RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞protocol

1、-作者xxxx-日期xxxxRAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞protocol【精品文檔】 ATCC: 美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection)的簡寫收到冷凍管細(xì)胞的處理方式1. 收到細(xì)胞株包裹時，請檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細(xì)胞株請盡速開始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于70，隔夜后，移到液氮)。2. 收到T25 flask細(xì)胞的處理方式于寄送過程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。2.1.檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題，不要打開蓋子，請立即通知細(xì)胞實驗室

2、。2.2.將原封之T25 flask 靜置于37， 5% CO2 培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至37，并讓運送過程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長。2.3.隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長滿盤， 則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。細(xì)胞株的Cell Culture一、1、RAW264.7細(xì)胞一般為圓形或橢圓形，功能活躍時，可呈多突形。細(xì)胞核為圓形或橢圓形，染色較深。貼壁特別牢固。2、RAW264.7具有很強的吞噬能力，當(dāng)吞噬抗原后，細(xì)胞會釋放趨化因子，進一步促進細(xì)胞伸出偽足，增強粘附攀爬能

3、力。細(xì)胞吞噬抗原過多、培養(yǎng)環(huán)境惡劣都會促進該細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、長梭形，鏡下會看到具有細(xì)長偽足的小細(xì)胞被類似上皮的梭形大細(xì)胞取代。3、每次傳代都很難消化下來。用力過大則對細(xì)胞損傷較大，這種細(xì)胞傳代時接種密度要大，否則容易使巨噬細(xì)胞向終末細(xì)胞分化，細(xì)胞變成長形，并且不能回復(fù)，這是培養(yǎng)這種細(xì)胞時最需要注意的問題。4、對于RAW264.7細(xì)胞他的聲場時喜歡結(jié)伴。正常生長狀態(tài)應(yīng)該是一小片一小片的生長，片片之間不連接，等到長到更多更密的時候會連成大片，并且會疊加成層。所以，要很好地控制好細(xì)胞的生長速度，不要等到疊加成層的時候再傳代。5、RAW264.7細(xì)胞傳代后貼壁時間較短，半小時就能貼很多，剛貼壁是細(xì)胞呈圓

4、形，折光度很好，鏡下觀察如小珍珠狀一個個地散落于瓶底面。生長一段時間后，部分細(xì)胞會變成類似四角形，伸出偽足之類的。這個時候就是提醒你注意傳代了，這部分細(xì)胞如再不傳代，很容易就老化掉。二、1) 將培養(yǎng)瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)液棄掉， 然后用D-Hanks液洗兩次，(一定要洗干凈，以免影響胰酶的消化作用) 2) 加入0.25%胰酶-EDTA消化，25cm培養(yǎng)瓶加0.4ml， 37度消化5min，鏡下看到細(xì)胞變圓，間隙增大。（值得注意的是該細(xì)胞對機械損傷比較敏感）3)立即加含10%FCS的培養(yǎng)液終止消化，用細(xì)胞刮刀輕刮，注意，這時候用吸管吹不下來，但是刮刀卻很容易刮下來，而且對細(xì)胞的損傷極小4)離心，棄上清，加

5、新的培養(yǎng)液(10%FCS)，小心吹勻，分裝入新的培養(yǎng)瓶三、凍存及復(fù)蘇（一）細(xì)胞凍存1. 配制凍存培養(yǎng)液；（通用的為培養(yǎng)基：血清：DMSO=7：2：1，但其中的血清可進行調(diào)整，如上面的仁兄用的4：5：1，比例過高）2. 取對數(shù)生長期的細(xì)胞（凍存前一天換液），用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中；3. 離心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5106/ml1107/ml；5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管11.5 ml（不超過凍存管容量的80%）

6、；6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者；7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1-2/ min；當(dāng)溫度達-25以下時，可增至-5-10/min；到-100時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。（具體操作為4C 20min，-20C30min，-70過夜，轉(zhuǎn)入液氮中）（二） 細(xì)胞復(fù)蘇1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37溫水中，并不時搖動令其盡快融化。（1min以內(nèi)溶解完畢，不能將口進入水面下）2. 從37水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；3.

