DNA的復(fù)制PPT課件

1、DNA的復(fù)制 第八章第八章 基因工程技術(shù)基因工程技術(shù) DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 基因工程相關(guān)概念基因工程相關(guān)概念 基因工程相關(guān)的酶學(xué)基因工程相關(guān)的酶學(xué) 基因工程的載體基因工程的載體 目的基因的制備和分離方法目的基因的制備和分離方法 載體與目的基因的連接載體與目的基因的連接 重組體的鑒定與分析重組體的鑒定與分析 隆基因的表達(dá)隆基因的表達(dá) 本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容 DNA的復(fù)制 重組重組DNA技術(shù)的發(fā)展史技術(shù)的發(fā)展史 年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)的豌豆雜交試驗(yàn) 1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 1973年年 美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建

2、第一個(gè)重組美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子分子 1977年年 美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工 程公司，專(zhuān)門(mén)應(yīng)用重組程公司，專(zhuān)門(mén)應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。 1980年年 開(kāi)始建造第一家應(yīng)用重組開(kāi)始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠 1997年年 英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉 DNA的復(fù)制 一、基因工程技術(shù)相關(guān)概念一、基因工程技術(shù)相關(guān)概念 （一）（一）DNA克隆克隆 克?。寺。╟lone）：）： 來(lái)自同一始祖的相同副

3、本或拷貝的集合。來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。 克隆化（克隆化（cloning）：）： 獲取同一拷貝的過(guò)程，即無(wú)性繁殖。獲取同一拷貝的過(guò)程，即無(wú)性繁殖。 分子克?。ǚ肿涌寺。―NA克?。┛寺。?細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆 個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）個(gè)體克隆（動(dòng)物或植物） DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 DNA克隆克隆 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的 遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì)與與載體載體DNADNA接合成一具有自我復(fù)制接合成一具有自我復(fù)制 能力的能力的DNADNA分子分子復(fù)制子復(fù)制子(replicon)，繼而

4、繼而 通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞，篩選出含有目的，篩選出含有目的 基因的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增，提取獲得，再進(jìn)行擴(kuò)增，提取獲得 大量同一大量同一DNADNA分子，也稱(chēng)分子，也稱(chēng)基因克隆或重組基因克隆或重組 DNA (recombinant DNA) 。 DNA的復(fù)制 DNA克隆克隆目的目的: : 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或 DNA; 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋 白質(zhì)）白質(zhì)）。 DNA的復(fù)制 基因工程：基因工程： 實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān) 的工作，又稱(chēng)為的工作，又稱(chēng)為重組

5、重組DNA技術(shù)技術(shù) (recom- binant DNA technology)。 DNA的復(fù)制 基因工程的基本過(guò)程和工作原理基因工程的基本過(guò)程和工作原理 載體DNA (限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi))目的基因 宿主細(xì)胞 重組體 已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞 陽(yáng)性克隆株 繁殖 表達(dá) DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 在這個(gè)過(guò)程中：在這個(gè)過(guò)程中： 1.“基因剪刀基因剪刀” 剪取剪取DNA的酶就像一把的酶就像一把“基因剪刀基因剪刀” 2.“縫紉針縫紉針” 連接不同來(lái)源連接不同來(lái)源DNA分子的酶就像一根分子的酶就像一根“縫紉針縫紉針”， 使二者連在一起使二者連在一起 3.“交通工具交通工具” 使用載體好比一輛車(chē)子使用載體好比一輛車(chē)

6、子 4.“乘客乘客” 有用基因如有用基因如IL2好比使乘客，車(chē)子把乘客送進(jìn)理想好比使乘客，車(chē)子把乘客送進(jìn)理想 天堂（宿主細(xì)胞）去繁衍生息，春華秋實(shí)，生產(chǎn)我們需要天堂（宿主細(xì)胞）去繁衍生息，春華秋實(shí)，生產(chǎn)我們需要 的產(chǎn)品或開(kāi)展基因治療（的產(chǎn)品或開(kāi)展基因治療（IL2/LAK抗癌）?？拱?。 DNA的復(fù)制 （二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNADNA聚合酶聚合酶I I 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 DNADNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 DNA的復(fù)制 工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA DNA連接酶生成3- 5磷

