雙波長和三波長分光光法解析PPT學習教案

1、會計學1 雙波長和三波長分光光法解析雙波長和三波長分光光法解析 1基本原理基本原理 第1頁/共33頁 第2頁/共33頁 BA BA AAA AAA 2 11 222 12 AAA BABA AAAAA 1122 第3頁/共33頁 BB AA 12 AA AAA 12 bc AA )( 12 (b) 12 12 AKAKS 第4頁/共33頁 ，則、和、 BABA AAAA 1122 BABA AKAKAKAKS 1122 1122 0 12 1 2 12 2 1 BB B B AKAK A A K K K 第5頁/共33頁 AA AKAKS 12 12 2. 雙波長分光光度計雙波長分光光度計 1

2、 11 11 lg s O Abc I I A 第6頁/共33頁 . 樣品池，6 . 光電倍增管 2 2 2 2 lg s O Abc I I A 第7頁/共33頁 bcAA I I A)(lg 121 2 1 2 第8頁/共33頁 3雙波長分光光度法的特點雙波長分光光度法的特點 雙波長分光光度法的特點具有如下的特點： 可進行渾濁試樣的分析。 通過適當?shù)牟ㄩL組合，可進行雙組合或三組合混合物的同時測定。 當波長相差12nm時，使雙波長同時掃描，可記錄一階導數(shù)光譜。 采用一波長固定，另一波長掃描，記錄吸收光譜?？上郎啙岜尘暗挠绊?。 采用雙筆記錄器，可記錄溶液中發(fā)生的兩種現(xiàn)象。 從原理上講，單波長

3、法（單光束和雙光束）和雙波長法的不同之處是：雙波長用二個單色器，得到二個不同波長的單色光，測量的是兩個波長處的吸光度差，使用一個吸收池，取消了參比池。 第9頁/共33頁 在單波長法中，僅用一個單色器，采用兩個吸收池，測量的是相對與參比溶液為零時待測組分的吸光度，由于試樣千變?nèi)f化，一般難于找到非常合適的參比，通常采用的參比，也只是近似的特別是當樣品溶液渾濁時，更難找到渾濁度與試樣完全一致的參比，當樣品溶液的吸光度很小時，兩個吸收池的位置 吸收池常數(shù)，污染情況以及參比溶液與樣品溶液組成上的差異使測量帶來較大的誤差。而在雙波長法中，則可完全避免這些誤差，而且由于記錄兩波長的信號差，光源電壓和外電源的

4、變化對測定無明顯的影響，從而提高了測量的精密度。 由于雙波長分光光度計光路結(jié)構(gòu)和電學線路較為復雜，儀器價格比較昂貴。 第10頁/共33頁 4. 雙波長法應用雙波長法應用 (1)雙組分同時測定 有些化學性質(zhì)相似的元素，可在一定條件下同時與一種顯色劑反應 ，生成的有色配合物吸收光譜相互重疊，相互干擾測定。由于它們的化學性 質(zhì)相似，一般難于找到合適的掩蔽劑來消除干擾影響。采用雙波長法，通過 適當?shù)牟ㄩL組合，就能順利地消除干擾影響，實現(xiàn)兩組分同時測定。 在有機化學、生物化學和藥物化學中，廣泛應用雙波長法作異構(gòu)體 或類似物的同時測定。 (2)單一組分測定中干擾組分影響的消除 當待測組分和共存組分吸收光譜

5、重疊，嚴重干擾待測組分時，采用 雙波長法可消除干擾組分的影響，提高測定的準確度。 (3). 雙波長法作背景吸收和渾濁干擾的消除雙波長法作背景吸收和渾濁干擾的消除 在分光光度法分析中，有些顯色劑或顯色體系，在測定條件下，由 于背景吸收較大產(chǎn)生的誤差顯著的降低了測定的準確度，并使方法的測定受 到限制。 用雙波長法能在一定程度上消除渾濁背景的干擾，進行混濁樣品分 析。在生物化學和臨床醫(yī)學上，渾濁樣品較多，雙波長法應用更為廣泛。 第11頁/共33頁 1基本原理基本原理 三波長法原理圖 如圖所示，在任一吸收曲線上，可以在任意選擇的三個波長處測量吸光度。根據(jù)三角形和三角形相似，可推導出在上述三個波長處測量

