現(xiàn)代生物學實驗（三）—微生物與免疫學實驗教案

1、現(xiàn)代生物學實驗（三） 微生物與免疫學實驗教案課程名稱: 微生物與免疫學實驗英文名稱: Microbiology and Immunology Laboratory課程編號: 110026課程學時：108學時課程學分：3.0學分教師姓名: 鄭忠輝 張連茹 鄔小兵前導課程：微生物學（理論課）教學方式: 實驗及技術理論講授考試方式: 平時考核筆試實驗操作考試一、教學目標和要求微生物學與免疫學實驗是生物學重要的基礎課之一。本課程的目的是使學生掌握和了解微生物學與免疫學的主要研究方法與技術，鞏固和加深基礎理論知識，提高分析、解決問題的能力和開拓創(chuàng)新能力，培養(yǎng)學生嚴肅、嚴密、嚴格、求實的科學態(tài)度，為從事微

2、生物學與免疫學的研究和應用打下基礎。要求學生要做好實驗課前的預習，明確每次實驗的目的與基本步驟。在實驗中要有嚴緊的科學態(tài)度，對實驗過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象和問題，要仔細思考和分析；認真做好每次實驗的實驗數(shù)據(jù)記錄及處理工作。二、主要實驗內(nèi)容1. 土壤細菌的分離及總數(shù)測定2. 微生物的形態(tài)觀察與鑒定3. 消毒與滅菌效果的測定4. 海洋放線菌抗菌活性菌株的篩選5. 酵母胞外多糖的發(fā)酵及其測定6. 經(jīng)典血清學反應7. 巨噬細胞的收集和觀察8. 免疫標記技術三、主要教學方法以學生動手實驗為主，結(jié)合課堂講授、示范操作及多媒體教學。四、使用教材及主要參考書使用教材：1、林加涵等主編. 現(xiàn)代生物學實驗（下冊）. 北京

3、：高等教育出版社，2001.2、編補充講義主要參考書：1、趙斌，何紹江主編. 微生物學實驗. 北京：科學出版社，2002.2、沈萍等主編. 微生物學實驗. 第三版. 北京：高等教育出版社，19993、柳忠輝等主編.免疫學常用實驗技術.北京：科學出版社，2002年五、實驗項目模 塊1：土壤細菌的分離及總數(shù)測定1、培養(yǎng)基的配制與滅菌2、土壤細菌的分離與純化3、土壤中細菌總數(shù)的測定模 塊2：微生物的形態(tài)觀察與鑒定1、細菌的革蘭氏染色2、細菌的芽孢染色3、大分子物質(zhì)的水解試驗4、糖發(fā)酵試驗5、甲基紅試驗6、伏-普試驗7、檸檬酸鹽試驗8、細菌的快速鑒定（細菌自動鑒定系統(tǒng) BBL CRYSTAL）9、霉菌

4、的形態(tài)觀察與鑒定模 塊3：消毒與滅菌效果的測定1、中和劑的選擇2、化學消毒劑殺菌效果的定量測定模 塊4：海洋放線菌的分離及抗菌活性菌株的篩選1、放線菌的選擇分離與計數(shù)2、放線菌形態(tài)的觀察3、雙層瓊脂擴散法篩選抗菌活性菌株模 塊5：酵母胞外多糖的發(fā)酵及其測定1、酵母胞外多糖的液體發(fā)酵2、酵母子囊孢子的觀察3、酵母胞外多糖的提取與測定模 塊6：經(jīng)典血清學反應1、單向瓊脂擴散試驗2、雙向瓊脂擴散試驗3、免疫電泳4、間接凝集反應測定人血清類風濕因子模 塊7：小鼠腹腔巨噬細胞的收集和觀察1、小鼠的處死和固定2、巨噬細胞的收集，沉淀和制片3、巨噬細胞的形態(tài)觀察模 塊8：免疫標記技術1、血清抗體的純化2、辣