7、酸二酯鍵 DNA聚合酶探針標(biāo)記、補(bǔ)平3末端 反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成 多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標(biāo)記 末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾 堿性磷酸酶切除末端磷酸基 常用的工具酶：常用的工具酶： DNA的復(fù)制 一、一、 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 1.1 概念概念 識(shí)別識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)械奶禺愋蛄校⒃谧R(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)?割雙鏈割雙鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶。的一類(lèi)內(nèi)切酶。 是細(xì)菌內(nèi)存在的保護(hù)性酶。分為是細(xì)菌內(nèi)存在的保護(hù)性酶。分為I、II、III三類(lèi)。三類(lèi)。II類(lèi)類(lèi) 酶識(shí)別序列特點(diǎn)為酶識(shí)別序列特點(diǎn)為回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)。 DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 1. 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶

8、 1.2 限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶的命名 Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌嗜血流感桿菌d d株株 屬名屬名 種名種名 株名株名 Hind III 同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性?xún)?nèi)切酶同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性?xún)?nèi)切酶 DNA的復(fù)制 1.3基本特征：基本特征： 限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列長(zhǎng)度為限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列長(zhǎng)度為48個(gè)個(gè)bp。 限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端末端： 平頭末端平頭末端( (flush end)flush end)和和 粘性末端粘性末端( (sticky end)sticky end) Hin

9、d III BamH I G CCTAG GATCC G + GTC CAG GAC CTG + GTCGAC CAGCTG GGATCC CCTAGG DNA的復(fù)制 粘性末端粘性末端 AATTC G 5 3 ACGTC G5 3 5 -端突出端突出 3 -端突出端突出 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA的復(fù)制 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA的復(fù)制 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA的復(fù)制 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA的復(fù)制 同裂酶同裂酶（isoschizomer ），是來(lái)源于不同物種但能識(shí)），是來(lái)源于不同物種但能識(shí) 別相同別相同DNA序列的限制性?xún)?nèi)切酶，切割

10、位點(diǎn)可以相同也序列的限制性?xún)?nèi)切酶，切割位點(diǎn)可以相同也 可以不同?？梢圆煌?。 同尾酶同尾酶（isocaudarner），一類(lèi)識(shí)別不同核苷酸序列，一類(lèi)識(shí)別不同核苷酸序列 但能切割產(chǎn)生相同末端的限制性?xún)?nèi)切酶，一般是指能產(chǎn)生但能切割產(chǎn)生相同末端的限制性?xún)?nèi)切酶，一般是指能產(chǎn)生 相同粘性末端的限制酶。相同粘性末端的限制酶。同尾酶同尾酶產(chǎn)生的相同粘性末端稱(chēng)產(chǎn)生的相同粘性末端稱(chēng)配配 伍末端伍末端（compatible end），），可用連接酶連接。如可用連接酶連接。如Sal I 與與Xho I，BamH I與與Bgl II。 DNA的復(fù)制 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 （1 1）消化作用：）消化作用：限制

11、性?xún)?nèi)切酶以同源二聚體的限制性?xún)?nèi)切酶以同源二聚體的 形式與靶形式與靶DNADNA序列發(fā)生作用識(shí)別，靶序列發(fā)生作用識(shí)別，靶DNADNA的大小的大小 決定產(chǎn)生特定決定產(chǎn)生特定DNADNA片段的大小。片段的大小。 （2 2）片段化：?jiǎn)蚊盖校海┢位簡(jiǎn)蚊盖校簄(n(環(huán)狀）或環(huán)狀）或n+1n+1（線(xiàn)性）（線(xiàn)性） 1.4 限制性?xún)?nèi)切酶的對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶的對(duì)DNA的消化作用及其片段化的消化作用及其片段化 DNA的復(fù)制 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 雙酶切：雙酶切：a+b(a+b(環(huán)狀），環(huán)狀），a+b+1(a+b+1(線(xiàn)性）線(xiàn)性） （1 1）對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)）對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則

12、上可以同時(shí) 酶切，但應(yīng)注意：酶切位點(diǎn)太靠近時(shí)，先用一酶切，但應(yīng)注意：酶切位點(diǎn)太靠近時(shí)，先用一 種酶切，然后再用另一種酶切種酶切，然后再用另一種酶切 1.4 限制性?xún)?nèi)切酶的對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶的對(duì)DNA的消化作用及其片段化的消化作用及其片段化 DNA的復(fù)制 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 （1 1）不同不同的的DNADNA片段通過(guò)互補(bǔ)的粘性末端連接稱(chēng)片段通過(guò)互補(bǔ)的粘性末端連接稱(chēng) 為為 分子間連接。分子間連接。 （2 2）同一同一片段的片段的2 2個(gè)互補(bǔ)末端之間的連接稱(chēng)為個(gè)互補(bǔ)末端之間的連接稱(chēng)為 分子內(nèi)連接分子內(nèi)連接 1.5、具有粘性末端的、具有粘性末端的DNA片段的兩種連接方式。片段的兩種連接方式。