6、的吸收度具有下列函數(shù)關(guān)系： 第12頁/共33頁 式中，m和n分別表示(2 -1)和(3 -2)的數(shù)值。1、2和3分別為待測物在三波長處的摩爾吸光系數(shù)；C為待測物的摩爾濃度；b為光程。方程中的系數(shù) 可預先求得，A值與待測物濃度成正比，因而可通過曲線求出樣品中待測組分的含量。 從上圖可知，如選擇的三個波長相應于吸收曲線上三點處于一條直線上，則測得的值為零。因此，當干擾組分的吸收光譜為一直線（如渾濁產(chǎn)生的干擾），則在任選的三個波長處測定，測得的值與干擾物濃度無關(guān)，如果干擾物為一吸收曲線，只要在曲線上找到處在一條直線上的三點，在此三點相應的波長處測定，由于干擾物在此三波長處的值為零，故測得的只與待測組

7、分的濃度有關(guān)。 第13頁/共33頁 當干擾組分的吸收曲線表現(xiàn)為 雙峰時，即可運用三波長法選擇合 適的三個波長使其A為零，如右圖 所示。 但是通常情況下，干擾組分的 波形較為復雜，很少呈現(xiàn)雙峰形狀， 而單峰波形則比較普遍，這就限制 了三波長法的應用范圍。為解決這 一問題，可引入“零點”作為第三 波長點，即在吸收曲線的端點附近 的基線上，選擇一個波長點作為3， 如下頁圖中的P點，它所對應的吸光 度為零。 從而使三波長法更具普遍性，消除具有任何峰形吸收曲線干擾組分的影響。 三波長法消除干擾示意圖 第14頁/共33頁 與雙波長法相比較，三波長法能更有效地消除散射干擾物的影響，因而更適合于渾濁樣品分析；

8、此外，對吸收干擾物，如果在它的吸收光譜上找不到合適的等吸光度點，用一般分光光度計就難于進行雙波長測定，而用三波長法就可順利完成測定。 零點法原理示意圖 第15頁/共33頁 2三個波長的選擇三個波長的選擇 (1) 等吸光度點法 如果在干擾組分的吸收光譜上能找到三個等吸光度點，且在 此三波長處測得的待測組分值較大，則可用本法。在用氨基C酸偶氮 氯膦測定稀土和鈧的混合物中的鈧時，用此法選擇三個波長。 (2) 計算法 應用等吸光度點法選擇三個測定波長比較方便，但并不是任 何干擾組分的吸收光譜都可找到三個等吸光度點，或者測得的值大 小。 第16頁/共33頁 因此，必須有一種通用的方法，即計算法。在這種方

9、法中，可根據(jù)情況任選 ，由作圖法找到近似波長，然后通過式（3-2）計算使之為零以確定。 3三波長法的分析應三波長法的分析應 用用 三波長法在藥物分析中有較廣泛的應用。安鈉加注射液含有跏啡因和苯 甲酸鈉，在0.1N鹽酸介質(zhì)中兩種組分的吸收光譜相互重疊，采用三波長法可 同時測定上述兩組分，消除相互間的干擾，測定苯甲酸鈉的三個波長為： 272.0，288.0，247.6。復方氨基比林注射液含有氨基比林，安替匹林和巴 比妥，在酸性溶液中，巴比妥在230以上無吸收，而氨基比林和安替匹林則 有較強的吸收，但相互重疊，用三波長法，可在巴比妥存在下直接測定氨 基比林注射液中氨基比林和安替匹林含量。 在實際工作

