DNA重組技術(shù)的基本工具教學(xué)實(shí)錄

1、“dna重組技術(shù)的基本工具”教學(xué)實(shí)錄（模擬）師：1973年轉(zhuǎn)基因微生物一一轉(zhuǎn)基因大腸桿菌問(wèn)世：美國(guó)科學(xué)家科恩利用大腸 桿菌做材料，分別提取出兩種不同抗藥基因的dna,再重新植入大腸桿菌內(nèi)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新的大腸桿菌不但能抵抗兩種藥物，而且它的后代都有了這種特 性，代代相傳；1980年科學(xué)家把一種猿猴病毒的dna注射入一只小鼠的受 精卵，獲得第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一一轉(zhuǎn)基因小鼠誕生；1983年第一例轉(zhuǎn)基因 植物一一轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)，是一種耐受抗菌素的煙草。這些工作實(shí)現(xiàn)了一種 生物的某些性狀在另一種生物中的表達(dá)。同學(xué)們，性狀由什么決定？生：基因加環(huán)境。師：假若這是一個(gè)dna上的能指導(dǎo)合成某種藥物蛋白的基因（

2、展示模型），而這 是一條煙草的da,請(qǐng)同學(xué)們分析，要實(shí)現(xiàn)在煙草中的表達(dá)，要做哪些關(guān)鍵 工作？生：1、要將藥物基因切割下來(lái)；2、要將藥物基因整合到煙草的da上。師：同學(xué)們說(shuō)得對(duì)！但還應(yīng)該實(shí)際考慮問(wèn)題，這兩條紙帶所代表的da是在同一 個(gè)細(xì)胞中嗎？生：不是。師：所以這里就存在一個(gè)基因轉(zhuǎn)移的實(shí)際問(wèn)題，就是如何將控制合成藥物的基因 轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞。這些都是在分子水平上進(jìn)行的，切割也好，連接也好，轉(zhuǎn)移 也好，無(wú)一例外。中國(guó)有句俗話叫“沒(méi)有金剛鉆兒，不攬瓷器活兒”。科學(xué) 家們?cè)趯?shí)施基因工程之前，苦苦求索，終于找到了實(shí)施基因工程的三種“金 剛鉆兒”，使基因工程的設(shè)想成為了現(xiàn)實(shí)。這三種“金剛鉆兒”是什么？生：一是

3、準(zhǔn)確切割dna的工具，“分子手術(shù)刀”一一限制酶；二是dna片段的連 接工具，“分子縫合針” 一一dna連接酶；三是基因轉(zhuǎn)移工具，“分子運(yùn)輸車(chē)” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體。下面我們就來(lái)學(xué)習(xí)這方面的內(nèi)容（板書(shū)）。 我們先看看科學(xué)家是如何尋找限制酶的。自然界中有各種生物，它們所處的 環(huán)境不是真空。一些生物的dna可能進(jìn)入另一種生物的細(xì)胞中嗎？生：可能。師：有沒(méi)有實(shí)例?生：噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)。師：那么現(xiàn)今存在的生物為什么沒(méi)有在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中因?yàn)楸煌庠磀na的入侵 而滅絕，仍能保持一種穩(wěn)定狀態(tài)呢？生：生物體有的有免疫系統(tǒng)，如動(dòng)物；有的有保護(hù)作用的組織、器官，如植物。 師：那么作為單細(xì)胞的生物沒(méi)有那么復(fù)

4、雜的結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)，它們是如何抵抗入侵的外源da,保護(hù)自身呢？生：只有讓外來(lái)的da失效，才能保護(hù)自身。師：那么怎樣才能讓da失效？生：用da酶。師：用da酶，那么生物自身的da是不是也失效了？生：那是一種特殊的酶，能切割外來(lái)的dxa,而對(duì)自身的dna不切割。師：也就是說(shuō)，這種酶是一種不同于dna酶的其它酶。同學(xué)們有了從哪里獲得這 種酶的意向了嗎（板書(shū)：來(lái)源）？生：到單細(xì)胞的生物中去找。師：科學(xué)家的基本意向也和同學(xué)們一樣。單細(xì)胞生物比多細(xì)胞生物更容易受到外 源da的侵入。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，使其必須有處理外源dna的酶。正如 課本第4頁(yè)所描述的，科學(xué)家們經(jīng)過(guò)不懈的努力，終于從原核生物中分離純 化出這