13、 DNA的復(fù)制 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 (1) DNA樣品的純度：樣品的純度： 蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl等。等。 l 加大酶的用量，加大酶的用量，1g DNA 用用10U酶酶 l 加大反應(yīng)總體積加大反應(yīng)總體積 l 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 1.6 影響限制性?xún)?nèi)切酶活性的因素影響限制性?xún)?nèi)切酶活性的因素 DNA的復(fù)制 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 (2) DNA樣品的甲基化程度：基因工程常常使用丟失了甲基化酶樣品的甲基化程度：基因工程常常使用丟失了甲基化酶 的大腸桿菌來(lái)制備質(zhì)粒的大腸桿菌來(lái)制備質(zhì)粒 大腸桿菌的大腸桿菌的dam甲基

14、化酶甲基化酶在在5GATC3序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6 位引入甲基，受其影響的酶有位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影響。不受影響。 大腸桿菌的大腸桿菌的dcm甲基化酶甲基化酶在在5 CCAGG 3或或5 CCTGG 3序序 列中的胞嘧啶列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有位上引入甲基，受其影響的酶有EcoR II等等 哺乳動(dòng)物的甲基化酶在哺乳動(dòng)物的甲基化酶在5 CG 3序列中的序列中的C5位上引入甲基。位上引入甲基。 影響酶切反應(yīng)的因素影響酶切反應(yīng)的因素 DNA的復(fù)制 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 (3)

15、底物底物DNA分子的構(gòu)型：底物分子的構(gòu)型：底物DNA不同構(gòu)不同構(gòu) 型對(duì)核酸限制性?xún)?nèi)切酶活性有較大的影響。型對(duì)核酸限制性?xún)?nèi)切酶活性有較大的影響。 (4) 反應(yīng)的溫度：大多數(shù)為反應(yīng)的溫度：大多數(shù)為37 影響酶切反應(yīng)的因素影響酶切反應(yīng)的因素 DNA的復(fù)制 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 (5)反應(yīng)體系的組成：反應(yīng)體系的組成： 緩沖液的種類(lèi)，緩沖液的種類(lèi)，pH值，高濃度的酶、高濃度的甘油、低值，高濃度的酶、高濃度的甘油、低 離子強(qiáng)度、添加二巰基丙醇，二硫蘇糖醇（離子強(qiáng)度、添加二巰基丙醇，二硫蘇糖醇（DTT），）， BSA DMSO等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切

16、割序列 發(fā)生低特異性，即所謂的發(fā)生低特異性，即所謂的Star activity現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 EcoR I在正常條件下識(shí)別并切割在正常條件下識(shí)別并切割5 GAATTC3 序列，但序列，但 在甘油濃度超過(guò)在甘油濃度超過(guò)5%（v/v）時(shí)，也可切割時(shí)，也可切割5 PuPuATPyPy 3或或5 AATT 3。 (6)酶量、反應(yīng)體積、酶切時(shí)間合理使用。酶量、反應(yīng)體積、酶切時(shí)間合理使用。 影響酶切反應(yīng)的因素影響酶切反應(yīng)的因素 DNA的復(fù)制 二、二、DNA連接酶連接酶 定義：可以催化具有定義：可以催化具有5-磷?；土柞；?羥基末端形成磷酸羥基末端形成磷酸 二酯酶鍵的酶。二酯酶鍵的酶。 DNA的復(fù)制 二、

17、二、DNA連接酶連接酶 （1 1）催化雙鏈）催化雙鏈DNADNA上缺口處的磷酸二酯鍵形成上缺口處的磷酸二酯鍵形成 2.1 催化的反應(yīng)催化的反應(yīng) DNA的復(fù)制 二、二、 DNA連接酶連接酶 2.1 催化的反應(yīng)催化的反應(yīng) （2 2）催化）催化RNA-DNARNA-DNA雙鏈中的雙鏈中的DNADNA鏈缺口處的磷酸二酯鍵形鏈缺口處的磷酸二酯鍵形 成成 DNA的復(fù)制 二、二、 DNA連接酶連接酶 （3 3）連接多個(gè)平頭雙鏈）連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：分子： 2.1 催化的反應(yīng)催化的反應(yīng) DNA的復(fù)制 三、聚合酶三、聚合酶 作用：以作用：以RNA或或DNA為模板催化為模板催化RNA或或 DNA的合成的合

