實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶課件

1、實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶1 實(shí)驗(yàn)二、酵母蔗糖酶的提取和實(shí)驗(yàn)二、酵母蔗糖酶的提取和 酶活測定酶活測定 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?n學(xué)習(xí)提取酵母蔗糖酶和測定酶活力的方法； n學(xué)習(xí)提取生物活性大分子的方法。 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶3 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 n材料：活性干酵母粉、石英砂； n試劑：95冰乙醇、DNS液、PBS（pH7.2）、 5蔗糖溶液、1N NaOH溶液； n儀器：水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、722型分光 光度計(jì)。 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶4 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 n蔗糖酶的提取過程和酶活的測定方法； n蛋白質(zhì)等生物活性大分子的提取方法。 （自學(xué)） 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶5 提取工藝和酶活測定 n蔗糖酶蔗糖酶

2、n蔗糖酶的耐熱溫度為50度，45度以下可保持酶活不變；在 pH3.08.0范圍內(nèi)均可保持較高的酶活； n蔗糖酶的活性中心有巰基，因此在提取時(shí)應(yīng)防止其被氧化， 或者加入還原劑（如Vc）保持酶活力； n酵母細(xì)胞存在兩種蔗糖酶，一種在細(xì)胞壁中，一種在細(xì)胞 質(zhì)內(nèi)，前者活力較高，分子量較大（約270KDa），后者活 力較低，分子量約為135KDa，兩種酶的底物專一性和動(dòng)力 學(xué)性質(zhì)十分相似，因此，本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶。 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶6 n提取工藝提取工藝 1. 破碎酵母細(xì)胞的方法：破碎酵母細(xì)胞的方法： 蔗糖酶分子量較大，一般采用研磨法徹底破碎 細(xì)胞使其釋放出來，但應(yīng)注意研磨過程中保持 低溫防止酶失活

3、； 或者采用自溶法（適當(dāng)?shù)乃岫群蜏囟认吕媒?母菌自身的酶系破壞細(xì)胞壁），此方法較為溫 和，但是時(shí)間較長，需加入少量防腐劑，防止 過程中外界細(xì)菌污染； 化學(xué)滲透法等較溫和的非機(jī)械法。 原則：原則：低溫，處理時(shí)間短，防止酶失活。 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶7 2. 選擇性熱變性：選擇性熱變性： 根據(jù)蔗糖酶的耐熱性質(zhì)，將熱不穩(wěn)定性雜蛋白變性除去， 而蔗糖酶保持活性仍在上清液中；該法簡便易行。 原則：原則：1、選擇合適的溫度和加熱時(shí)間，防止目的物變性， 2、溶液的蛋白質(zhì)濃度要合適，防止蔗糖酶與雜蛋白共沉淀。 3. 有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑沉淀法： 根據(jù)蔗糖酶的分子量和親水性，在溶液中加入一定量的無水乙醇溶 液

4、，利用其脫水作用，破壞了蛋白質(zhì)分子表面的水化膜，使蔗糖酶 聚集沉淀下來，而與其它雜質(zhì)分開。一般采用分級沉淀法摸索目的 物沉淀的條件。 原則：原則：1、注意在低溫下操作，故無水乙醇要預(yù)冷； 2、邊加乙醇邊攪拌溶液，防止局部乙醇過濃，導(dǎo)致酶變性失活； 3、離心后應(yīng)迅速將上清倒出，沉淀物用緩沖液溶解，避免酶與 有 機(jī)溶劑長時(shí)間接觸，防止其變性。 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶8 n測定酶活的原理測定酶活的原理 n蔗糖酶可作用于1，2糖苷鍵，將蔗糖水解為D葡 萄糖和D果糖； Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活劑，Mn2+ 是其抑制劑。 n葡萄糖和果糖具有還原性，在偏堿性條件下，可與3，5 二硝基水楊酸共

5、熱后生成棕紅色物質(zhì)，在一定濃度范 圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度成正比例關(guān)系。 n蔗糖酶的活力通過其水解生成的還原糖量來反映。 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶9 n提取酶注意事項(xiàng)提取酶注意事項(xiàng) n了解目的物的分子量、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性， 選擇合適的提取條件； n提取過程中采用緩沖液系統(tǒng)溶解酶，并可添加 一些保護(hù)劑（如還原劑、金屬螯合劑等）； n提取過程一般保持低溫、避免劇烈攪拌、強(qiáng)酸、 強(qiáng)堿等變性的因素； n一般先選擇分辨率低處理量大的方法（如萃取、 沉淀、吸附）濃縮酶，再采用分辨率高的方法 （如離子交換層析、親和層析、超濾）精制； 1.通過酶活測定，調(diào)節(jié)提取條件。 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶10 生物活性大分

6、子的提取方法 自學(xué)書P3641 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶11 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 n反復(fù)凍融法破碎酵母細(xì)胞反復(fù)凍融法破碎酵母細(xì)胞 稱取1g活性干酵母泥，0.2g石英砂，置于預(yù)冷的研缽中，研磨 至粉狀，加入5mLPBS（pH7.2），混合均勻，研磨5min ,20 度冷凍，再研磨5min； n離心獲得粗酶液離心獲得粗酶液 吸取約4mL酵母細(xì)胞破碎液于離心管中，8000rpm 5min，保 留上清液；粗酶液粗酶液 n分離純化獲得純酶液分離純化獲得純酶液 n吸取剩余的約2mL酵母細(xì)胞破碎液于離心管中，45度水浴 10min，緩慢攪拌，迅速冰浴冷卻， 12000rpm 5min，保留 上清液；選擇性熱變性除去雜

7、蛋白選擇性熱變性除去雜蛋白 n將上清液置于離心管中，加入等體積預(yù)冷的無水乙醇（乙醇終 濃度約50），20度靜置1520min，12000rpm 5min，保 留沉淀物；有機(jī)溶劑沉淀法獲得蔗糖酶有機(jī)溶劑沉淀法獲得蔗糖酶 1.每管加入1mLPBS（pH7.2）于沉淀物中，輕輕攪拌促溶； 純酶液純酶液 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶12 n酶活測定酶活測定 1.蔗糖酶將底物水解為還原糖蔗糖酶將底物水解為還原糖 試劑 （均（均35度預(yù)度預(yù) 熱）熱） 粗酶液組粗酶液組純酶液組純酶液組 測定組1對照組1測定組2對照組2 酶液（mL）1.01.01.01.0 1N NaOH 液（mL） 0.50.5 5%蔗糖液 （mL）

8、 2.02.02.02.0 35度水浴10min，自來水冷卻 1N NaOH 液（mL） 0.50.5 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶13 2、DNS法測定還原糖量法測定還原糖量 試劑粗酶液組純酶液組 測定組1對照組1測定組2對照組2 水解液 （mL） 1111 蒸餾水 （mL） 0.50.50.50.5 DNS液 （mL） 1.01.01.01.0 沸水浴5min，自來水冷卻，稀釋至10mL，以對照組調(diào)零以對照組調(diào)零，記 錄測定組OD540nm。 實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶14 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 n計(jì)算酶活力計(jì)算酶活力 將吸光值代入實(shí)驗(yàn)一葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到水解液中還原 糖的毫克數(shù) 酶活力（酶活力（U/mL）還原糖毫克數(shù)）還原糖毫克數(shù)3.5（水解液體積）（水解液體積） 蔗糖酶活力定義：蔗糖酶活力定義：在一定實(shí)驗(yàn)條件下，