酶分子修飾(NXPowerLite)課件

1、酶分子修飾(NXPowerLite)1 Chapter 4 Modification of Enzyme Molecule 酶的分子修飾酶的分子修飾 酶分子修飾(NXPowerLite)2 Contents of chapter 4 1、什么是酶分子修飾 2、酶分子修飾的基本要求和條件 3、酶分子的修飾方法 4、酶修飾后的性質(zhì)變化 Go Go Go Go 5、酶的定向進化Go 酶分子修飾(NXPowerLite)3 4.1 4.1 什么是酶分子修飾？什么是酶分子修飾？ o通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變 酶的某些特性和功能的技術(shù)過

2、程稱為酶分子修飾。酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即： 在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團（物 質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進行共價連接， 從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。 酶分子修飾(NXPowerLite)4 酶分子修飾的意義 o提高酶的活力活力 activityactivity o增強酶的穩(wěn)定性穩(wěn)定性 stabilitystability o降低或消除酶的抗原性抗原性 immunological propertyimmunological property o研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子 和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響 structurestr

3、ucture 回本章目錄 酶分子修飾(NXPowerLite)5 4.2 酶分子修飾的基本要求和條件酶分子修飾的基本要求和條件 o對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的 選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。 n（1 1）酶的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性 o熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pHpH、抑制劑等。、抑制劑等。 n（2 2）酶活性中心的狀況酶活性中心的狀況 o活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、 亞基數(shù)等。

4、亞基數(shù)等。 酶分子修飾(NXPowerLite)6 酶分子修飾的條件酶分子修飾的條件 o修飾反應(yīng)盡可能在修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量下進行，并盡量不破壞酶不破壞酶 活性功能的必需基團活性功能的必需基團，使，使修飾率高修飾率高，同時酶的，同時酶的活力回收活力回收 高高。 n（1 1）pHpH與離子強度與離子強度 opHpH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由 于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。 n（2 2）修飾反應(yīng)的溫度與時間修飾反應(yīng)的溫度與時間 o嚴(yán)格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非

5、專嚴(yán)格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專 一性的修飾反應(yīng)。一性的修飾反應(yīng)。 n（3 3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例 回本章目錄 酶分子修飾(NXPowerLite)7 4.3 4.3 酶分子的修飾方法酶分子的修飾方法 o金屬離子置換修飾金屬離子置換修飾, , o大分子結(jié)合修飾大分子結(jié)合修飾( (共價共價/ /非共價非共價) ) o側(cè)鏈基團修飾側(cè)鏈基團修飾 o肽鏈有限水解修飾肽鏈有限水解修飾 o氨基酸置換修飾氨基酸置換修飾 o酶分子的物理修飾酶分子的物理修飾 酶分子修飾(NXPowerLite)8 (1) (1) 酶的金屬離子置換修飾酶的金屬離子置換修飾 o把酶分子

6、中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能 發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。 o-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)， 過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子 （Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+) o若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。 如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分 恢復(fù)。若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特 性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力 提高或者增加酶的穩(wěn)定性。 酶分子修飾(NXPowerLite)9

7、 金屬離子置換修飾的過程金屬離子置換修飾的過程 p a. 酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲 得具有一定純度的酶液。 p b. 除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑， 如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。 通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。 此時，酶往往成為無活性狀態(tài)。 p c. 加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶 蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬 離子置換后的酶。 p 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本

8、來含有金屬離子的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。 p 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。 酶分子修飾(NXPowerLite)10 (2) (2) 酶的大分子修飾酶的大分子修飾 o使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加 物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表 面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。 o一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶 的微環(huán)境來保護酶的活力。 o另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用

9、時，其表面區(qū) 域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。 非共價修飾非共價修飾 酶分子修飾(NXPowerLite)11 o用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵 連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。 o例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶 ，不僅可以降低或消除酶的 抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期 從而提高了酶藥效。 o每分子核糖核酸酶與6.56.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高 到原有酶活力的2.252.25倍； o每分子胰凝乳蛋白酶與1111分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶 活力的5.15.1倍 共價修飾共價修飾 酶分子修飾

10、(NXPowerLite)12 大分子修飾大分子修飾( (共價共價) )的過程的過程 o修飾劑的選擇修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如， 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀 糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾 劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。 o修飾劑的活化修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團往往不能直接與酶分子的基團 進行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與 酶分子的某側(cè)鏈基團進行反應(yīng)。 o修飾修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定 的比例混合，在一定的溫度

11、、pH值等條件下反應(yīng)一段時間，使修飾劑的 活化基團與酶分子的某側(cè)鏈基團以共價鍵結(jié)合，對酶分子進行修飾。 o分離分離：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子 分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。 酶分子修飾(NXPowerLite)13 o聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性， 在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的 抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而， 它被廣泛用于酶的修飾。它被廣泛用于酶的修飾。 酶 半衰

12、期相對穩(wěn)定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇聚乙二醇-SOD-SOD 35 h35 h 350350 酶分子修飾(NXPowerLite)14 (3) (3) 酶分子的側(cè)鏈基團修飾酶分子的側(cè)鏈基團修飾 o采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶 蛋白的側(cè)鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶 分子的特性和功能的修飾方法。 o可以用于研究各種基團在酶分子中的作 用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。 在研究酶的活性中心中的必需基團時經(jīng) 常采用。 o酶蛋白的側(cè)鏈基團是指組成蛋白質(zhì)的