18、成 DNA的復(fù)制 1. DNA聚合酶聚合酶 I 大片段大片段 (Klenow片段片段) 三、聚合酶三、聚合酶 323個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸 小片段小片段 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大片段大片段/Klenow 片段片段 604個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活核酸外切酶活 性性 N 端端C 端端 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶/枯草桿菌蛋白水解酶枯草桿菌蛋白水解酶 DNA-pol DNA的復(fù)制 在模板和引物在模板和引物 (DNA或或RNA) 存在的條件下，以存在的條件下，以 dNTP作底物，沿作底物，沿53方向合成與模板互補(bǔ)的方向合成與模板互補(bǔ)的 DNA。 能夠用于能夠用于M

19、13雙脫氧法測(cè)序。雙脫氧法測(cè)序。 53 DNA Polymerase活性活性 DNA的復(fù)制 單鏈特異性的單鏈特異性的35外切核酸酶活性外切核酸酶活性 53外切酶活性 35外切酶活性 5 3 3 5 DNA的復(fù)制 l 修補(bǔ)經(jīng)限制性酶消化修補(bǔ)經(jīng)限制性酶消化dsDNA得到的得到的3隱蔽末端，隱蔽末端， 使其成為平頭末端。使其成為平頭末端。 l 使用隨機(jī)引物進(jìn)行使用隨機(jī)引物進(jìn)行DNA標(biāo)記標(biāo)記 l 在在cDNA的克隆中用于的克隆中用于cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 l 雙脫氧法雙脫氧法DNA序列測(cè)定序列測(cè)定 (Sanger法法)。 用途用途 DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 隨機(jī)引物隨機(jī)引物DNADNA標(biāo)記

20、步驟標(biāo)記步驟 DNA的復(fù)制 1.來(lái)源來(lái)源 源于源于T4噬菌體感染的噬菌體感染的E.coli。 2. 酶的活性酶的活性，相似于，相似于Klenow片段，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于片段，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于 Klenow片段片段 （1）53 聚合活性聚合活性 （ 2 ） 3 5 外 切 酶 活 性 （外 切 酶 活 性 （ T 4 pol/Klenow） 3.基因工程中用途與基因工程中用途與Klenow片段一致（參前，標(biāo)記片段一致（參前，標(biāo)記 末端，填平末端，填平5末端），不同的是可對(duì)末端），不同的是可對(duì)3突出端的突出端的 DNA分子進(jìn)行標(biāo)記。這是用其強(qiáng)勁的分子進(jìn)行標(biāo)記。這是用其強(qiáng)勁的35外外 切酶活性切除切酶活性切除33

21、突出端，產(chǎn)生突出端，產(chǎn)生33凹端凹端。 2. T4-DNA聚合酶聚合酶 DNA的復(fù)制 T4-DNA聚合酶聚合酶 DNA的復(fù)制 T4-DNA聚合酶聚合酶 DNA的復(fù)制 3.TaqDNA聚合酶聚合酶(Taq DNA pol，Taq pol） 該酶是一種耐熱的依賴(lài)于該酶是一種耐熱的依賴(lài)于DNA的的DNA聚合酶，聚合酶， 具有具有53聚合活性以及依賴(lài)聚合活性以及依賴(lài)53聚合酶作用的聚合酶作用的 外切酶活性，聚合酶的最適反應(yīng)溫度是外切酶活性，聚合酶的最適反應(yīng)溫度是75 80,37 ,37 活性有活性有1010。 該酶的主要用途是進(jìn)行該酶的主要用途是進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)（詳參聚合反應(yīng)（詳參聚合 酶鏈，酶鏈

22、，polymerase chain reactionpolymerase chain reaction） DNA的復(fù)制 逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶多功能酶，有三種酶活性：，有三種酶活性： 1. 1. 逆轉(zhuǎn)錄活性：逆轉(zhuǎn)錄活性：即以即以RNARNA為模板合成為模板合成DNADNA 2. RNase2. RNase活性：活性：水解水解RNARNA:DNA:DNA中的中的RNARNA 3. DNA pol3. DNA pol活性：活性：以以DNADNA為模板合成為模板合成DNADNA 特點(diǎn)：無(wú)外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤率高特點(diǎn)：無(wú)外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤率高2 2 1010-4 -4。 。 4.逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄

23、酶 3. DNA pol3. DNA pol活性：活性：以以DNADNA為模板合成為模板合成DNADNA 特點(diǎn)：無(wú)外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤率高特點(diǎn)：無(wú)外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤率高2 2 1010-4 -4。 。 DNA的復(fù)制 53 53 TTTT poly A tail 35 CCC3 53GGG 5 逆轉(zhuǎn)錄活性逆轉(zhuǎn)錄活性 RNaseRNase活性活性 RNA:DNARNA:DNA雜合鏈雜合鏈 RNARNA模板模板 單鏈單鏈DNADNA 雙鏈雙鏈DNADNA DNA polDNA pol活性活性 DNA的復(fù)制 l 一種無(wú)需模板的一種無(wú)需模板的DNADNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到聚合酶，催化脫氧核苷