5、種酶，叫限制酶。迄今已從近300種微生物中分離出4000種限制酶。 但限制酶不只存在于原核生物中，例如。另外，限制酶是一大類(lèi)酶， 不是一種酶。這種酶與我們以前所學(xué)的dna酶的作用是不同的。請(qǐng)同學(xué)們看 書(shū)，限制酶有什么作用（板書(shū)：作用）？生：它們能夠識(shí)別雙鏈dna分子的某種特定核昔酸序列，并且使每一條鏈中特定 部位的兩個(gè)核甘酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。師：以上這句話，說(shuō)出了兩層意思。一是識(shí)別特定核甘酸序列。請(qǐng)同學(xué)們看模型, ecori（解釋課本第5頁(yè)關(guān)于限制酶的命名）只能識(shí)別gaattc的核甘酸序列, smal只識(shí)別cccggg的核甘酸序列。這種能被特異性切割的部位都具有回文 序列，也就是在切割部位

6、，一條鏈正向讀的堿基順序，與另一條鏈反向讀的 順序完全一致。b|j：限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基， 都可以找到一條中心軸線，中心軸線兩側(cè)的雙鏈dna上的堿基是反向?qū)ΨQ(chēng)、 重復(fù)排列的。第二層意思是從特定部位的兩個(gè)核甘酸之間切開(kāi)。ecori就從 g和a之間切開(kāi)，smal就從c和g之間切開(kāi)。剛才我們提到科學(xué)家們已經(jīng)分離出4000多種限制酶。由于酶的不同，它們 識(shí)別的特定核甘酸序列也不同，這是根據(jù)酶的什么特點(diǎn)？生：專(zhuān)一性。師：是的，這樣就為我們切割dna提供了多種特定的“手術(shù)刀”。但它們切割dna 后形成的末端有兩種可能，請(qǐng)同學(xué)們看圖回答。生：一種形成黏性末端，一種形成平末端。師：是

7、的，（展示模型）限制酶在它識(shí)別序列的中心位置兩側(cè)將da兩條鏈分割 開(kāi)，就形成黏性末端，而從識(shí)別序列的中心位置切開(kāi)就產(chǎn)生平末端。這兩種 切割方式依次叫做錯(cuò)位切和平切。切斷的da片段要與受體細(xì)胞的da連接，需要用什么酶連接（板書(shū)：分子 縫合針：dna連接酶）？生：dna連接酶。師：是的，dna連接酶與以前所學(xué)的dna聚合酶有什么不同？生：dna連接酶是將雙鏈的dna片段連接起來(lái)，而da聚合酶則是將一個(gè)個(gè)脫氧 核甘酸連接起來(lái)。師：是的。那它們連接的是磷酸二酯鍵還是氫鍵？生：磷酸二酯鍵（板書(shū)：作用）。師：是的。可以設(shè)想，如果把兩種來(lái)源不同的dna用同一種限制酶來(lái)切割，然后 讓兩者的黏性末端黏合起來(lái)，似

8、乎就可以合成重組的dna分子。但是，實(shí)際 上僅僅這樣是不夠的，互補(bǔ)的堿基處雖然通過(guò)氫鍵連接起來(lái)，兩邊的扶手的 斷口處還沒(méi)有連接起來(lái)。要把扶手的斷口處連接起來(lái)，也就是把兩條dna 末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，就要靠dxa分子“縫合針” 一一dna連接酶。 開(kāi)始時(shí)，我們學(xué)習(xí)了限制酶切割后有兩種不同的結(jié)果，一種產(chǎn)生黏性末端， 一種產(chǎn)生平末端。那么恢復(fù)它們的連接，所用的dna連接酶是否相同呢？請(qǐng) 同學(xué)們從課本中尋找答案（板書(shū)：分類(lèi)）。生：不是的，ecolidan連接酶只能將雙鏈dna片段黏性末端之間連接起來(lái)，不 能將雙鏈dna片段平末端之間連接起來(lái)。t.dna連接酶既可縫合雙鏈黏性末端，也可縫合雙鏈d

