乙型肝炎病毒的相關(guān)檢驗指標(biāo)研究進展

1、乙型肝炎病毒的相關(guān)檢驗指標(biāo)研究進展 乙型肝炎病毒的相關(guān)檢驗指標(biāo)研究進展 【中圖分類號】R512.605 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1672-3783(2021)06-0154-02 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬正嗜肝DNA病毒，其基因組DNA為松弛環(huán)狀DNA(relayed circular DNA，rcDNA)，進入肝細胞核后轉(zhuǎn)換為共價閉合環(huán)狀DNA(covalenly closed circular DNA，cccDNA)。HBV cccDNA是信使RNA(messenger RNA，mRNA)和前基因組RNA(pregenome RNA，pgRNA)合

2、成的模板，在整個自然病程中持續(xù)存在【1】。人們被HVB感染引起的乙型肝炎(簡稱乙肝)是發(fā)病率最高的傳染病之一。目前經(jīng)過獻血員篩查和疫苗接種等預(yù)防措施在一定程度上能夠降低乙肝發(fā)病率，但現(xiàn)在全世界仍有3億HBV感染者。現(xiàn)對HBV相關(guān)檢驗指標(biāo)進行總結(jié)如下： 1 HBV DNA 1.1 HBV DNA的特性:HBV DNA是HBV存在及復(fù)制的標(biāo)志，對協(xié)助臨床診斷HBV感染現(xiàn)狀以及抗病毒治療療效觀察等均有重要的意義。以前HBV DNA和DNA-P(具逆轉(zhuǎn)錄活性的DNA多聚酶)檢測在臨床應(yīng)用十分廣泛，現(xiàn)在已完全被更敏感、快速的聚合酶鏈反響(polymerase chain reaction，PCR)所代替

3、【2】。 1.2 HBV DNA的檢查方法:二十世紀8090年，PCR技術(shù)因其敏感、特異、快速而得以廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物檢測采用電泳法，電泳過程中溴化乙啶插入雙鏈DNA，經(jīng)紫外光激發(fā)產(chǎn)生熒光，DNA含量為1ng時即可檢出。定性PCA的敏感度那么提高至10fg/mL，為前者的100倍；現(xiàn)在應(yīng)用的抗病毒藥物如核苷類似物-IFN能夠有效抑制外周血液中的HBV DNA，但對細胞核內(nèi)cccDNA的影響極小【3】。李軍等【4】報導(dǎo)應(yīng)用以SYBR Green熒光染料和-Globin作為樣本細胞參照所建立的實時熒光定量PCR檢測對肝細胞內(nèi)HBV cccDNA具有較高的特異性、敏感性，且本錢較低?？偵纤g(shù)

4、，目前實時定量PCA是臨床檢測血清HBV DNA常用的分子生物學(xué)方法。其原理是充分利用Taqman酶獨特的生物學(xué)活性和熒光激發(fā)、淬滅性質(zhì)，分別合成攜有熒光基因和淬滅基團的近距引物和探針。在循環(huán)進行中同樣可檢測熒光強度并用軟件與內(nèi)參比擬進行定量分析。 2 HbeAg 2.1 HbeAg的組成及特性:HBeAg由前C區(qū)和C區(qū)共同編碼，在啟動前C區(qū)起始密碼翻譯后切割引導(dǎo)肽和C區(qū)C末端局部多肽后分泌進入血液成為HbeAg。前C區(qū)G1896A變異導(dǎo)致產(chǎn)生終止密碼TAG，以至HBeAg缺如；前C區(qū)C區(qū)啟動子A1762T和G1764A的雙變異，使得前C區(qū)mRNA產(chǎn)生減少，也會使HBeAg分泌減少。 2.2

5、HbeAg的檢測:HBeAg陽性程度和滴度大小與HBV復(fù)制及傳染性強弱呈正相關(guān)，但前C區(qū)或C區(qū)發(fā)生啟動子終止密碼突變時，可表現(xiàn)為HBeAg陰性。這些HBV變異株與重型肝炎或慢性肝炎惡化有關(guān)。故而HBeAg陰性或HBeAb持續(xù)陽性的乙肝患者，需檢測前S1(Pre-S1)或前S2(Pre-S2)抗原，以了解HBV復(fù)制程度。總之，HBV DNA全基因克隆、測序工作的完成為免疫和分子生物學(xué)檢測奠定了根底，所以僅以HBeAg作為判斷HBV復(fù)制活潑與否的指標(biāo)是不夠的11。 3 Pre-S1、Pre-S2抗原 3.1 Pre-S1、Pre-S2抗原的種類與結(jié)構(gòu):HBeAg包括前sPre-S)、Pre-S1和