24、酸結(jié)合到DNADNA分子的分子的3 3 羥基端。帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈羥基端。帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈DNADNA分子均可作為分子均可作為 TdTTdT的底物。的底物。 l 用途：用途： 催化催化DNADNA的的33末端添加同聚物末端添加同聚物 DNADNA的的33末端標(biāo)記末端標(biāo)記 給載體或給載體或cDNAcDNA加上互補(bǔ)的同聚尾，造成人工粘液末端可以重組。加上互補(bǔ)的同聚尾，造成人工粘液末端可以重組。 1. 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal Transferase，TdT ) 四、四、DNA和和RNA的修飾酶的修飾酶 DNA的復(fù)制 l 能催化除去能催化除去DNA的的5磷

25、酸基團(tuán)，磷酸基團(tuán)，5-P變?yōu)樽優(yōu)?-OH； l 處理后的處理后的DNA片段缺少連接酶所要求的片段缺少連接酶所要求的5磷酸末端，磷酸末端， 因此它們不能進(jìn)行自連接?？梢栽诳寺r(shí)降低載體因此它們不能進(jìn)行自連接?？梢栽诳寺r(shí)降低載體 DNA的背景。的背景。 l 小牛腸堿性磷酸酶小牛腸堿性磷酸酶(Calf Intestinal ， CIP) 和細(xì)菌堿性磷酸酶（和細(xì)菌堿性磷酸酶（bacteria Intestinal BIP) 2. 堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase） 四、四、DNA和和RNA的修飾酶的修飾酶 DNA的復(fù)制 來(lái)源：米曲霉來(lái)源：米曲霉 功能：降解功能：降解s

26、sDNAssDNA或或RNARNA，形成，形成55磷酸末端的單或磷酸末端的單或 寡核苷酸。并且對(duì)寡核苷酸。并且對(duì)DNADNA底物的活性比對(duì)底物的活性比對(duì)RNARNA強(qiáng)。強(qiáng)。 五、核酸酶五、核酸酶 單鏈核酸內(nèi)切酶單鏈核酸內(nèi)切酶: S1核酸酶核酸酶 DNA的復(fù)制 （1 1）內(nèi)切）內(nèi)切單單鏈鏈DNADNA或或RNARNA 基本反應(yīng)基本反應(yīng) DNA的復(fù)制 單鏈核酸內(nèi)切酶單鏈核酸內(nèi)切酶: S1核酸酶核酸酶 （2 2）內(nèi)切）內(nèi)切帶缺口或缺刻的帶缺口或缺刻的雙鏈雙鏈DNADNA或或RNARNA 基本反應(yīng)基本反應(yīng) DNA的復(fù)制 S1核酸酶核酸酶 重要用途：重要用途： S1S1作圖（作圖（S1 mappingS

27、1 mapping） 是一種對(duì)是一種對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的末端和剪接位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的末端和剪接位點(diǎn)進(jìn)行作圖作圖的方法。的方法。 雙鏈雙鏈DNA變性后，與變性后，與mRNA雜交，外顯子區(qū)段與雜交，外顯子區(qū)段與mRNA雜交雜交 形成雙鏈，而形成雙鏈，而DNA的其余部分仍為單鏈分子。通過(guò)電泳，確的其余部分仍為單鏈分子。通過(guò)電泳，確 定不被降解的定不被降解的DNA片段的大小，即可確定片段的大小，即可確定mRNA的末端以及的末端以及 位于基因內(nèi)部的內(nèi)含子的位置。位于基因內(nèi)部的內(nèi)含子的位置。 S1 mapping應(yīng)用：應(yīng)用： 研究研究RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 在已知基因的序列后測(cè)定在已知基因的序列后測(cè)定m

28、RNA起點(diǎn)和終點(diǎn)起點(diǎn)和終點(diǎn) 還可以檢測(cè)前體還可以檢測(cè)前體RNA-mRNA的剪接點(diǎn)的剪接點(diǎn) DNA的復(fù)制 S1核酸酶作圖核酸酶作圖 DNA的復(fù)制 第三節(jié)：基因工程的載體（第三節(jié)：基因工程的載體（vectorvector） 定義：定義： 是指用來(lái)攜帶外源目的基因、實(shí)現(xiàn)外源是指用來(lái)攜帶外源目的基因、實(shí)現(xiàn)外源 DNA克隆或克隆或/和表達(dá)蛋白質(zhì)的和表達(dá)蛋白質(zhì)的DNA分子。分子。 常用的載體：常用的載體： 質(zhì)粒、噬菌體質(zhì)粒、噬菌體DNA、病毒病毒DNA DNA的復(fù)制 l 能自主復(fù)制，并目的基因的插入不影響其復(fù)制能力；能自主復(fù)制，并目的基因的插入不影響其復(fù)制能力； l 有克隆位點(diǎn)（外源有克隆位點(diǎn)（外源DNA