10、中，三波長法中的波長選擇和計算比單波長法麻煩而費時，但 測定的準確度、精密度比解聯(lián)立方程組分析混合組分的方法高。隨著計算機 技術(shù)的普及，用電子計算機控制的分光光度計的廣泛應用，已設(shè)計出三波長 法的專用計算程序，島津UV-240、UV-260型雙光束紫外-可見分光光度計就 是具有這種功能的儀器?？蓪悠啡芤褐?待 測 組 分 的 三 波 長 自 動 測定并進行結(jié)果計算，操作簡便快速。 第17頁/共33頁 在分光光度分析中引入導數(shù)技術(shù)，擴展了分光光度法的應用范圍，在多組分同時測定、渾濁樣品分析、消除背景干擾和加強光譜的精細結(jié)構(gòu)以及復雜光譜的辨析等方面，導數(shù)分光光度法在一定程度上解決了普通分光光度法

11、難于解決的問題。導數(shù)光譜最大的優(yōu)點是分辨率得到了很大的提高：(1) 能夠分辨兩個或兩個以上完全重疊或以很小波長差相重疊的吸收峰；(2) 能夠分辨吸光度隨波長急劇上升時所掩蓋的弱的吸收峰；(3) 能夠確認寬闊吸收帶的最大吸收波長。 一. 基本原理 lcA d d cl d dA n n n n d d cl d Ad 第18頁/共33頁 第19頁/共33頁 描述導數(shù)曲線的方程式可由朗伯-比爾耳定律推出。 式（1）中I0，I分別為入射光強度和透射光強度，為摩爾吸光系數(shù)，為吸收池厚度，C為待測組分濃度。假定入射光強度在整個波段范圍內(nèi)保持定值，對式（1）作一次微分處理得到一階導數(shù)方程， 式（2）中，I

12、和是波長的函數(shù)，I的一階導數(shù)值與濃度成線性關(guān)系。靈敏度（一階導數(shù)值的大?。Q定于摩爾吸光系數(shù)對波長的變化率，最大時，靈敏度最大。 對式（1）作二次微分處理，得 第20頁/共33頁 從式（3）可知，當時，I的二階導數(shù)值與濃度呈線性關(guān)系。同理，對式（6.1）作三次和四次微分處理得： 第21頁/共33頁 從式（4）可知，對三階導數(shù)， =0時，I的三階導數(shù)值與濃度成正比；對四階導數(shù)，則必須滿足 =0和 =0兩個條件，才能使四階導數(shù)與濃度成正比。這就為我們利用導數(shù)光譜做定量分析時，正確選擇波長提供理論依據(jù)。在通常情況下，四階導數(shù)即可獲得極佳的分辨率，并保持較高的信噪比，因此在采用導數(shù)分光光度法測定時，導

13、數(shù)的階數(shù)一般選擇n 4。 二獲得導數(shù)光譜的方法二獲得導數(shù)光譜的方法 第22頁/共33頁 (1) 人工作圖法：從吸收光譜的數(shù)據(jù)中每隔一個波長小間隔（12nm），逐點計算出A/的值： 利用這些數(shù)值對波長描繪成圖像，就得一階導數(shù)光譜。用類似方法又可從導數(shù)光譜中獲得高一階的導數(shù)光譜。 (2) 儀器掃描法：用雙波長分光光度計以固定（12nm）的兩束單色光同時掃描記錄樣品對兩束光吸光度的差值A(chǔ)，便得到樣品的一階導數(shù)光譜。 帶有微處理機的分光光度計，利用它的記憶和處理數(shù)據(jù)的功能，可直接存儲吸收光譜的數(shù)據(jù)并加以處理，可描述一階、二階等各階的導數(shù)光譜。 ii ii i AAA 1 1 第23頁/共33頁 無論干

