開題論證報告陸惠

1、真誠為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請指正。湖南中醫(yī)藥大學(xué)2009級碩士研究生學(xué)號：20093149開 題 論 證 報 告右歸丸對卵巢早衰模型小鼠Th17/Treg表達的影響研 究 生： 陸惠導(dǎo) 師： 丁 青 教授專 業(yè)： 中西醫(yī)結(jié)合婦科學(xué)研究方向： 婦科內(nèi)分泌病癥防治機理研究中國湖南長沙二零一一年五月目 錄附：中英文縮略詞表 2一、項目研究的意義 3二、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析 3 （1）中醫(yī)對卵巢早衰的認識 3 （2）對右歸丸的認識 4 (3) 西醫(yī)對POF的認識 41. Thl7的調(diào)控52. Treg的調(diào)控6三、實驗方案 71 研究內(nèi)容 72 實驗材料 72.1實驗藥物 72.2常用試劑8

2、2.3實驗動物 8 2.4實驗儀器 83.實驗方法 9 3.1實驗分組 93.2 造模 103.3 給藥方法 10 3.4 實驗取材 11 3.5 檢測方法 114. 統(tǒng)計學(xué)處理 115.技術(shù)路線圖12四、畢業(yè)論文整體設(shè)計13五、時間安排13六、參考文獻14附：綜述19【中英文縮略詞表】卵巢早衰 POF卵泡刺激素 FSH黃體生成素 LH孕激素 P雌激素 E2抗透明帶抗體 AzpAb轉(zhuǎn)化生長因子- TGF-卵泡抑制素- INH-抗苗勒激素 AMH調(diào)節(jié)性T 細胞 Treg輔助T淋巴細胞17 Th17維甲酸相關(guān)孤兒素受體-t R0R-t叉頭轉(zhuǎn)錄因子3 Foxp3信號傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物5 STST-

3、5白細胞介素-2 IL-2 白細胞介素-6 IL-6 白細胞介素-12 IL-12 白細胞介素-17 IL-17白細胞介素-23 IL-23 完全弗氏佐劑-透明帶多肽 CFA-PZP3 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA簇分化抗原4 CD4一、項目研究的意義 卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指性器官發(fā)育正常的女性在40歲以前出現(xiàn)閉經(jīng)，伴卵泡刺激素(follicle stimulating hormone， FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone， LH)水平升高，雌激素（estradiol, E2）水平降低，卵泡數(shù)量減少，卵巢體積縮小并

4、最終萎縮的卵巢功能衰退現(xiàn)象。發(fā)病率約為1%3%1 。目前POF的發(fā)病機理尚無定論。發(fā)病原因包括遺傳免疫因素、理化因素、代謝因素、促性腺因素及其酶和受體的缺陷、各種感染、精神心理因素等。近年來，臨床發(fā)病率有逐年上升趨勢。大約10%30%的POF是由于免疫系統(tǒng)不能識別自身卵巢組織所致,該類患者常合并多種自身免疫性疾病2。本病影響夫妻生活質(zhì)量和正常生育,且絕經(jīng)后癥狀明顯，患者出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、心血管病變及脂質(zhì)代謝紊亂等癥狀，因治療相對困難給患者及其家庭造成痛苦。西醫(yī)激素替代療法有遠期雌激素依賴性腫瘤風(fēng)險,輔助贈卵有倫理學(xué)爭議及流產(chǎn)風(fēng)險, 近年報道的卵巢組織凍存法（OTCP）成功率低。而中醫(yī)藥治療臨床報道

5、有一定的療效且無副作用。因此，積極探討自身免疫性POF發(fā)病機理可望開辟一條經(jīng)濟、安全而有效的中醫(yī)藥防治道路。二、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析（1）中醫(yī)對卵巢早衰的認識傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為，本病屬 “血膈”、“血枯”、“閉經(jīng)”、“年未老經(jīng)水?dāng)唷?、“不孕”等范疇。馮氏錦囊秘錄曰：“氣之根腎中之真陽也；血之根腎中之真陰也”。沖任通盛以腎氣盛為前提，受天癸調(diào)節(jié)，故沖任之本在腎。胞宮司月經(jīng)，腎與胞宮相系，故腎是產(chǎn)生月經(jīng)的基礎(chǔ)。內(nèi)經(jīng)云：“女子七歲腎氣盛，齒更，發(fā)長；二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下；七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也?！?傅青主女科曰：“經(jīng)水出諸腎”、“經(jīng)水早斷，似乎腎水衰涸

6、”。說明腎氣的盛衰主宰著天癸的至與竭，月經(jīng)的行與止?？梢娔I在女性生殖生理中有不可替代的作用。卵巢早衰的臨床特點就是未至絕經(jīng)年齡而過早絕經(jīng)，因此對該病的治療多從腎虛考慮。中醫(yī)腎主生殖中，腎代表了腦、沖任、天癸、腦腎間功能的控制和調(diào)節(jié)，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過下丘腦、垂體和卵巢間生殖功能調(diào)節(jié)有相應(yīng)之處。大量研究結(jié)果及臨床觀察表明，“腎虛”患者生殖內(nèi)分泌存在不同程度的功能異常3。因此，腎虛是卵巢早衰的主要病機。卵巢早衰以陽虛為主，卵子是腎所藏之精，腎精是其物質(zhì)基礎(chǔ)。腎精充盛，則卵子得以正常發(fā)育。陽主乎動，只有通過腎陽的鼓動，天癸才能至，任脈才能通，太沖脈才能盛，月時才能以時下。“腎者主蟄，司