29、DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶 切位點(diǎn)，稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)；切位點(diǎn)，稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)； 3.3.含有不影響生長(zhǎng)和復(fù)制的非必要區(qū)域，可以與外源含有不影響生長(zhǎng)和復(fù)制的非必要區(qū)域，可以與外源DNADNA連連 接重組。接重組。 4.4.具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體篩選和鑒定；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體篩選和鑒定； 5.5.分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNADNA。 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) DNA的復(fù)制 來(lái)源分類(lèi)：質(zhì)粒載體來(lái)源分類(lèi)：質(zhì)粒載體 噬菌體載體噬菌體載體 病毒載體病毒載體 人工染色體載體人工染色體載體 用途分類(lèi)：克隆載體用途分

30、類(lèi)：克隆載體 表達(dá)載體表達(dá)載體 穿梭載體穿梭載體 常用載體常用載體: : DNA的復(fù)制 克隆載體克隆載體(cloning vector) 能使插入的外源能使插入的外源DNA序列被復(fù)制、擴(kuò)增序列被復(fù)制、擴(kuò)增 而不能表達(dá)，這樣的載體為而不能表達(dá)，這樣的載體為克隆載體克隆載體。 表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 使插入的外源使插入的外源DNA序列轉(zhuǎn)錄翻譯，表達(dá)序列轉(zhuǎn)錄翻譯，表達(dá) 出多肽鏈，出多肽鏈，這樣的這樣的載體稱(chēng)為表達(dá)載體。載體稱(chēng)為表達(dá)載體。 DNA的復(fù)制 這類(lèi)載體中含有來(lái)源不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，這類(lèi)載體中含有來(lái)源不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)， 即具備即具備原核細(xì)胞原核細(xì)胞復(fù)制所需的序列結(jié)

31、構(gòu)，又具復(fù)制所需的序列結(jié)構(gòu)，又具 有能使外源片段在有能使外源片段在真核細(xì)胞真核細(xì)胞表達(dá)所需的結(jié)構(gòu)表達(dá)所需的結(jié)構(gòu) 元件和相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因元件和相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因,所以能在兩種受所以能在兩種受 體細(xì)胞中復(fù)制并檢測(cè)，克隆的外源基因在此體細(xì)胞中復(fù)制并檢測(cè)，克隆的外源基因在此 類(lèi)載體直接從一種受體轉(zhuǎn)入另一種受體中進(jìn)類(lèi)載體直接從一種受體轉(zhuǎn)入另一種受體中進(jìn) 行復(fù)制和表達(dá)行復(fù)制和表達(dá) 穿梭載體（穿梭載體（shuttle vector) DNA的復(fù)制 1.質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid） 質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定 遺傳的一類(lèi)核酸分

32、子遺傳的一類(lèi)核酸分子。 常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中。常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中。 絕大多數(shù)的天然絕大多數(shù)的天然DNADNA質(zhì)粒具有質(zhì)粒具有 共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié) 構(gòu)，即構(gòu)，即cccDNAcccDNA。大小約為大小約為1-1- 300300kbkb。 DNA的復(fù)制 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid） 1.1 1.1 質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒的構(gòu)建 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單 一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿(mǎn)足克隆載一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿(mǎn)足克隆載 體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人體

33、的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人 工構(gòu)建。工構(gòu)建。 目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野 生型質(zhì)粒構(gòu)建的：生型質(zhì)粒構(gòu)建的： pSC101： 8.8 kb, 拷貝數(shù)拷貝數(shù)5 , 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因四環(huán)素抗性標(biāo)記基因Tcr ColE1： 6.5 kb ，拷貝數(shù)拷貝數(shù)20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo) 記基因記基因E1 RSF2124： ColE1衍生質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因衍生質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Apr DNA的復(fù)制 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid） 1.2 1.2 分類(lèi)分類(lèi) 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和