7、 離心， 1000rpm，5min；4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；(復(fù)蘇時細(xì)胞密度稍大，可提高復(fù)蘇效率)5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。（可更換一半培養(yǎng)液，避免跨度太大，影響細(xì)胞狀態(tài)）（三）接種四、1.倒掉舊的培養(yǎng)基，加入3ml新的培養(yǎng)基（有無血清的都可）洗滌一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培養(yǎng)基，進行預(yù)吹打，控制吹打力度，輕輕地大概沿著瓶底過一遍，然后吸走。這時侯再開始正式的消化、吹打。 2.把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按時間點觀察細(xì)胞貼壁情況。10分鐘觀察

8、一次，20分鐘，30分鐘觀察一次。選擇一個時間點，已經(jīng)有部分細(xì)胞貼壁的情況下，重新置于潔凈臺，底面朝上迅速倒出其中的培養(yǎng)基，加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次。然后加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。后續(xù)觀察細(xì)胞生長情況以及形態(tài)。我稱之為“二傳”。3.如果一次效果還不理想，可重復(fù)多次。直到找到細(xì)胞完美形態(tài)。其中要注意，結(jié)合細(xì)胞喜歡的生長情況。喜歡多一點數(shù)量長得好的細(xì)胞就等貼壁細(xì)胞比較多點的時候再傳。反之亦然。不明之處：培養(yǎng)之前，一切與細(xì)胞接觸的玻璃器皿和器具都要進行過去熱源處理。（200-250烘烤4-6h）？Cell Culture的材料（一）儀器1. 凈化工作臺2. 離心機3. 恒溫水浴箱4. 冰箱（4、-2

9、0、-70）5.倒置相差顯微鏡6. 培養(yǎng)箱7. 液氮冰箱（二）玻璃器皿1. 吸管（彎頭、直頭）2. 培養(yǎng)瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 廢液缸（三）塑料器皿1. 吸頭2. 槍頭3. 膠塞4. 移液管（10ml）5. 15ml離心管6. 凍存管（12ml）（四）其他物品1. 微量加樣槍2. 紅血球計數(shù)板3. 記號筆4. 醫(yī)用橡皮膏5. 移液槍（五）試劑1. D-Hanks液2. 胎牛血清3. 培養(yǎng)液4. 雙抗（青霉素、鏈霉素）5. 胰蛋白酶（0.25%）6.7.4%NaHCO37. DMSO（分析純）或無色新鮮甘油附1. 胎牛血清品牌整理第一類，最高級別，是專門用于干細(xì)胞的特級胎牛

10、血清1、Hyclone的特級胎牛血清目前，性能最好的血清，還是要說說Hyclone的特級胎牛血清，貨號是SH30070.03，它是Hyclone的“招牌菜”。Hyclone特級胎牛血清（Defined FBS），貨號SH30070，是世界上唯一經(jīng)過40納米過濾的頂級胎牛血清，極佳的促細(xì)胞生長作用及產(chǎn)品穩(wěn)定性。內(nèi)毒素含量10EU/ml，血紅蛋白含量10mg/dl。此血清可以廣泛用于各種細(xì)胞培養(yǎng)，包含任何干細(xì)胞系的培養(yǎng)。2、Gibco的特級胎牛血清稍次一點的是Gibco公司在美國原裝生產(chǎn)的特級胎牛血清，這款血清，貨號是16000-044，是100nm過濾3次，內(nèi)毒素和血紅蛋白含量都可以與Hyclo

11、ne的SH30070.03相媲美。也可以用于培養(yǎng)大部分的干細(xì)胞系。同樣是美國來源，所以渠道特殊。TCB（Tissue Culture Biologicals）公司作為一家生物行業(yè)類的著名供應(yīng)商，成立于1978年，大部分血清的采集和加工都在加利福尼亞。每一批的原材料都經(jīng)過嚴(yán)格篩選，所有的產(chǎn)品都在FDA認(rèn)證的cGMP車間進行！4. Bioind特優(yōu)級胎牛血清血源來自北美和澳大利亞BioInd公司的生產(chǎn)完全符合GMP的要求，并通過ISO9000:2001和ISO 13485:2003質(zhì)量認(rèn)證。以安全，穩(wěn)定，高效為原則的BioInd公司，所有的產(chǎn)品質(zhì)量均完全符合國際標(biāo)準(zhǔn)。Biological Indu