6、Pre-S2共3種蛋白，分別由s區(qū)、pre-S1區(qū)pre-S2區(qū)編碼。Pre-S1由108110個氨基酸殘基組成，其2147位氨基酸為肝細胞膜受體。Pre-S2含55個氨基酸殘基，其C端與HBsAg的N端相連，而N端109133位氨基酸為聚合人血清蛋白受體【5】。 3.2 Pre-S1、Pre-S2抗原的表達:多項研究發(fā)現(xiàn)Pre-S1與HBV DNA水平高度相關(guān)，是十分重要的病毒復(fù)制指標(biāo)。有研究以探針原位雜交技術(shù)檢測了慢性乙肝患者肝組織內(nèi)HBV DNA與肝細胞內(nèi)HbsAg、HbcAg、Pre-S1和Pre-S2，結(jié)果顯示Pre-S1和Pre-S2的表達主要位于肝細胞胞漿內(nèi)，局部位于胞膜上；Pr

7、e-S1陽性率高達75%，顯著高于Pre-S2的35%【6】。更重要的是，Pre-S1的表達與HBV DNA及HBcAg的表達相平行，證實Pre-S1可能主要在HBV復(fù)制階段表達【7】。Pre-S2較S蛋白具有更強的免疫原性，能提高機體對S蛋白的免疫反響，誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和保護性免疫反響，在保護機體免受HBV感染中可能有重要作用。Pre-S1、Pre-S2的持續(xù)存在說明有病毒復(fù)制和病毒顆粒存在，往往與HBeAg及HBV DNA同時相伴。此外，研究說明HBV膜蛋白55氨基酸的Pre-S2區(qū)有強免疫原性，包含較強的T和B細胞表位，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能對HBV感染提供血清保護作用【8】。以上研究說明P

8、re-S1、Pre-S2抗原表達為多樣性，以多種形式表現(xiàn)。 4 HBcAg 4.1 HbcAg的組成特點:HBcAg主要在核內(nèi)裝配為c病毒核心，無引導(dǎo)肽而不易透過細胞膜(質(zhì)膜外表的HBcAg被認為是免疫細胞攻擊的靶抗原)進入血液，屬堿性蛋白易誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體以及在血液中易被蛋白酶水解，因此常規(guī)方法不能檢出HBcAg。HBcAg富含堿性氨基酸#免疫原性強，加之RLY在血液中滴度高、持續(xù)時間長，抗體滴度高而持久，即使在病毒消失后，HBcAg仍能持續(xù)十年以上。由于上述原因，HBcAg的檢測方法目前采用的是抗體競爭抑制法或抗體捕捉法【7】。 4.2 HbcAg的測定:大腸桿菌所表達的HBcAg將缺失一局部

9、HBV感染者體內(nèi)的HBcAg所具有的非線性表達，無法與相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合，有可能導(dǎo)致漏檢。而用畢赤酵母表達系統(tǒng)替代大腸桿菌表達系統(tǒng)進行HBcAg的表達并用于免疫檢測，母表達系統(tǒng)是新近開展起來的高效真核生物表達系統(tǒng)，能對表達產(chǎn)物進行多種表達后修飾、重組蛋白具有正確的折疊及由此產(chǎn)生的非線性表位，當(dāng)作為重組抗原時，能擁有與原母本抗原相近的表位(包括線性表位及非線性表位)，具有良好的反響性【9】。以上所述為體外缺少高效HBV增殖系統(tǒng)，也很難從HBV感染者的肝臟別離到足夠的HbcAg，因此制備HBcAg所需的HBcAg多來源于用基因工程技術(shù)制備的重組抗原。 總之，徹底去除感染機體的HBV依賴于免疫系統(tǒng)

10、的有效參與。盡管核苷類似物及干擾素(interferon，IFN)在治療慢性乙肝方面取得了一定的效果，但對療效的評價及治療應(yīng)答的預(yù)測，主要依賴于對患者免疫狀態(tài)的監(jiān)測以及病毒定量檢測。因此檢測HBV抗原和機體產(chǎn)生的特異性抗體，以及對宿主免疫應(yīng)答狀況的監(jiān)測，對于研究感染的自然史和指導(dǎo)相應(yīng)的診斷、治療至關(guān)重要。 參考文獻 【1】 Werle-Lapostlle B, Bowden S, et al. Persistence of cccDNA during the natural history of chronic hepatitis B and decline during adefovir d

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