連接分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1 連接分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)連接分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 第1頁(yè)/共25頁(yè) 計(jì)算公式計(jì)算公式 : 待測(cè)樣品的待測(cè)樣品的 DNADNA量量(ng)(ng) = Marker Marker DNADNA總質(zhì)量總質(zhì)量 同等亮度條帶的同等亮度條帶的 MarkerMarker的的bpbp數(shù)數(shù) MarkerMarker各條各條 帶帶bpbp數(shù)總和數(shù)總和 X 第2頁(yè)/共25頁(yè) DNADNA片段的重組片段的重組 （連接反應(yīng)）（連接反應(yīng)） 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 四四 第3頁(yè)/共25頁(yè) 背景理論知識(shí)背景理論知識(shí) Section 1 第4頁(yè)/共25頁(yè) BamHI NotI pET28a 5.37kb BamHI（661） NotI（1

2、398）pEGFP-N3 4.7kb EGFP(720bp ) EGFP(720bp )-BamHI-NotI pET28a(5.3kb) -BamHI-NotI Ligation 第5頁(yè)/共25頁(yè) 1.1.學(xué)習(xí)克隆工作中常用的單、雙酶切，載體學(xué)習(xí)克隆工作中常用的單、雙酶切，載體 去磷酸化處理等連接方法去磷酸化處理等連接方法 2.2.了解反應(yīng)中各因素對(duì)連接效率的影響了解反應(yīng)中各因素對(duì)連接效率的影響 第6頁(yè)/共25頁(yè) 4.1.2【實(shí)驗(yàn)原理】 DNA重組：在DNA連接酶的作用下,在 含有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中 ,將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA 分子進(jìn)行連接,獲得重組DNA分子。

3、第7頁(yè)/共25頁(yè) T4DNAT4DNA連接酶：連接酶：ATPATP 是輔助因子；是輔助因子； 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA連接酶連接酶 NAD+NAD+是輔助因子。是輔助因子。 第8頁(yè)/共25頁(yè) 4.1.2【實(shí)驗(yàn)原理 】 第9頁(yè)/共25頁(yè) 4.1.2【實(shí)驗(yàn)原理 】 第10頁(yè)/共25頁(yè) n 一般采用一般采用4-16 C 第11頁(yè)/共25頁(yè) 第12頁(yè)/共25頁(yè) （CIPCIP小牛腸堿性磷小牛腸堿性磷 酸酶）酸酶） 第13頁(yè)/共25頁(yè) 定向克定向克 隆隆 返回返回 第14頁(yè)/共25頁(yè) 第15頁(yè)/共25頁(yè) 第16頁(yè)/共25頁(yè) 4.1.44.1.4載體、供體濃度及比例載體、供體濃度及比例 重組重組DNA

4、DNA片段摩爾比例的換算：片段摩爾比例的換算： 100ng pET28a (5.3kb) 100ng pET28a (5.3kb) ：100ng eGFP(0.7kb100ng eGFP(0.7kb ） = =？ 1 : 7.51 : 7.5 第17頁(yè)/共25頁(yè) 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 Section 2 第18頁(yè)/共25頁(yè) 第19頁(yè)/共25頁(yè) 將插入片段與載體片段按3:1的比例 載體 2l (100ng) 目的片段(1.4kb) ?l (100ng)6l T4連接酶緩沖液 1l T4連接酶 1l ddH2O 0l 反應(yīng)總體積 10l 混合于EP管(標(biāo)記)中且混勻,Short離心 4.2.2【實(shí)驗(yàn)步驟 】 第20頁(yè)/共25頁(yè) 16 C保溫保溫14 小時(shí)小時(shí),若不馬上轉(zhuǎn)化若不馬上轉(zhuǎn)化, -20 C保存保存 該連接產(chǎn)物是下次實(shí)驗(yàn)材料 第21頁(yè)/共25頁(yè) 思思 考考 題題 單酶切重組單酶切重組DNADNA有哪些弊端，如何避免？有哪些弊端，如何避免？ 在不計(jì)算在不計(jì)算DNADNA片段濃度的情況下，如何快片段濃度的情況下，如何快 速簡(jiǎn)便的速簡(jiǎn)便的估算估算連接片段的比例？連接片段的比例？ 第22頁(yè)/共25頁(yè) 下下 次次 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 感受態(tài)細(xì)胞的制備感受