7、開合”，腎主閉藏，司開合是腎陽功能的表現(xiàn)。腎陽保證腎在排卵前只合不開，發(fā)揮主蟄主閉藏之功能，腎藏精而不瀉，腎精充盛，卵子發(fā)育成熟；陽主乎動，腎陽之氣化使腎在排卵期短暫開放，作為內(nèi)在動力鼓動成熟卵子排出。若腎陽虧虛，閉藏功能失調(diào)，當(dāng)合不合，則卵泡不能發(fā)育成熟，當(dāng)開不開，則不能作為內(nèi)在動力而鼓動卵子釋放。陰陽互根互用，腎陽虧虛可致腎陰陽的動態(tài)平衡失調(diào)，最終引起腎陰虛或腎陰陽兩虛。而腎陰虛則表現(xiàn)為卵巢功能不足或衰退，沒有發(fā)育的卵泡或卵泡不能發(fā)育成熟造成E2水平低落，垂體功能亢進，F(xiàn)SH水平升高，從而對垂體促性腺激素的分泌失去負反饋作用。腎陰陽兩虛則陰氣不能潤澤、陽氣失于施化、天癸難于泌至、沖任之氣行

8、艱，故至經(jīng)水?dāng)嘟^或不孕。（2）對右歸丸的認識右歸丸出自明代杰出醫(yī)家張景岳之景岳全書，由熟地、山藥、山茱萸、枸杞、鹿角膠、菟絲子、杜仲、當(dāng)歸、肉桂、制附子組成，具有溫補腎陽，填精益髓之功，是“陰中求陽”的代表方。方中附子、肉桂、鹿角膠為君藥，溫陽化氣，直補腎陽；臣以熟地黃、枸杞子、山茱萸、山藥滋陰益腎，養(yǎng)肝補脾；佐以杜仲、菟絲子共補肝腎之陰；當(dāng)歸養(yǎng)血和血，配伍補腎之品，養(yǎng)血補經(jīng)。全方補陽藥與補陰藥相配，則陽得陰助，生化無窮。有助于卵巢功能的調(diào)節(jié)和排卵功能的恢復(fù)。古代醫(yī)家在應(yīng)用有歸丸時，病種以不孕不育10.87%、虛勞9.78%、腰痛8.70%居前位，現(xiàn)代醫(yī)家應(yīng)用右歸丸時，以不孕不育14.3%、虛

9、勞11.9%、泄瀉10.7%居前位。從醫(yī)案記載的癥狀來看，不孕不育、虛勞、腰痛等病種，病機均為腎陽虛衰、腎精不足。故選右歸丸以溫補腎陽，補腎填精。而有關(guān)泄瀉病案中，其病機多為脾腎陽虛，故在選用右歸丸溫補腎陽的同時，還常與溫運脾陽之方如四神丸、理中丸等合用以溫腎暖脾、固腸止瀉?？梢姽沤襻t(yī)家在應(yīng)用右歸丸時，其適應(yīng)證為腎陽虛衰所致的不孕不育、虛勞、腰痛、泄瀉等病種。管華全，樊巧玲，張永文.腎氣丸與右歸丸主治疾病比較。浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，34（1）。臨床應(yīng)用該方治療不孕癥、更年期綜合征、骨質(zhì)疏松療效顯著4-5。從大量動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，本方對下丘腦-垂體-卵巢-性腺軸具有多層次的調(diào)節(jié)作用，并

10、能延緩衰老6，抑制卵巢卵泡細胞凋亡7，調(diào)節(jié)機體免疫力8作用。右歸丸能降低病理性囊性卵泡數(shù)，促進卵泡發(fā)育成熟及排出，并促進黃體形成，能增加血清中E2含量9。在自身免疫疾病的治療方面能夠降低自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的發(fā)病率，能通過上調(diào)EAE緩解期血漿Th1/ Th2水平或下調(diào)CD4+表達，下調(diào)CD4+/ CD8+的水平減輕自身免疫疾病的嚴重程度10-11。(3) 西醫(yī)對POF的認識POF 的發(fā)病因素復(fù)雜，發(fā)病原因尚不清楚，目前研究認為與遺傳因素、自身免疫因素、先天性酶缺乏及醫(yī)源性損傷等有關(guān)。早在上世紀(jì)90年代即有研究表明POF患者存在多種自身抗體或伴有自身免疫性疾病。在某些POF患者血中都可測

