聚合酶鏈反應(yīng)

1、如果您需要使用本文檔，請(qǐng)點(diǎn)擊下載按鈕下載!核酸擴(kuò)增 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)由美國(guó)Centus公司的Kary Mullis發(fā)明，于1985年由Saiki等在Science雜志上首次報(bào)道，是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的體外快速擴(kuò)增DNA的技術(shù)。通過(guò)PCR可以簡(jiǎn)便、快速地從微量生物材料中以體外擴(kuò)增的方式獲得大量特定的核酸，并且有很高的靈敏度和特異性，可在動(dòng)物檢疫中用于微量樣品的檢測(cè)。1. PCR的基本原理和過(guò)程PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧單核苷酸存在的條件下依賴(lài)于耐高溫的DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR以欲擴(kuò)增的DNA做為模板，以和模板正鏈和負(fù)鏈末端

2、互補(bǔ)的兩種寡聚核苷酸做為引物，經(jīng)過(guò)模板DNA變性、模板引物復(fù)性結(jié)合、并在DNA聚合酶作用下發(fā)生引物鏈延伸反應(yīng)來(lái)合成新的模板DNA。模板DNA變性、引物結(jié)合(退火)、引物延伸合成 DNA這三步構(gòu)成一個(gè)PCR循環(huán)。每一循環(huán)的DNA產(chǎn)物經(jīng)變性又成為下一個(gè)循環(huán)的模板 DNA。這樣，目的的DNA的數(shù)量將以2n -2n的形式累積，在2小時(shí)內(nèi)可擴(kuò)增30(n)個(gè)循環(huán)， DNA量達(dá)原來(lái)的上百萬(wàn)倍。PCR三步反應(yīng)中，變性反應(yīng)在高溫中進(jìn)行，目的是通過(guò)加熱使DNA雙鏈解離形成單鏈；第二步反應(yīng)又稱(chēng)退火反應(yīng)，在較低溫度中進(jìn)行，它使引物與模板上互補(bǔ)的序列形成雜交鏈而結(jié)合上模板；第三步為延伸反應(yīng)，是在4種dNTP底物和Mg2

3、+ 存在的條件下，由DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈的延伸反應(yīng)。通過(guò)高溫變性、低溫退火和中溫延伸3個(gè)溫度的循環(huán)，模板上介于兩個(gè)引物之間的片段不斷得到擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)凝膠電泳、Southern雜交或DNA序列分析進(jìn)行檢測(cè)。2.PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)系統(tǒng)的組成(1) 反應(yīng)條件PCR反應(yīng)通過(guò)三種溫度的交替循環(huán)來(lái)進(jìn)行，一般94變性30秒，55退火 30秒，70-72延伸30-60秒，依此條件進(jìn)行30次左右的循環(huán)。(2) PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系一般選用50-100l體積，其中含有：50mmol/L KCl，10mmol/L Tris.HCl(室溫，pH8.3)，1.5mmo

4、l/L MgCl2明膠或牛血清白蛋白(BSA)，2種引物，各0.25(mol/L，4種脫氧核糖核苷酸底物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)各200( mol/L，模板 DNA 0.1(g，TaqDNA聚合酶2.5iu。3.PCR基本操作一個(gè)典型的PCR反應(yīng)可按以下步驟進(jìn)行:(1) 將下列成分依序加入0.5ml滅菌離心管中并混勻:滅菌雙蒸水30l10擴(kuò)增緩沖液10l4種dNTP混合物，每種濃度為1.25mmol/L 16l引物15l(100pmol)1 / 6如果您需要使用本文檔，請(qǐng)點(diǎn)擊下載按鈕下載!引物25l(100pmol)模板DNA2l加滅菌雙蒸水至終體積100l2 / 6如果您需

5、要使用本文檔，請(qǐng)點(diǎn)擊下載按鈕下載!(2) 置94加熱5分鐘；(3) 將0.5l Taq DNA聚合酶(5iu/l)加入反應(yīng)混合液中；(4) 將100l輕礦物油加入混合液表面，以防水分蒸發(fā)；(5) 按所設(shè)定的反應(yīng)條件進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)（在PCR儀上進(jìn)行）；(6) 反應(yīng)終止后，取樣品進(jìn)行凝膠電泳，Southern雜交或DNA序列分析以鑒定是否得到特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。4.PCR衍生技術(shù)PCR可擴(kuò)增雙鏈DNA和單鏈DNA，并能以RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR以擴(kuò)增cDNA。經(jīng)不斷發(fā)展和完善，已有多種衍生PCR技術(shù)。除反轉(zhuǎn)錄PCR外，尚有不對(duì)稱(chēng)PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、著色互補(bǔ)PCR、免疫PCR