13、氨 基酸殘基上的功能團。主要包括 等。這些基團 可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結(jié)構(gòu) 的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團一 旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變， 從而改變酶的特性和功能。 酶分子修飾(NXPowerLite)15 催化活性催化活性/ /非催化活性基團的修飾非催化活性基團的修飾 o對非催化基團修飾可改變酶的動力學(xué)性質(zhì)，改變酶對特對非催化基團修飾可改變酶的動力學(xué)性質(zhì)，改變酶對特 殊底物的束縛能力。殊底物的束縛能力。 o經(jīng)常被修飾的殘基是：經(jīng)常被修飾的殘基是： n親核的親核的SerSer、CysCys、MetMet、ThrThr、LysLys、HisHis n親電的親電的TyrTyr、Tr

14、pTrp o對催化活性基團可以通過選擇性修飾側(cè)鏈成分來實現(xiàn)氨對催化活性基團可以通過選擇性修飾側(cè)鏈成分來實現(xiàn)氨 基酸的取代?；岬娜〈?。 酶分子修飾(NXPowerLite)16 酶分子修飾(NXPowerLite)17 酶分子修飾(NXPowerLite)18 酶分子修飾(NXPowerLite)19 酶分子修飾(NXPowerLite)20 酶分子修飾(NXPowerLite)21 酶分子修飾(NXPowerLite)22 酶分子修飾(NXPowerLite)23 (4) (4) 酶蛋白主鏈修飾酶蛋白主鏈修飾( (肽鏈有限水解修飾肽鏈有限水解修飾) ) o利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子

15、的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu) 發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。 o酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/ /酶原激活法。酶原激活法。 a a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 HCl 胃胃蛋蛋白白酶酶原原 pH1.52 （從從N N端端失失去去4 44 4個個氨氨基基酸酸殘殘基基） 自自身身激激活活 胃胃蛋蛋白白酶酶 酶分子修飾(NXPowerLite)24 酶分子修飾(NXPowerLite)25 b b、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogentrypsin

16、ogen）的激活）的激活 酶分子修飾(NXPowerLite)26 酶分子修飾(NXPowerLite)27 c c、胰凝乳蛋白酶原（、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogenchymotrypsinogen）的激活）的激活 酶分子修飾(NXPowerLite)28 o氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如， Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲 氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解 能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾 法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進行修飾， 操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。 o

17、現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點突變技術(shù)定點突變技術(shù)。定點突變 （site directed mutagenesissite directed mutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種 基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改 變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（Protein Protein EngineeringEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點突 變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進、可靠、行之 有效的手段。 (5) (5) 氨基酸置換修飾氨基酸置換修飾 酶分子修飾(NXPowerLite)29 酶分

18、子的定點突變酶分子的定點突變 1 1、基因序列分析、基因序列分析 2 2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 3 3、酶活性中心分析、酶活性中心分析 4 4、引物設(shè)計進行基因定點突變、引物設(shè)計進行基因定點突變 5 5、酶基因克隆表達(dá)、酶基因克隆表達(dá) 6 6、變異特性分析、變異特性分析 酶分子修飾(NXPowerLite)30 (6) (6) 酶分子的物理修飾酶分子的物理修飾 o通過物理修飾，可以了解不同物理條件下，特別是在極 端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分 子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。 o特點在于不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共 價鍵不發(fā)生改變，只是

19、在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生 某些變化和重排。 回本章目錄 酶分子修飾(NXPowerLite)31 4.4 4.4 酶修飾后的性質(zhì)變化酶修飾后的性質(zhì)變化 o熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。 o抗原性抗原性：比較公認(rèn)的是：比較公認(rèn)的是PEGPEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果 比較明顯。比較明顯。 o各類失活因子的抵抗力各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的 抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。 o半衰期半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得

20、到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后， 增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。 o最適最適pHpH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pHpH發(fā)生了變化，這種變發(fā)生了變化，這種變 化在應(yīng)用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適化在應(yīng)用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pHpH更接近于生理環(huán)境，更接近于生理環(huán)境， 在臨床應(yīng)用上有較大意義。在臨床應(yīng)用上有較大意義。 oKmKm的變化的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，VmVm沒有明顯

21、變化，但有些酶經(jīng)修飾沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾 后，后，KmKm值變大。值變大。 回本章目錄 酶分子修飾(NXPowerLite)32 4.5 4.5 酶的定向進化酶的定向進化 o酶分子的酶分子的合理設(shè)計合理設(shè)計(rational design)(rational design) o酶分子的酶分子的定向進化定向進化(directed evolution)(directed evolution) 酶分子修飾(NXPowerLite)33 酶的合理設(shè)計酶的合理設(shè)計 酶分子修飾(NXPowerLite)34 o理論上，蛋白質(zhì)分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能理論上，蛋白質(zhì)分子蘊藏著很大的進化潛力，

22、很多功能 有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進化的基本先決條件。有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進化的基本先決條件。 o所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬于蛋白所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬于蛋白 質(zhì)的非合理設(shè)計，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化質(zhì)的非合理設(shè)計，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化 機制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進化機制機制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進化機制 ( (隨機突變、重組和自然選擇隨機突變、重組和自然選擇) )，在體外改造酶基因，并，在體外改造酶基因，并 定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。 o酶的體外定向進化技術(shù)極大地拓展

23、了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研酶的體外定向進化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研 究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計所不能解決的究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計所不能解決的 問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且 正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。 酶分子修飾(NXPowerLite)35 o在待進化酶基因的PCR擴增反應(yīng)中，利用Taq DNA聚合酶 不具有3-5校對功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很 低的比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變庫，憑 借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))， 從而排除其他突變體。 o定向進化的基本規(guī)則是“”。 。前者是人為引發(fā)的，后者雖 相當(dāng)于環(huán)