3 3細(xì)胞核沉淀加入濃鹽

26、溶液，冰箱放置過夜后，細(xì)胞核沉淀加入濃鹽溶液，冰箱放置過夜后， 有時(shí)可能形成塊狀凝膠有時(shí)可能形成塊狀凝膠( (如以脾臟為材料制備如以脾臟為材料制備 DNA)DNA)，應(yīng)置搗碎機(jī)內(nèi)絞，應(yīng)置搗碎機(jī)內(nèi)絞5s5s，打碎凝膠塊，但此，打碎凝膠塊，但此 時(shí)時(shí)DNADNA已從核內(nèi)溶解出來，因此不宜劇烈打碎。已從核內(nèi)溶解出來，因此不宜劇烈打碎。 【注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)】 思考題 1. 1.為什么在低溫下進(jìn)行？為什么在低溫下進(jìn)行？ 2. 2.加檸檬酸鈉和加檸檬酸鈉和EDTAEDTA的作用的作用 ? ? 3. 3.加加NaClNaCl的作用，為什么要加到的作用，為什么要加到1 1mol/L?mol/L? 4. 4.加

27、入異戊醇有什么作用？加入異戊醇有什么作用？ 5. 5.分離純化過程中每一步試劑的作用？分離純化過程中每一步試劑的作用？ l實(shí)驗(yàn)室：實(shí)驗(yàn)室： 315室室 313室室 311室室 l領(lǐng)用儀器：領(lǐng)用儀器： 312室室 王劍峰王劍峰 l純水機(jī)：純水機(jī)： 311室室 l制冰機(jī)室：制冰機(jī)室： 204室室 l離心機(jī)：離心機(jī)： 313室一臺(tái)，室一臺(tái)，204室一臺(tái)，室一臺(tái)， 103室一臺(tái)，室一臺(tái)，101室一臺(tái)，室一臺(tái)， l分光光度計(jì)室：分光光度計(jì)室：206室室 DNA的鑒定與分析 二苯胺顯色法測(cè)定二苯胺顯色法測(cè)定DNADNA含量含量 紫外吸收法測(cè)定紫外吸收法測(cè)定DNADNA純度純度 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠

28、電泳檢測(cè)DNADNA分子大小分子大小 與完整性與完整性 二苯胺顯色法測(cè)定二苯胺顯色法測(cè)定DNADNA含量（一）含量（一） 強(qiáng)酸、加熱條件下，可以使強(qiáng)酸、加熱條件下，可以使DNADNA中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的 糖苷鍵斷裂，而產(chǎn)生嘌呤堿基，糖苷鍵斷裂，而產(chǎn)生嘌呤堿基，脫氧核糖脫氧核糖與嘧啶核苷酸。與嘧啶核苷酸。 其中其中22脫氧核糖在酸性環(huán)境中成為脫氧核糖在酸性環(huán)境中成為羥基羥基酮基戊醛，酮基戊醛， 此物與二苯胺反應(yīng)生成此物與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色化合物藍(lán)色化合物，在，在595595nmnm處有最大吸收。處有最大吸收。 DNADNA在在40-40040-400g/mlg/m

29、l范圍內(nèi)光密度與范圍內(nèi)光密度與DNADNA濃度成正比。濃度成正比。 在反應(yīng)液中加入在反應(yīng)液中加入少量乙醛可提高靈敏度少量乙醛可提高靈敏度，而且其他化合物的干，而且其他化合物的干 擾也顯著降低。擾也顯著降低。 當(dāng)樣品含少量當(dāng)樣品含少量RNARNA時(shí)不影響測(cè)定，而蛋白質(zhì)、多種糖及其衍生時(shí)不影響測(cè)定，而蛋白質(zhì)、多種糖及其衍生 物芳香，羥基醛都能與二苯胺形成各種有色物質(zhì)，干擾測(cè)定。物芳香，羥基醛都能與二苯胺形成各種有色物質(zhì)，干擾測(cè)定。 【實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理】 1 1、DNADNA標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)溶液：（須經(jīng)定磷法確定其濃度）取標(biāo)準(zhǔn) （須經(jīng)定磷法確定其濃度）取標(biāo)準(zhǔn)DNADNA以以 0.010.01mol/L

30、 NaOHmol/L NaOH配成配成200200微克微克/ /毫升的標(biāo)準(zhǔn)液。毫升的標(biāo)準(zhǔn)液。 每組需每組需1212.4ml.4ml，200ml/200ml/班班 2 2、待測(cè)樣品液：待測(cè)樣品液：準(zhǔn)確稱取豬脾 準(zhǔn)確稱取豬脾DNA 5mg,DNA 5mg,用用0.010.01mol/Lmol/L的氫氧化的氫氧化 鈉溶液定容至鈉溶液定容至50ml50ml配成配成100100微克微克/ /毫升的溶液。毫升的溶液。 每組需每組需7ml7ml 3 3、二苯胺試劑：、二苯胺試劑：1g 1g二苯胺二苯胺 （需在（需在70%70%乙醇試劑中重結(jié)晶乙醇試劑中重結(jié)晶2 2次次) ) +100 mL+100 mL冰乙