6、和套式PCR等。(1) 反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RTPCR)RTPCR用于擴(kuò)增RNA樣品。在PCR體系中先引入反轉(zhuǎn)錄酶，將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA做為PCR的模板，加入引物和Taq DNA聚合酶按正常PCR方式擴(kuò)增 cDNA。這一技術(shù)廣泛應(yīng)用于RNA和RNA病毒的檢測(cè)。(2) 錨定PCR(Anchored PCR)通常進(jìn)行的PCR試驗(yàn)必須知道欲擴(kuò)增DNA或RNA片段兩側(cè)的序列，并以此為依據(jù)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR。當(dāng)欲擴(kuò)增的片段序列未知時(shí)，可通過(guò)錨定PCR進(jìn)行擴(kuò)增。其基本方法是分離細(xì)胞總RNA或mRNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移

7、酶在cDNA 3端加上同源多聚物poly(dG)尾，通過(guò)與其互補(bǔ)的錨定引物poly(dC)來(lái)保證擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。(3) 反向PCR(Inverse PCR)常規(guī)PCR是擴(kuò)增兩個(gè)已知序列之間的DNA片段，反向PCR則用于擴(kuò)增位于已知序列兩側(cè)的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段環(huán)化，再用限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)已知序列，這樣線性化后原位于已知序列兩側(cè)的未知序列變?yōu)槲挥谝阎蛄兄g，再經(jīng)常規(guī)PCR操作就可大量擴(kuò)增未知序列。(4) 不對(duì)稱(chēng)PCR(Asymmetric PCR)不對(duì)稱(chēng)PCR又稱(chēng)單鏈擴(kuò)增PCR。一般PCR反應(yīng)中兩種引物的量是相等的，不對(duì)稱(chēng)PCR中，兩種引物的量相差懸殊，一般為

8、50:1-100:1，這樣在生成一定數(shù)量的雙鏈產(chǎn)物后，較少的引物就會(huì)被用完，大量生成一條單鏈的DNA，分離單鏈即可直接進(jìn)行序列分析等研究。(5) 多重PCR(Multiplex PCR)應(yīng)用PCR技術(shù)可檢測(cè)特定序列的存在或缺失。某些疾病的基因片段較長(zhǎng)，且常有多處發(fā)生缺失或突變，用一對(duì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，擴(kuò)增不到目的片段，此時(shí)就須使用多重PCR技術(shù)。在同一反應(yīng)管中加入多對(duì)引物，擴(kuò)增同一模板的多個(gè)區(qū)域。如果某一片段缺失，或擴(kuò)增該片段的引物與被檢核酸同源性太低，則在相應(yīng)的電泳圖譜上就無(wú)相應(yīng)的正常片段出現(xiàn)，但可保證其他特異片段出現(xiàn)。目前報(bào)道的多重PCR反應(yīng)，最多可同時(shí)擴(kuò)增12條區(qū)帶。當(dāng)然，也可設(shè)計(jì)兩

9、對(duì)引物，分兩次進(jìn)行常規(guī)PCR。(6) 著色互補(bǔ)PCR(Colour complementation assay)著色互補(bǔ)PCR又稱(chēng)熒光PCR(Fluroscent PCR)。其原理是用不同的熒光染料分別標(biāo)記不同的寡核苷酸引物，通過(guò)多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。反應(yīng)結(jié)束后除去多余引物，擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外線照射下能顯示某一種或幾種熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶缺失，則會(huì)缺乏相應(yīng)的顏色。通過(guò)顏色的有無(wú)及其組合可很快診斷基因的缺失、有較大變異或發(fā)現(xiàn)某些感染的病毒基因等。這一技術(shù)為PCR技術(shù)的臨診自動(dòng)化診斷打下了基礎(chǔ)。(7) 免疫PCR免疫PCR即免疫多聚酶鏈反應(yīng)(ImmunoPCR)，它是將高

10、度靈敏的PCR技術(shù)與特異的免疫學(xué)方法相結(jié)合的一種新型的診斷技術(shù)，是目前最有希望的診斷方法。它的原理是通過(guò)應(yīng)用一個(gè)對(duì)DNA和抗體具有雙重結(jié)合活性的聯(lián)接分子使二者聯(lián)接起來(lái)，這樣就可以使作為指示系統(tǒng)的DNA分子通過(guò)抗體而特異性地結(jié)合到抗原上，從而形成一種特異性“抗原抗體DNA復(fù)合物”，再通過(guò)對(duì)其中已知片段DNA的PCR擴(kuò)增，即可證明抗原存在與否。這種方法的特點(diǎn)在于： 通過(guò)免疫捕獲作用純化檢測(cè)對(duì)象； 用于檢測(cè)的微生物無(wú)需事先明確其核酸序列； 該方法也適用于微生物以外的抗原檢測(cè)，其前提條件是被檢測(cè)對(duì)象具有良好的抗原性，并且備有其相對(duì)應(yīng)的抗體； 無(wú)需根據(jù)不同對(duì)象設(shè)計(jì)不同的引物。被聯(lián)接的已知片段DNA相當(dāng)于