5、根過氧化物酶標記抗體（過碘酸鹽法）3、雙抗體夾心法測定人血清中IgG抗體含量模 塊1：土壤細菌的分離及總數(shù)測定教學要求1. 掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2. 了解各種滅菌方法的基本原理及應用范圍，掌握實驗室高壓蒸汽滅菌及干熱滅菌的操作方法。3. 了解微生物分離和純化方法，掌握純培養(yǎng)分離技術、無菌操作技術。4. 了解各種微生物數(shù)量測定方法的基本原理及應用范圍，掌握平板菌落計數(shù)的操作方法。教學學時18學時講授的內(nèi)容1. 微生物培養(yǎng)基的分類、用途、配制方法。2. 各種滅菌方法的基本原理、應用范圍、操作方法及注意事項。3. 純培養(yǎng)分離技術、無菌操作技術。4. 各種微生物數(shù)量測定方法的基本原理及應用

6、范圍，平板菌落計數(shù)法的操作步驟和注意事項。實驗項目1、培養(yǎng)基的配制與滅菌2、土壤細菌的分離與純化3、土壤中細菌總數(shù)的測定應學習的技術和方法培養(yǎng)基制作和滅菌技術、無菌操作技術、純培養(yǎng)分離技術、微生物的接種技術、微生物數(shù)量的測定方法。應學習的儀器使用方法高壓蒸汽滅菌鍋，干燥箱，培養(yǎng)箱。教學的重點和難點重點：實驗原理，相關方法、技術的介紹，分離微生物的關鍵技術，主要操作環(huán)節(jié)。難點：無菌操作、倒平板等不易掌握的實驗操作技能技巧難點的解決辦法詳細深入講解，觀看錄像，示范操作，細心現(xiàn)場指導。 模 塊2：微生物的形態(tài)觀察與鑒定教學要求1. 掌握細菌染色觀察技術及觀察霉菌形態(tài)的基本方法，進一步鞏固顯微鏡的使用

7、方法。2. 了解有關的微生物常規(guī)與快速鑒定方法與技術，掌握常用的一些基于微生物生理生化反應的鑒定方法及原理，初步掌握 BBL Crystal鑒定系統(tǒng)的操作方法。教學學時24學時講授的內(nèi)容1. 微生物的制片及各種染色技術，革蘭染色和芽孢染色的原理、操作步驟及注意事項。2. 常用的微生物常規(guī)鑒定方法，大分子物質(zhì)的水解試驗、糖發(fā)酵試驗和IMViC試驗的原理及操作方法3. 現(xiàn)代微生物快速鑒定技術，BBL Crystal鑒定系統(tǒng)的操作方法。實驗項目1、細菌的革蘭氏染色2、細菌的芽孢染色3、大分子物質(zhì)的水解試驗4、糖發(fā)酵試驗5、甲基紅試驗6、伏-普試驗7、檸檬酸鹽試驗8、細菌的快速鑒定（細菌自動鑒定系統(tǒng)

8、BBL CRYSTAL）9、霉菌的形態(tài)觀察與鑒定應學習的技術和方法微生物的制片及染色技術、觀察霉菌形態(tài)的方法、基于生理生化反應的細菌鑒定方法。應學習的儀器使用方法高壓蒸汽滅菌鍋，干燥箱，培養(yǎng)箱，顯微鏡。教學的重點和難點重點：常規(guī)的微生物鑒定方法和現(xiàn)代微生物快速鑒定技術的介紹，根霉、青霉、曲霉等霉菌的形態(tài)特征難點：制片技術，革蘭染色脫色操作技術難點的解決辦法詳細深入講解關鍵的操作環(huán)節(jié)，示范操作，細心現(xiàn)場指導 模 塊3：消毒與滅菌效果的測定教學要求了解消毒劑殺菌效果的檢測方法，掌握化學消毒劑殺菌效果的測定技術。教學學時6學時講授的內(nèi)容1. 消毒方法及原理，消毒劑殺菌效果的檢測方法。2. 中和劑的選