14、擾組分吸收曲線形狀如何，都可以用一個近似的無論干擾組分吸收曲線形狀如何，都可以用一個近似的冪級數(shù)冪級數(shù)來表示來表示 4 4 3 3 2 2102 bbbbbA 根據(jù)吸光度加合性原理，兩組分共存時，有下式根據(jù)吸光度加合性原理，兩組分共存時，有下式 4 4 3 3 2 21021 bbbbbclAAA 3 4 2 321 432 bbbb d d cl d dA 其一階導數(shù)為其一階導數(shù)為 2 432 2 2 2 2 1262 bbb d d cl d Ad 其二階導數(shù)為其二階導數(shù)為 第24頁/共33頁 當干擾組分為一次吸收曲線時，當干擾組分為一次吸收曲線時， 1 1 1 b d dA b d d

15、cl d dA 說明一階說明一階 導數(shù)可以導數(shù)可以 消除線形消除線形 干擾吸收干擾吸收 當干擾組分為一次吸收曲線時，當干擾組分為一次吸收曲線時， 2 2 1 2 2 2 2 2 2 22b d Ad b d d cl d Ad 說明二階導數(shù)可說明二階導數(shù)可 消除二次干擾吸消除二次干擾吸 收收 三導數(shù)光譜的測量方法及影響因素三導數(shù)光譜的測量方法及影響因素 導數(shù)輸出信號與待測組分的濃度有現(xiàn)性關(guān)系是定量分析的基礎(chǔ)。實際工作中是通過對導數(shù)曲線的測量來確定導數(shù)值，常用于測量導數(shù)值的方法有以下幾種。 1. 切線法 對相鄰兩峰（谷）作切線，測量兩峰間的谷（峰）至切線間的距離（圖中的b線）此法適合于有線性背景

16、的情況，只要基線平直，不論其是否傾斜，都能得到正確的結(jié)果。 第25頁/共33頁 2. 峰-峰法 通過測量相鄰峰谷間的距離來進行定量分析（圖中的a或c線），這是最常用的方法，靈敏度高。也可測量相鄰峰值比的方法，如圖中a/c值，又稱峰-峰比法。 3. 峰-零法 在基線平直條件下，測量峰至基線間的距離，如圖中的d線。此法靈敏度較低，但選擇性較好，測量精度較高。 4. 面積法 根據(jù)一階或二導數(shù)吸收曲線的面積正比于待測組分的濃度以進行定量分析。 第26頁/共33頁 不同的微分方法，其影響因素不完全相同。電子計算機的數(shù)值微分法，主要 影響因素是微分階數(shù)，和半峰寬；電子模擬微分法的主要影響因素是時間常 數(shù)、

17、掃描速度和半峰寬；實際工作中，必須根據(jù)待測組分的吸收譜帶，恰好 地選擇微分階次、各種儀器參數(shù)，以獲得最好的靈敏度、分辨率和最佳信噪 比。 四導數(shù)分光光度法的分析應用四導數(shù)分光光度法的分析應用 1多組分同時測定 常規(guī)分光光度法對多組分同時測定是一個比較困難的課題，導數(shù)分光光 度法對重疊吸收帶有較好的分辨能力，可簡單、快速地實現(xiàn)多組分的同時測定 。 2痕量分析 采用高靈敏有機顯色劑和導數(shù)分光光度法相結(jié)合，將成為痕量分析的有力 工具，采用具有信號放大功能的模擬微分回路裝置和高靈敏顯色劑，可使分光 光度法的靈敏度提高23個數(shù)量級。 3渾濁試樣分析 4有機化合物異構(gòu)體的分析 5藥物及臨床分析 第27頁/共33頁 應用應用1: 一階導數(shù)分光光度法測定水中微量鋁一階導數(shù)分光光度法測定水中微量鋁 第28頁/共33頁 應用應用2: 二階導數(shù)光譜峰面積積分法測定蘆二階導數(shù)光譜峰面積積分法測定蘆 薈中薈中 痕量痕量Fe()和和Co() 第29頁/共33頁 第30頁/共33頁 應用應用3: 多波長線性回歸導數(shù)分光光度法測定對苯二酚多波長線性回歸導數(shù)分光光度法測定對苯二酚 、領(lǐng)苯二酚和