34、用途可分成如下幾類(lèi)： 高拷貝質(zhì)粒：突變拷貝數(shù)控制基因，拷貝數(shù)1千-3千，便于擴(kuò)增基因 低拷貝質(zhì)粒：來(lái)自pSC101pSC101，拷貝數(shù)小于1010， 表達(dá)某些毒性基因 溫敏質(zhì)粒：在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì) 測(cè)序質(zhì)粒：含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker 整合質(zhì)粒：裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)，便于外源基因的整合 穿梭質(zhì)粒：裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制起點(diǎn)，便于基因克隆 表達(dá)質(zhì)粒：裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件 探針質(zhì)粒：裝有報(bào)告基因，便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選 DNA的復(fù)制 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid） 1.3 1.3 重要的大腸桿菌質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒

35、 DNA的復(fù)制 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid） 重要的大腸桿菌質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒 DNA的復(fù)制 細(xì)菌人工染色體（細(xì)菌人工染色體（BAC） （具體見(jiàn)人工載體）（具體見(jiàn)人工載體） DNA的復(fù)制 噬菌體噬菌體DNADNA DNA的復(fù)制 DNA的復(fù)制 噬菌體噬菌體DNADNA DNA的復(fù)制 噬菌體噬菌體DNADNA DNA的復(fù)制 噬菌體作為構(gòu)建克隆載體的依據(jù)噬菌體作為構(gòu)建克隆載體的依據(jù) 噬菌體是一種溫和的噬菌體，對(duì)大腸桿菌具有噬菌體是一種溫和的噬菌體，對(duì)大腸桿菌具有 較大的感染性。較大的感染性。 能承載較大的外源能承載較大的外源DNA片段片段 在在 噬菌體分子上有多種限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn)噬菌體分子上有

36、多種限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn) DNA的復(fù)制 DNA DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建 -DNA -DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度，提高裝載量?？s短長(zhǎng)度，提高裝載量。 野生型野生型-DNA包裝的上限為包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為本身長(zhǎng)度為48.5kb，插插 入的外源入的外源DNA片段不大于片段不大于2.5kb。 -DNA上約有上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的，可的片段是復(fù)制和裂解所非必需的，可 切除。根據(jù)切除的多少，可將切除。根據(jù)切除的多少，可將-DNA分成兩大類(lèi)載體：分成兩大類(lèi)載體： l插入型載體插入型載體 l取代型載體取代型載體 DNA的復(fù)制 DNA DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建

37、 插入型載體：適用于插入型載體：適用于cDNAcDNA的克隆和小片段的克隆和小片段DNADNA的克隆，的克隆， 含有插入失活的基因片段。如含有插入失活的基因片段。如-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。 DNA的復(fù)制 DNA DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建 取代型載體：具有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn)，酶切取代型載體：具有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn)，酶切 后，除去當(dāng)中的非必需成分，由外源后，除去當(dāng)中的非必需成分，由外源DNADNA取代，才取代，才 能形成能形成噬菌斑噬菌斑。 DNA的復(fù)制 DNADNA載體的特點(diǎn)載體的特點(diǎn) l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌； l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)

38、遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量； l重組-DNA分子的篩選較為方便； l重組-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便； l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá) 外源基因。 DNA的復(fù)制 即粘粒，帶有即粘粒，帶有cos 位點(diǎn)位點(diǎn) 的質(zhì)粒（的質(zhì)粒（cos site- carrying plasmid）,是是 一類(lèi)人工構(gòu)建的含有一類(lèi)人工構(gòu)建的含有- DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)序列和質(zhì)粒復(fù) 制子的特殊類(lèi)型載體。制子的特殊類(lèi)型載體。 1.8kb的-DNA片段+ pBR322片段。 裝載范圍為31- 45 kb。 粘尾質(zhì)粒（粘尾質(zhì)粒（cosmidcosmid） DNA的復(fù)制 l 能像能像-DNA-DNA那樣進(jìn)行體

39、外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞；那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞； l 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制；能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制； l 重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易；重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易； l 加入特異啟動(dòng)子加入特異啟動(dòng)子T3T7SP6T3T7SP6，利于雙向表達(dá)；，利于雙向表達(dá)； l 裝載量大（裝載量大（45 45 kbkb），且克隆片段具有一定的大小范圍；且克隆片段具有一定的大小范圍； l 接上能夠在真核細(xì)胞生活的元件，則可以在真核細(xì)胞表接上能夠在真核細(xì)胞生活的元件，則可以在真核細(xì)胞表 達(dá)。達(dá)。 cosmidcosmid的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) DNA的復(fù)制 M13 M13單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删wD

