最新高效人抗利尿激素血管加壓素精氨酸加壓素酶.doc

1、最新高效人抗利尿激素血管加壓素精氨酸加壓素（ADHVPAVP）酶本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號：CSB-E09080h 最低檢測限： 1.95 pg/ml檢測范圍:7.8 pg/ml - 500 pg/ml特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人ADH,且與其他相關(guān)蛋白無 交叉反應(yīng)。有效期：6個月預(yù)期應(yīng)用：含量。ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中ADH說明1. 試劑盒保存：-20C （較長時間不用時）；2-8C （頻繁使用時）。2. 濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。3. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。4. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含

2、有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實 驗結(jié)果造成任何影響。實驗原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗ADH抗體的微孔中 依次加入標本或標準品、生物素化的抗ADH抗體、HRP標記的親和素，經(jīng) 過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色， 并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ADH呈正相關(guān)。 用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。酶聯(lián)板(Assay plate )：標準品(Standard)：樣品稀釋液(Sample Diluent)：生物素標記抗體稀釋液(Biotln-antibocly Diluent)：一塊(96孔

3、)。2瓶(凍干品)。1x20ml/瓶。lx 10ml/瓶。5.辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液(HRP-avidin Diluent)lx 10ml/瓶。生物素標記抗體(Biotln-antibody)：1x1201/瓶(1： 100)。7.辣根過氧化物酶標記親和素(HRP.avidin)：1x1201/瓶(1 ： 100)。底物溶液(TMB Substrate)：1x10ml/瓶。9. 濃洗滌液(Wash Buffer)： 1x20ml/瓶，使用時每瓶用蒸憎水稀釋25倍。10. 終止液(Stop Solution)：1x10ml/瓶(2N H2S04)o需要而未提供的試劑和器材1. 標準規(guī)格酶

4、標儀2. 高速離心機3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 干凈的試管和Eppendof管5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器6. 蒸館水，容量瓶等標本的采集及保存1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4C過夜后于1000g離心20分鐘， 取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?0C或-80C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2. 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2-8C 1000 g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20C或-80C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。標本的稀釋原則:首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致

5、含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。 只有稀釋至標準曲線的范圉內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中，應(yīng) 做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了“hr倍，標本的濃度應(yīng)再乘以-n”。標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至lml,蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為500 pg/ml,做 系列倍比稀釋后,分別稀釋 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.2 pg/ml, 15.6 pg/ml, 7.8 pg/ml,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml, 臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制250 pg/ml標準品：取0

6、5ml （不要少于05ml） 500 pg/ml的上述標準 品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所 需的總量配制（每孔lOOpl）,實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2mlo如10pl生物素 標記抗體加990卩1生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前 一小時內(nèi)配制。辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則:臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先汁算好的 每次實驗所需的總量配制（每孔100（.11）,實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2mlo如

7、 10Ml辣根過氧化物酶標記親和素加990卩1辣根過氧化物酶標記親和素稀釋 液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。操作步驟實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻 時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品 稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。I. 加樣：分別設(shè)空口孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00卩1, 余孔分別加標準品或待測樣品loom，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于 酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜， 37C反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。2

8、. 弄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100Ml （取1卩1 生物素標記抗體加99pl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻， 在使用前一小時內(nèi)配制），37C,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘， 200卩1/每孔，甩干。4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100卩1, 37C, 60 分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘， 200（11/每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90pl, 37C避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標 準品的前3-4孔有明顯的梯

9、度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50卩1,終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加 入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底 物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。&用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后 15分鐘以內(nèi)進行檢測。實驗備注1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到 管底。2. 每次實驗留一孔作為空口調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶 液及2N H2S04o測量時先用此孔調(diào)OD值至零。3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上 蓋或覆膜。

10、4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8C保存。標準品、生物素標記抗體 工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請 勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液、或辣根過氧化物 酶標記親和素工作液。5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。洗板方法 手丄洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體：在實驗臺上 鋪墊兒層吸水紙，酶標板朝下用力拍兒次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對 數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值山標準曲線查出相應(yīng)的濃度； 再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方 程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即 為樣品的實際濃度。注意事項1. 本操作說明適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。2. 當混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。3. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假