9、擇，懸液定量法測定化學消毒劑殺菌效果的原理、操作步驟及注意事項。實驗項目1、中和劑的選擇2、化學消毒劑殺菌效果的定量測定應學習的技術和方法中和劑的選擇方法，細菌芽孢懸液的制備方法，平板菌落計數(shù)技術。應學習的儀器使用方法高壓蒸汽滅菌鍋，干燥箱，培養(yǎng)箱，顯微鏡，離心機。教學的重點和難點重點：消毒劑殺菌效果的檢測方法介紹，中和劑的選擇方法，懸液定量法的原理、操作步驟.難點：中和劑的選擇方法難點的解決辦法詳細深入講解實驗原理及實驗設計方法，細心現(xiàn)場指導，提供相關的閱讀參考文獻。 模 塊4：海洋放線菌的分離及抗菌活性菌株的篩選教學要求1. 學習抗菌活性菌株的篩選方法。2. 學習海洋底泥中放線菌的分離及抗

10、菌活性菌株的篩選方法，掌握雙層瓊脂擴散法篩選抗菌活性菌株的操作方法。3. 鞏固無菌操作技術、純培養(yǎng)技術。4. 了解發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化及分析技術及其在藥物研發(fā)中的應用。5. 使學生了解運用微生物實驗的基本技術與方法進行科研工作的基本思路。教學學時12學時講授的內(nèi)容1 (海洋底泥)放線菌的分離及其抗菌活性物質(zhì)篩選的一般過程。講清楚為什么選擇海洋底泥中放線菌，為什么進行相關的操作。2介紹實驗所用的海洋底泥放線菌的分離方法及其相關的原理。3回顧放線菌的基本知識，講述放線菌形態(tài)觀察的基本方法及原理。4講述抗菌活性菌株篩選的常用方法及實驗中所采用的雙層瓊脂擴散方法。5主要操作步驟，培養(yǎng)基的配制及滅菌。實驗

11、項目1、放線菌的選擇分離與計數(shù)2、放線菌形態(tài)的觀察3、雙層瓊脂擴散法篩選抗菌活性菌株應學習的技術和方法樣品的采集，預處理，常用的滅菌方法，土壤稀釋法，放線菌的選擇培養(yǎng)，傾注平板法，純培養(yǎng)技術，無菌操作技術，印片法，雙層瓊脂擴散法。應學習的儀器使用方法：高壓滅菌鍋，干燥箱，電子天平，顯微鏡，培養(yǎng)箱。教學的重點和難點1在微生物學實驗基本操作技術與方法已掌握的基礎上，模擬科研過程所設計的實驗模塊，旨在讓學生實現(xiàn)由被動的做實驗到進行科研工作的思路方面的轉(zhuǎn)變。講授部分的難點是如何讓學生了解整個實驗模塊即是從放線菌中篩選抗菌素類藥物發(fā)現(xiàn)過程。另外，因為微生物理論課所學的關于放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、繁殖方式等知識

12、時間較長，因而學生在觀察放線菌的結(jié)構(gòu)形態(tài)時不容易分辨。2放線菌的分離及純培養(yǎng)，抗菌活性菌株的篩選方法。 3放線菌的氣生菌絲、孢子絲和分生孢子的印片法觀察。放線菌的氣生菌絲與分生孢子絲的區(qū)分。4放線菌菌落與細菌、霉菌等菌落的區(qū)分。難點的解決辦法聯(lián)系實際，并借鑒微生物實驗前面所學的技術與方法，讓同學了解放線菌的分離抗菌活性物質(zhì)的篩選方法，雖然是模擬科研的過程但所用的技術與方法都是微生物實驗的基本方法。引導學生借鑒土壤中細菌的分離方法，進行放線菌的分離，手把手的現(xiàn)場指導及講授時的示范。講清楚抗菌活性菌株的篩選的一般方法，重點講授雙層瓊脂擴散法用于放線菌抗菌活性菌株的篩選及主要的操作要點。通過對分離到