40、NADNA 外型呈絲狀 由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成 DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸 DNA上至少有10個(gè)基因 不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng) 3.1 3.1 大腸桿菌大腸桿菌M13M13噬菌體的結(jié)構(gòu)噬菌體的結(jié)構(gòu) 2700個(gè)蛋白分子 DNA的復(fù)制 2.2 M132.2 M13單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删wDNADNA 感染周期感染周期 DNA的復(fù)制 M13M13單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删wDNADNA M13 DNAM13 DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建 DNA的復(fù)制 M13M13單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删wDNADNA 使克隆的使克隆的DNADNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)外片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)外, , 在在

41、DNADNA定向突變中非常有用；定向突變中非常有用； M13M13重組分子篩選簡(jiǎn)便；重組分子篩選簡(jiǎn)便； 被被M13M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易 于辨認(rèn)挑選。且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大；于辨認(rèn)挑選。且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大； 但但M13-DNAM13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.51.5kbkb。 M13 DNAM13 DNA載體的特點(diǎn)載體的特點(diǎn) DNA的復(fù)制 -DNA載體和載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為載體的裝載量最大分別為 25 kb和和1. 5 kb

42、。但在很多情況下，往往需要克隆更但在很多情況下，往往需要克隆更 大的外源大的外源DNA片段?？妓官|(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建片段。考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建 就是為了進(jìn)一步提高噬菌體就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。的裝載量。 DNA的復(fù)制 六、真核細(xì)胞載體六、真核細(xì)胞載體 （一）哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體（一）哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體 ( (二）酵母載體二）酵母載體 （三）桿狀病毒載體（三）桿狀病毒載體 DNA的復(fù)制 人工染色體（人工染色體（ artificial chromosome）載體載體 l 人類(lèi)、動(dòng)植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至人類(lèi)、動(dòng)植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚

43、至 上千上千kb kb 的的DNADNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量遠(yuǎn)不片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量遠(yuǎn)不 能滿(mǎn)足需要。能滿(mǎn)足需要。 l 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn) 定區(qū)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。 當(dāng)大片段的外源當(dāng)大片段的外源DNADNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重克隆在這些染色體載體上后，便形成重 組人工染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)組人工染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn) 定的復(fù)制并遺傳。定的復(fù)制并遺傳。 DNA的復(fù)制 l常

44、用的人造染色體載體：常用的人造染色體載體： 細(xì)菌人工染色體（細(xì)菌人工染色體（BACBAC）； 酵母人工染色體（酵母人工染色體（YACYAC）; ; P1 P1人工染色體（人工染色體（P1-derived P1-derived artificial chromosome, artificial chromosome, PAC PAC ） DNA的復(fù)制 l 細(xì)菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子細(xì)菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子F F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上質(zhì)粒的基礎(chǔ)上 構(gòu)建的，其裝載量范圍在構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300 50-300 kbkb之間。之間。 l 各種類(lèi)型的各種類(lèi)型的pBACspBACs在

45、大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝。在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝。 l pBACspBACs主要適用于：主要適用于： 克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluster）結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù)構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù) 1.1. 細(xì)菌人工染色體（細(xì)菌人工染色體（BACBAC） DNA的復(fù)制 l 是利用釀酒酵母染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體。是利用釀酒酵母染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體。YACYAC 載載 體在酵母中復(fù)制的必需元件包括復(fù)制起點(diǎn)序列即體在酵母中復(fù)制的必需元件包括復(fù)制起點(diǎn)序列即自主復(fù)自主復(fù) 制序列（制序列（autonomously replicating sequ

46、enceautonomously replicating sequence， ARSARS）、）、 著絲粒著絲粒 （centromere , centromere , CENCEN）和和端粒（端粒（TELTEL）。）。 l 裝載的裝載的 DNA DNA 片段大小一般可達(dá)片段大小一般可達(dá) 200-500 200-500kbkb，有的可達(dá)有的可達(dá) 1 1Mb Mb 以上，甚至達(dá)到以上，甚至達(dá)到 2 2Mb Mb 。 l 工作環(huán)境：在釀酒酵母中。工作環(huán)境：在釀酒酵母中。 2. 2. 酵母人工染色體（酵母人工染色體（YACYAC） DNA的復(fù)制 酵母人工染色體（酵母人工染色體（YACYAC） DNA的復(fù)制 l 噬菌體噬菌體P1P1載體：載體：與與載體非常類(lèi)似，也是將天然載體非常類(lèi)似，也是將天然噬噬菌菌 體基因組中的一段區(qū)域缺失，其容量也取決于缺失區(qū)體基因組中的一段區(qū)域缺失，其容量也取決于缺失區(qū) 段的大小和段的大小和噬噬菌體顆粒能容納的空間?？寺〉钠慰删w顆粒能容納的空間?？寺〉钠慰?達(dá)達(dá)125125kbkb。