12、stries主營細(xì)胞培養(yǎng)類產(chǎn)品，BioInd工廠加工的胎牛血清均符合USDA標(biāo)準(zhǔn)及歐洲標(biāo)準(zhǔn)血清。根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，原始血清均采自未發(fā)生瘋牛病（BSE）和口蹄疫（FMD）疫情的國家。Biological Industries三步濾菌處理法，最后的過濾步驟為連續(xù)通過三個100納米的濾膜。血清生產(chǎn)的潔凈級別為100級。所有分裝工作臺都通過高效微?？諝膺^濾器過濾，并保持正壓分裝環(huán)境要對總微粒、懸浮微粒數(shù)和壓力進行監(jiān)控。分裝之后，終產(chǎn)品迅速-20度凍存，并隔離，直到所有的質(zhì)量控制檢測完成。第二類，優(yōu)等胎牛血清1.Hyclone的加拿大優(yōu)等胎牛血清性價比最高的是Hyclone加拿大優(yōu)等胎牛血清（Char

13、acterizendFBS）SH30396.03 血清采自加拿大，由hyclone公司總部的員工采集加工，采集方法，加工過程，檢定標(biāo)準(zhǔn)與美國原產(chǎn)優(yōu)等胎牛血清完全一致，市場價格低于美國原產(chǎn)的。經(jīng)過3次100nm過濾，內(nèi)毒素含量25EU/ml，血紅蛋白含量25mg/dl2、Hyclone的南美優(yōu)級胎牛血清大體與加拿大的優(yōu)等血清是一樣的，級別也非常相似，貨號是sv30087.02，該胎牛血清來源于南美洲，以封閉的心臟穿刺方式采集，產(chǎn)品經(jīng)3次100nm 過濾，經(jīng)嚴(yán)格檢測確保無支原體，細(xì)菌病毒檢測依據(jù)美國藥典（USP）和美國聯(lián)邦法規(guī)第九篇（9CFR），內(nèi)毒素含量10 EU/ml，血紅蛋白含量20 mg/

14、dl，完全符合美國 HyClone® 優(yōu)等胎牛血清的檢測標(biāo)準(zhǔn)。3、Gibco的澳大利亞胎牛血清情況和Hyclone的澳大利亞胎牛血清差不多，市場價也是3200元/500ml左右。這一級別的血清，也能用于干細(xì)胞培養(yǎng)，可是，不象特級胎牛血清那么優(yōu)秀。因為，此胎牛血清屬于澳大利亞生產(chǎn)的，不在疫區(qū)，可以正常報關(guān)進口，目前沒有受到任何影響，所以，就目前而言，算是最好的胎牛血清了，有不少客戶都此血清來培養(yǎng)干細(xì)胞，效果還是比較不錯。4、TCB的優(yōu)級胎牛血清情況和Hyclone的澳大利亞胎牛血清差不多，市場價也是2300元/500ml左右。這一級別的血清，也能用于干細(xì)胞培養(yǎng)，可是，不象特級胎牛血清那么

15、優(yōu)秀。第三類，一般級別的進口胎牛血清1、Hyclone的南美胎牛血清目前，市場上用的最多的Hyclone血清是南美胎牛血清(FBS)SV30087 ，此血清采自南美，在國內(nèi)（蘭州）過濾并測試檢驗，經(jīng)三次100納米過濾，根據(jù)中國商標(biāo)法的規(guī)定標(biāo)貼中文標(biāo)簽，內(nèi)毒素含量10EU/ml,血紅蛋白含量20mg/d。此血清廣泛用于各種腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，還沒有資料記載能夠用于干細(xì)胞，也聽說有少數(shù)人用于干細(xì)胞培養(yǎng)的，不過，因為本身血紅素比較高，所以，最好不要用于干細(xì)胞，2、Gibco的南美胎牛血清這款血清，是Gibco針對Hyclone南美胎牛血清做的，價格比較貴，好像是1780元/500m。3、Gemini的胎

16、牛血清4、TCB的胎牛血清5、PAA的胎牛血清6、JRH澳洲胎牛血清第四類，國產(chǎn)的各種系列胎牛血清國產(chǎn)的胎牛血清，國內(nèi)沒有嚴(yán)格意義的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而國內(nèi)都是剖腹產(chǎn)出胎牛，8小時左右取血，然后，進行過濾分裝。所以，國產(chǎn)的胎牛血清不是嚴(yán)格意義的胎牛血清。價格便宜但是遇到的問題非常多。附2. Hyclone液體培養(yǎng)基普通液體培養(yǎng)基列表描述貨號包裝儲存溫度BME培養(yǎng)基(Basal Medium Eagle)EBSS*，含L-谷氨酰胺。 500 ml2-8C 1000 ml2-8CDMEM培養(yǎng)基(Dulbeccos Modified Eagles Medium)高糖，含4.0