13、的放線菌菌落的形態(tài)觀察，引導學生從菌落的干濕程度、隆起程度、邊緣及顏色尤其是是否易于從培養(yǎng)基上挑起等方面區(qū)分細菌和放線菌；而從菌落的大小及菌落表面來區(qū)分霉菌和放線菌。以清晰明了的課件展示主要的操作步驟及注意事項，并輔以黑板上的板畫的形式來引導學生區(qū)分氣生菌絲和分生孢子絲，加上現(xiàn)場觀察指導的方式來突破難點，突出重點。模 塊5：酵母菌胞外多糖的發(fā)酵教學要求1. 通過多糖的發(fā)酵掌握微生物的液體發(fā)酵方法。2. 學習并掌握微生物胞外多糖的分離及含量分析方法。3. 認識酵母菌，并掌握酵母菌子囊孢子的觀察方法，了解產(chǎn)孢條件。了解酵母菌在科研及其食品工業(yè)上的廣泛用途。4. 鞏固無菌操作技術。5. 了解工業(yè)微生

14、物發(fā)酵的過程及其在工業(yè)生產(chǎn)的應用。6. 通過多糖的發(fā)酵使學生了解運用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)食品藥品的一般方論法。教學學時12學時講授的內(nèi)容1. 講述從菌種活化到酵母菌胞外多糖的液體發(fā)酵的一般過程。2. 介紹高碳氮比的發(fā)酵培養(yǎng)基進行多糖發(fā)酵的原理，發(fā)酵液中多糖的分離方法。3. 多糖含量測定的常用方法及其用苯酚硫酸法測定酵母胞外多糖含量的具體方法。4. 回顧酵母菌的基本知識，通過對酵母菌的有性生殖過程的講述，引出酵母菌子囊孢子形態(tài)觀察的基本方法及原理。5. 通過對酵母菌多糖的液體發(fā)酵的講述，引出微生物下游技術-常用的分離技術與分析方法。6. 講述實驗的主要操作步驟。實驗項目1、酵母胞外多糖的液體發(fā)酵2、

15、酵母子囊孢子的觀察3、酵母胞外多糖的提取與測定應學習的技術和方法液體發(fā)酵法，菌種活化，產(chǎn)孢培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，酵母菌的培養(yǎng)，無菌操作技術，染色法，苯酚硫酸法。離心操作、比色測定。應學習的儀器使用方法高壓滅菌鍋，干燥箱，電子天平，顯微鏡，搖床，離心機，冰箱，分光光度計。教學的重點和難點1這是微生物學實驗的最后一個模塊，也是學生第一次接觸液體發(fā)酵培養(yǎng)，旨在讓學生掌握實驗室規(guī)模的液體發(fā)酵技術，了解工業(yè)化液體發(fā)酵生產(chǎn)應注意的問題。同時這個模塊也是涉及的技術和方法最多，內(nèi)容最雜。實驗課的設計管理也是應該考慮的。2酵母菌胞外多糖的分離及提取方法和多糖的測定方法的原理及操作。3酵母菌的子囊孢子的產(chǎn)生及形態(tài)特征。

16、酵母菌子囊孢子的產(chǎn)生條件，子囊孢子與營養(yǎng)細胞的區(qū)別。4儀器如離心機、分光光度計等的正確使用和比色測定的正確操作。5使學生了解實驗所用的方法及其相關的原理。微生物實驗與化學實驗不同。對玻璃儀器的要求不同，前者強調(diào)無菌，后者則要求無雜質(zhì)，因而需要通過講解使學生了解。難點的解決辦法1耐心講解，注意講臺前的示范與對學生個別指導相結(jié)合的方法。對容易出錯的地方，反復強調(diào)。借鑒微生物實驗前面所學的染色方法及生物化學中已接觸過的分光光度計的使用等，讓同學注意運用所學的知識和技術解決實驗中遇到的問題。實驗程序上先進行多糖的分離提取、含量測定然后進行2. 通過對酵母菌的有性生殖過程的講述，引出酵母菌子囊孢子形態(tài)觀