11、指示劑，無(wú)論檢測(cè)對(duì)象是什么，只需合成針對(duì)這段DNA的引物即可； 省去了普通PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，即增加了靈敏度又降低了實(shí)驗(yàn)成本。這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明者Sano，T.(1992)等的試驗(yàn)表明，免疫PCR的靈敏度比ELISA方法高10萬(wàn)倍，足以檢測(cè)出單個(gè)抗原分子。(8) 套式PCR(Nested PCR)普通PCR的產(chǎn)物DNA往往需要再擴(kuò)增，以便對(duì)之進(jìn)行進(jìn)一步鑒定、分子克隆或用作其他用途。此時(shí)，由于DNA產(chǎn)物的末端效應(yīng)，用原來(lái)的那對(duì)引物難以實(shí)現(xiàn)再擴(kuò)增的目的。如果在原來(lái)的引物內(nèi)側(cè)重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物，再進(jìn)行新一輪PCR，則很容易獲得更大量的DNA產(chǎn)物。如果需要，還可再進(jìn)一步擴(kuò)增，但每次需要在上

12、一次產(chǎn)物的內(nèi)側(cè)重新設(shè)計(jì)引物。這種采用多對(duì)成套引物，逐步擴(kuò)增DNA內(nèi)側(cè)片段的PCR就稱(chēng)為套式PCR。目前很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室為了各自的研究需要都在應(yīng)用這一技術(shù)。5.PCR技術(shù)的用途(1) 傳染病的早期診斷和不完整病原檢疫在早期診斷和不完整病原檢疫方面，應(yīng)用常規(guī)技術(shù)難于得到確切結(jié)果，甚至漏檢，而用PCR技術(shù)可使未形成病毒顆粒的DNA或RNA或樣品中病原體破壞后殘留核酸分子迅速擴(kuò)增而測(cè)定，且只需提取微量DNA分子就可以得出結(jié)果。(2) 快速、準(zhǔn)確、安全檢測(cè)病原體用PCR技術(shù)不需經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)和富集病原體，一個(gè) PCR反應(yīng)一般只需幾十分鐘至2小時(shí)就可完成。從樣品處理到產(chǎn)物檢測(cè)，一天之內(nèi)可得出結(jié)果。由于P

13、CR對(duì)檢測(cè)的核酸有擴(kuò)增作用，理論上既使僅有一個(gè)分子的模板，也可進(jìn)行特異性擴(kuò)增，故特異性和靈敏度都很高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)，包括核酸雜交技術(shù)。PCR可檢出 fg水平的DNA，而雜交技術(shù)一般在pg水平。PCR技術(shù)適用于檢測(cè)慢性感染、隱性感染，對(duì)于難于培養(yǎng)的病毒的檢測(cè)尤其適用。由于PCR操作的每一步都不需活的病原體，不會(huì)造成病原體逃逸，在傳染病防疫意義上是安全的。(3) 制備探針和標(biāo)記探針PCR可為核酸雜交提供探針和標(biāo)記探針。方法是： 用PCR直接擴(kuò)增某特異的核酸片段，經(jīng)分離提取后用同位素或非同位素標(biāo)記制得探針。 在反應(yīng)液中加入標(biāo)記的dNTP，經(jīng)PCR將標(biāo)記物摻入到新合成的DNA鏈中，從而制得放

14、射性和非放射性標(biāo)記探針。(4) 在病原體分類(lèi)和鑒別中的應(yīng)用用PCR技術(shù)可準(zhǔn)確鑒別某些比較近似的病原體，如藍(lán)舌病病毒與流行性出血熱病毒，牛巴貝斯蟲(chóng)，二聯(lián)巴貝斯蟲(chóng)等。PCR結(jié)合其它核酸分析技術(shù)，在精確區(qū)分病毒不同型、不同株、不同分離物的相關(guān)性方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可從分子水平上區(qū)分不同的毒株并解釋它們之間的差異。此外，PCR技術(shù)還廣泛應(yīng)用于分子克隆、基因突變、核酸序列分析、癌基因和抗癌基因以及抗病毒藥物等研究中。6.PCR技術(shù)應(yīng)用概況從誕生至今約十年的時(shí)間里，PCR技術(shù)已在生物學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。將PCR技術(shù)用于動(dòng)物傳染病的檢疫研究也日趨廣泛。例如，新西蘭農(nóng)漁部質(zhì)量管理機(jī)構(gòu)所屬動(dòng)物健康實(shí)驗(yàn)室(