17、mM L-谷氨酰胺，不含丙酮酸鈉。500 ml2-8C SH3006 x 500 ml2-8C 1000 ml2-8C 6 x 1000 ml2-8C高糖，不含L-谷氨酰胺與丙酮酸鈉。500 ml2-8C 6 x 500 ml2-8C 1000 ml2-8C 6 x 1000 ml2-8C 20 L袋裝2-8C 10 L袋裝2-8C高糖，含4.0 mM L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉。500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8C6 x 1000 ml2-8C10 L袋裝2-8C20 L袋裝2-8C高糖，含L-谷氨酰胺、HEPES，不含丙酮酸鈉。500 ml2-8C1000 m

18、l2-8C高糖，不含鈣、鎂。500 ml2-8C1000 ml2-8C高糖，含L-谷氨酰胺，不含酚紅與丙酮酸鈉。500 ml2-8C1000 ml2-8C高糖，含丙酮酸鈉，不含L-谷氨酰胺。500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8C6 x 1000 ml2-8C20 L袋裝2-8C10 L袋裝2-8C高糖，改良型，不含酚紅、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺。500 ml2-8C1000 ml2-8C高糖，改良型，不含酚紅、L-谷氨酰胺，含丙酮酸鈉。500 ml2-8C1000 ml2-8C高糖，含丙酮酸鈉，不含L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、胱氨酸。500 ml2-8C1000 ml

19、2-8C高度改良，含丙酮酸鈉、25 mM HEPES，不含L-谷氨酰胺。500 ml2-8C1000 ml2-8C高糖，含丙酮酸鈉，不含L-谷氨酰胺、磷酸鹽。500 ml2-8C低糖，含4.0 mM L-谷氨酰胺、110 mg丙酮酸鈉。500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8C含2.50 mM L-谷氨酰胺、15 mM HEPES。500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8C含HEPES，不含L-谷氨酰胺。500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8C含L-谷氨酰胺、HEPES、丙酮酸鈉。500 ml2-8C1000

20、 ml2-8C含L-谷氨酰胺，不含HEPES。500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8C含L-谷氨酰胺，不含HEPES、酚紅。500 ml2-8C1000 ml2-8CHams培養(yǎng)基 (Hams Nutrient Mixture)F10培養(yǎng)基，含L-谷氨酰胺。500 ml2-8C1000 ml2-8CF12培養(yǎng)基，含1.00 mM L-谷氨酰胺。, 1X500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8CF12培養(yǎng)基, Kaighns改良型。500 ml2-8C1000 ml2-8C昆蟲培養(yǎng)基 (Insect Media)Graces無添加劑培養(yǎng)基

21、500 ml2-8C1000 ml2-8CTNM-FH培養(yǎng)基500 ml2-8C1000 ml2-8CIMDM培養(yǎng)基 (Iscoves Modified Dulbeccos Medium)含L-谷氨酰胺、HEPES，不含-硫代甘油。500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8C不含L-谷氨酰胺。500 ml2-8C1000 ml2-8CLeibovitz培養(yǎng)基 (Leibovitz Medium)L-15培養(yǎng)基，含2.05 mM L-谷氨酰胺。500 ml2-8C1000 ml2-8CM199培養(yǎng)基 (Medium 199)EBSS*，含L-谷氨酰胺。500 ml2-8

22、C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8CHBSS*，含L-谷氨酰胺。100 ml2-8C500 ml2-8CHBSS*，含L-谷氨酰胺、L-氨基酸。500 ml2-8C1000 ml2-8CMcCoys 5A培養(yǎng)基 (McCoys 5A Medium)含L-谷氨酰胺。500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8C含L-谷氨酰胺，不含酚紅。500 ml2-8C1000 ml2-8C含L-谷氨酰胺、HEPES。500 ml2-8C1000 ml2-8C100 ml2-8CMEM 培養(yǎng)基（Minimum Essential Medium）EBSS*，含2.0 mM L-谷氨酰胺。500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8C6 x 1000 ml2-8CEBSS*，含L-谷氨酰胺，用于懸浮培養(yǎng)。500 ml2-8C1000 ml2-8CEBSS*，不含L-谷氨酰胺。500 ml2-8C6 x 500 ml2-8C1000 ml2-8C6 x 1000 ml2-8C改良型，含L-谷氨酰胺、核糖核苷及脫氧核糖核苷。500 ml