17、察的基本方法及原理。結(jié)合講臺前的示范講解及現(xiàn)場指導的方式引導學生進行正確的觀察和操作。引導學生對酵母菌的子囊孢子進行觀察，區(qū)分營養(yǎng)細胞與子囊孢子。3. 以清晰明了的課件展示主要的操作步驟及注意事項，并反復強調(diào)。4多糖含量測定的常用方法及其用苯酚硫酸法測定酵母胞外多糖含量的具體方法。5通過濃硫酸的強腐蝕性以及苯酚硫酸反應中的放熱，引導學生注意正確操作和對儀器設備的維護。模塊六 經(jīng)典的血清學反應實驗教學要求1. 掌握免疫沉淀反應及凝集反應的進展和相關技術、方法要求，2. 掌握免疫反應和凝集反應的基本原理。3. 掌握單向瓊脂擴散實驗技術、雙向瓊脂擴散實驗技術和免疫電泳技術的操作方法和在微量組分檢測分

18、析中的應用。4. 掌握凝集反應技術的操作方法及其應用。教學學時9學時講授的內(nèi)容1單向瓊脂擴散實驗原理、操作步驟及注意事項2雙向瓊脂擴散實驗基本原理，操作步驟和注意事項。3免疫電泳實驗基本原理，操作步驟和注意事項。4間接凝集反應測定人血清中內(nèi)風濕因子的基本原理、步驟和注意事項。實驗項目1. 單向瓊脂擴散試驗2. 雙向瓊脂擴散試驗3. 免疫電泳4. 間接凝集反應測定人血清類風濕因子應學習的技術和方法學習瓊脂凝膠板制備技術，凝膠板打孔技術，血清抗體稀釋技術，抗原稀釋技術，瓊脂板開槽技術，電泳技術，抗原、抗體加樣技術。應學習的儀器使用方法水浴箱，電泳儀，微量加樣器。教學的重點和難點1免疫沉淀反應和免疫

19、凝集反應的區(qū)別2免疫電泳的原理和應用3瓊脂凝膠板的制備和打孔操作4雙向瓊脂擴散試驗結(jié)果分析難點的解決辦法1、重點講解免疫沉淀反應和免疫凝集反應的概念2、講解免疫電泳的原理和應用3、對瓊脂凝膠板制備和打孔進行現(xiàn)場指導4、指導學生對雙向和單向瓊脂擴散試驗結(jié)果的分析模塊七 小鼠腹腔巨噬細胞的收集和觀察教學要求 1掌握免疫細胞的分離方法2. 掌握腹腔巨噬細胞分離的原理和方法。3熟悉巨噬細胞形態(tài)，能在顯微鏡下辨別巨噬細胞。教學學時6學時講授的內(nèi)容1. 免疫細胞分離原理免疫細胞計數(shù)免疫細胞的功能檢測。2. 巨噬細胞發(fā)育：骨髓多能干細胞定向干細胞（髓樣干細胞）單核母細胞前體單核細胞單核細胞血液組織（分化為巨噬細胞）。3. 巨噬細胞的形態(tài)，功能和分布。4. 巨噬細胞的分離和純化方法。實驗項目1. 小鼠的處死和固定2. 腹腔注射生理鹽水，巨噬細胞的收集，沉淀和制片3. 巨噬細胞的形態(tài)觀察應學習的技術和方法學習小鼠腹腔注射技術，腹腔解剖技術，腹腔液稀釋技術，巨噬細胞制片技術。應學習的儀器使