15、AHLS)負(fù)責(zé)對(duì)各種外來(lái)病的疫情監(jiān)測(cè)診斷，該室在1992年建立了幾項(xiàng)PCR檢測(cè)技術(shù)，包括從結(jié)核病病灶中快速檢測(cè)牛分枝桿菌；快速檢測(cè)患病牛羊中副結(jié)核分枝桿菌；檢測(cè)惡性卡它熱和新城疫等。自1990年始，將PCR應(yīng)用于動(dòng)物傳染病的診斷等研究的報(bào)道，可歸納如下:(1) 快速診斷各類(lèi)病毒病用PCR成功進(jìn)行檢測(cè)的動(dòng)物傳染病病毒有：藍(lán)舌病病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛白血病病毒、馬鼻肺炎病毒、惡性卡他熱病毒、偽狂犬病病毒、狂犬病病毒。非洲豬瘟病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、禽傳染性喉氣管炎病毒、馬傳染性肺炎病毒、馬立克氏病毒、牛冠狀病毒、魚(yú)傳染性造血器官壞死病病毒、輪狀病毒、水道貓魚(yú)病病毒、水貂阿留申病

16、病毒、山羊關(guān)節(jié)腦炎病毒、梅迪維斯納病毒、豬細(xì)小病毒等。(2) 由其它病原體引起的傳染性疾病的研究目前已報(bào)道的有致病性大腸桿菌毒素基因、牛胎兒彎曲桿菌、牛分枝桿菌、炭疽桿菌芽孢、鉤端螺旋體、牛巴貝斯蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)等的PCR檢測(cè)研究。在食品微生物的檢測(cè)中，PCR技術(shù)的應(yīng)用也日趨廣泛。Hornes等(1991)采用一種固相比色PCR技術(shù)成功檢測(cè)了大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素 (STs)Ia(STIa)和Ib(STIb)基因。5 / 6如果您需要使用本文檔，請(qǐng)點(diǎn)擊下載按鈕下載!(二) 連接酶鏈反應(yīng)在連接酶的作用下兩段寡核苷酸能通過(guò)形成磷酸二酯鍵而連接形成較長(zhǎng)的核酸片段。連接酶鏈反應(yīng)(Ligase Chain Re

17、action，LCR)技術(shù)基于如下原理：在65，由于熱穩(wěn)定連接酶的作用，兩段與模板正確雜交的寡核苷酸能連接形成新的較長(zhǎng)的核酸片段。通過(guò)高溫變性、適溫退火和連接三步一循環(huán)的反應(yīng)，新形成的靶核酸片段成為下一循環(huán)的模板而使反應(yīng)延續(xù)，這樣，擴(kuò)增產(chǎn)物將象PCR一樣呈指數(shù)遞增。LCR反應(yīng)體系需采用4個(gè)寡聚核苷酸引物，其中兩個(gè)與模板正鏈結(jié)合，另兩個(gè)與負(fù)鏈相結(jié)合。引物長(zhǎng)約1520bp，故LCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)約3040bp。由于擴(kuò)增產(chǎn)物較短，循環(huán)反應(yīng)中的變性溫度一般應(yīng)比常規(guī)PCR要低。熱穩(wěn)定連接酶分離自嗜熱細(xì)菌，它能精確識(shí)別與模板正確雜交的寡核苷酸引物。由于堿基誤配而雜交上模板的非特異引物將不能起連接反應(yīng)。與PCR

18、相比較，LCR中非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的幾率很低，有資料表明，經(jīng)過(guò)5070個(gè)LCR循環(huán)，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物未有明顯增長(zhǎng)，這樣，可保證反應(yīng)的高度敏感性和特異性。LCR已應(yīng)用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒、結(jié)核分枝桿菌等病原體。目前，LCR的應(yīng)用范圍遠(yuǎn)不如 PCR廣泛，但LCR與PCR相結(jié)合，可有效解決分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一些問(wèn)題，如啟動(dòng)子等小片段核酸的克隆等。(三) Q復(fù)制酶技術(shù)Q復(fù)制酶是Q噬菌體產(chǎn)生的一種依賴(lài)于RNA的RNA聚合酶。該酶于1963年由 Haruna和Weissmann等人發(fā)現(xiàn)并命名。Q復(fù)制酶能以某些單鏈RNA為模板，在體外大量復(fù)制單鏈RNA。該酶有嚴(yán)格的模板特異性，能在體外充當(dāng)Q復(fù)制酶模板的所有RNA分子均含大量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且模板和產(chǎn)物RNA必須能在復(fù)制過(guò)程中形成穩(wěn)定的分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)。Lizardi及其合作者(1988)發(fā)現(xiàn)，在Q復(fù)制酶的天然模板MDV-1 RNA中插入一段瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)的特異序列后，所形成的重組RNA片段仍可做為模板被Q復(fù)制酶大量擴(kuò)增。經(jīng)37反應(yīng)半小時(shí)，可在模板含量最低的反