31、酸冰乙酸+10 mL+10 mL過氯酸，混合備用，過氯酸，混合備用，臨用前加入臨用前加入1.0 1.0 mL1.6%mL1.6%乙醛。乙醛。 每組需每組需64ml,1000ml/64ml,1000ml/班班 4 4、1.6%1.6%乙醛：乙醛：取 取47%47%乙醛乙醛3.43.4mlml，加重蒸水定容至加重蒸水定容至100100mlml（放于放于 冰箱中，一周之內(nèi)可以使用）。冰箱中，一周之內(nèi)可以使用）。注意：商品用有注意：商品用有47%47%和和4 40%0% 兩種兩種 1. 1. DNADNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定： 取取1 14 4支試管，分成支試管，分成2 2組，依次加入組，依

32、次加入0 0、0.20.2、0.40.4、0.80.8、1.21.2、1.61.6和和 2.02.0mlDNAmlDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。添加蒸餾水，使之都成為標(biāo)準(zhǔn)溶液。添加蒸餾水，使之都成為2 2mlml。然后各加入然后各加入 4 4mlml二苯胺試劑，混勻。于沸水浴中加熱二苯胺試劑，混勻。于沸水浴中加熱10min 10min ，冷卻后于冷卻后于595595nmnm處處 進(jìn)行比色測(cè)定。進(jìn)行比色測(cè)定。取兩管平均值取兩管平均值，以，以DNADNA濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為 縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？v坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 【操作方法操作方法】 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6

33、 6 7 7 DNADNA含量含量/g/g 0 0 4040 8080 160160 240240 320320 400 400 DNADNA標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液 mLmL 0 0 0.20.2 0.40.4 0.80.8 1.21.2 1.6 1.6 2.02.0 蒸餾水蒸餾水mLmL 2.0 2.0 1.8 1.8 1.6 1.6 1.21.2 0.80.8 0.40.4 0 0 二苯胺試劑二苯胺試劑mLmL 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 混勻，立即放入混勻，立即放入沸水浴沸水浴中中加熱加熱10min10min，取出后流水，取

34、出后流水冷卻冷卻，冷卻后，冷卻后595nm595nm處比色處比色 A A595 595 DNADNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 以以1號(hào)管為空白對(duì)照號(hào)管為空白對(duì)照 2. 2. 制品的測(cè)定：制品的測(cè)定： 取取2 2支試管，各加支試管，各加2 2mlml待測(cè)液（內(nèi)含待測(cè)液（內(nèi)含DNADNA應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲 線的范圍之內(nèi)）和線的范圍之內(nèi)）和4 4mlml二苯胺試劑，搖勻。其于操作同二苯胺試劑，搖勻。其于操作同 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。 3.3.根據(jù)測(cè)得的光吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)上查出相應(yīng)該根據(jù)測(cè)得的光吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)上查出相應(yīng)該 光吸收值光吸收值DNADNA的含量，計(jì)算出制品中的

35、百分含量的含量，計(jì)算出制品中的百分含量。 【操作方法操作方法】 DNA純度： 待測(cè)液中測(cè)得的核酸微克數(shù) DNA%= 100 待測(cè)液中制品的微克數(shù) DNA產(chǎn)率: 測(cè)得的DNA的微克數(shù) DNA%= 100 原料的微克數(shù) 數(shù)據(jù)處理 二苯胺試劑僅能與二苯胺試劑僅能與嘌呤核苷酸中的脫氧核糖反嘌呤核苷酸中的脫氧核糖反 應(yīng)應(yīng). . 因此測(cè)定的可靠性受到不同來源的因此測(cè)定的可靠性受到不同來源的DNADNA中嘌呤中嘌呤 與嘧啶核苷酸比例變化的限制，為提高測(cè)定準(zhǔn)與嘧啶核苷酸比例變化的限制，為提高測(cè)定準(zhǔn) 確度，應(yīng)使用經(jīng)純化的其含磷量已知的小牛胸確度，應(yīng)使用經(jīng)純化的其含磷量已知的小牛胸 腺腺DNADNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行校正。作為標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行校正。 【注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)】 紫外吸收法測(cè)定紫外吸收法測(cè)定DNADNA純度（二）純度（二） 核酸在核酸在260nm260nm波長(zhǎng)處具有紫外吸收特性波長(zhǎng)處具有紫外吸收特性( (最大吸收峰最大吸收峰) )。此法快速、。此法快速、 簡(jiǎn)便，且不破壞樣品，是定量測(cè)定濃度較高的純簡(jiǎn)便，且不破壞樣品，是定量測(cè)定濃度較高的純DNADNA和和RNARNA溶液溶液 的首選方法。的首選方法。 高純度高純度DNADNA制品的制品的260nm260nm與與280nm280nm的吸光值在的吸光值在1.81.8左右左右，當(dāng)比值偏，當(dāng)比值偏 高時(shí)表明制品中混雜有高時(shí)