9、a的平末端，但平末端之間連接的效率比較低。師：?jiǎn)渭兊膁na片段是很難導(dǎo)入受體細(xì)胞的，所以我們切割下來(lái)的目的基因?qū)?受體細(xì)胞就需要有一個(gè)“分子運(yùn)輸車(chē)”幫助。那么具備什么條件才能充當(dāng)“分 子運(yùn)輸車(chē)”？請(qǐng)大家結(jié)合課本第6頁(yè)的旁欄思考題思考以下問(wèn)題。1、假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？2、作為載體沒(méi)有切割位點(diǎn)將怎樣？3、目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何去觀察？4、如果教體對(duì)受體細(xì)胞有害怎樣？載體不能從細(xì)胞中分離會(huì)怎樣？生：（提問(wèn)回答）1、導(dǎo)入受體細(xì)胞的目的基因不能復(fù)制，將在細(xì)胞增殖中丟失。2、教體沒(méi)有切割位點(diǎn)，外源的目的基因不可能插入。3、如果載體上有遺傳標(biāo)記基因，這樣，在載體進(jìn)入受體細(xì)胞

10、后，就可通過(guò) 標(biāo)記基因的表達(dá)來(lái)檢測(cè)。5、載體對(duì)受體細(xì)胞有害，將影響受體細(xì)胞新陳代謝，進(jìn)而使轉(zhuǎn)入的目的基 因也無(wú)立足之地。載體不能分離，就不能獲得更多帶有目的基因的載體。 師：以上內(nèi)容都是在選擇合適載體時(shí)必須考慮的。請(qǐng)同學(xué)們閱讀課文，歸納出充 當(dāng)基因進(jìn)入受體細(xì)胞載體的必要條件（板書(shū)）。生：1、能自我復(fù)制。2、有切割位點(diǎn)。而且每種酶切點(diǎn)最好只有一個(gè)。因?yàn)槎喾N限制性?xún)?nèi)切酶只 能識(shí)別單一切點(diǎn)，若載體上有一個(gè)以上的酶切點(diǎn)，則切割重組后可能丟 失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū)，則進(jìn)入受體細(xì)胞后便不能自 主復(fù)制。3、有遺傳標(biāo)記基因。4、對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害、易分離。師：一般來(lái)說(shuō)，天然我體往往不能同時(shí)具備載體必

11、須具備的條件，所以在基因工 程中需要根據(jù)不同的目的和需要，對(duì)載體進(jìn)行人工改造。目前使用的載體有質(zhì)粒、入噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等，通常是利用 質(zhì)粒作為載體。質(zhì)粒是能“友好”寄宿在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的小型的獨(dú)立于擬核 dna或酵母菌細(xì)胞核染色體之外的具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀裸露dnao 下面我們就通過(guò)插圖一起來(lái)認(rèn)識(shí)質(zhì)粒，尤其要在質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)模式圖上找出剛才歸納的幾個(gè)條件的具體表現(xiàn)。生：“復(fù)制原點(diǎn)”一一說(shuō)明質(zhì)粒能復(fù)制并能帶著插入的目的基因一起復(fù)制?！澳康幕虻牟迦胛稽c(diǎn)”一一說(shuō)明質(zhì)粒有切割位點(diǎn)。“氨卞青霉素抗性基因”一一說(shuō)明有標(biāo)記基因的存在，將來(lái)可用含青霉素的 培養(yǎng)基鑒別。質(zhì)粒來(lái)自大腸桿菌一一說(shuō)明沒(méi)有危害，大腸桿菌是非致病菌，大腸桿菌分裂 快，也便于從大量復(fù)制個(gè)體中分離出來(lái)。需要說(shuō)明的是，在基因操作過(guò)程中使用載體有兩個(gè)目的：一是用它作為運(yùn)載 工具，將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中去；二是利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基 因進(jìn)行