11、出高濃度的抗透明帶抗體（AzpAb），抗卵巢抗體（AoAb）和抗顆粒細胞抗體（MG-Ab）12。對POF患者的卵巢活檢發(fā)現(xiàn)，卵巢內(nèi)各級卵泡周圍存在淋巴細胞和白細胞浸潤。其機制是在體內(nèi)卵巢抗原及透明帶抗原等自身抗原的作用下，產(chǎn)生大量自身免疫抗體，與細胞免疫有關(guān)的初始CD4+ T細胞接受抗原刺激信號，在共刺激信號的作用下活化，在不同的條件下分化成不同亞型的T淋巴細胞，包括Th1型、Th2 型、Th17 型效應(yīng)T細胞，或調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg細胞），執(zhí)行不同的生物學(xué)功能13,這些淋巴細胞亞群在各種細胞因子的協(xié)同作用下導(dǎo)致卵巢自身免疫異常，使卵巢組織細胞損傷，原始卵泡數(shù)量減少、卵泡閉鎖增加或加速、卵

12、泡成熟障礙，抗苗勒激素(anti-mullerian hormone,AMH)下降，最終表現(xiàn)為卵巢合成性激素功能低下或者不能合成，降低了對下丘腦-垂體軸的負反饋作用，導(dǎo)致FSH、LH升高，E2的降低 14 而發(fā)生POF。研究表明，AMH與早期竇卵泡數(shù)目呈顯著正相關(guān)，這種相關(guān)性大于竇卵泡數(shù)與卵泡抑制素-（INH-）和FSH的相關(guān)性。AMH比INH-和FSH等更能反應(yīng)卵巢儲備功能15。血清AMH的濃度可以反映始基卵泡庫的大小，能夠作為卵巢儲備功能的標(biāo)志物。在POF患者中，血清AMH水平明顯低于正常女性16。目前對于CD4+分化的兩大細胞亞群Th1細胞/ Th2細胞的失衡與POF關(guān)系的研究已頗具成果

13、。然而Th17細胞和Treg細胞這兩個在其他自身免疫性疾病中已成為新的研究熱點的T細胞亞型，在自身免疫性POF中的研究還有待深入。Th17 細胞具有獨立的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機制，能表達IL-6、IL-17和TNF-等炎性細胞因子，與多種免疫失調(diào)性疾病相關(guān)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及多發(fā)性硬化癥等患者的血清及組織中均能檢測到IL-17 的高表達17-19。Treg 細胞是一類能夠控制免疫應(yīng)答強度，減輕對機體組織損傷的具有免疫抑XXX用的T 細胞亞群。研究發(fā)現(xiàn)在多種自身免疫性疾病中，均存在Treg細胞的功能缺陷或數(shù)量減少20。Th17 /Treg細胞平衡狀態(tài)的打破是很多自身免疫性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因

14、素。自身免疫性POF可能與Th17細胞的過度激活和（或）Treg細胞數(shù)目減少有關(guān)。1. Thl7的調(diào)控2005年，Park等21和Harrington等22研究發(fā)現(xiàn)，IL-23通過促進CD4+T細胞分泌炎性細胞因子IL-17而發(fā)揮其促炎效應(yīng)，因此IL-23 p19基因的敲除影響了細胞因子IL-17的水平，間接影響自身免疫性疾病的發(fā)生，并首次提出Thl7細胞的概念Xu等23做了一項研究，體外激活純化的小鼠CD25+T細胞后產(chǎn)生大量TGF-,IL-6存在時CD4+CD25+Foxp3+T細胞分化為Thl7。因此IL-6是決定初始CD4+T細胞分化為Treg還是Thl7的關(guān)鍵因子。研究發(fā)現(xiàn)Thl7能

15、自分泌產(chǎn)生IL-21來促進自身分化進程24IL-6可誘導(dǎo)Th17自分泌IL-2l，后者通過正反饋誘導(dǎo)IL-21和IL-23R的表達，同時IL-21誘導(dǎo)STATA3表達并與IL-23系統(tǒng)共同誘導(dǎo)維甲酸相關(guān)孤兒素受體t (R0R-t )表達，促進IL-17的產(chǎn)生25。總之，Thl7的分化主要包括3個階段：TGF-和IL-6首先啟動Thl7分化，IL-21介導(dǎo)Thl7擴大分化規(guī)模，IL-23則在分化后期維持Thl7穩(wěn)定分化成熟。R0Rt 是Th17分化的重要轉(zhuǎn)錄因子26。有研究發(fā)現(xiàn)，未致敏T細胞充分表達ROR-t可誘導(dǎo)其向Thl7細胞方向分化，分泌IL-17發(fā)揮致炎作用；若缺乏ROR-t 的表達，則

16、不能向Th17細胞方向分化27。2. Treg的調(diào)控根據(jù)細胞因子表面標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄因子的表達及分泌細胞因子的不同，CD4+Treg主要分為兩個亞群：自然調(diào)節(jié)性T細胞(nature Treg，nTreg)和適應(yīng)調(diào)節(jié)性T細胞(adaptive or induced TregaTreg or iTreg)。nTreg主要指在胸腺發(fā)育成熟后進入外周淋巴組織的Treg細胞，在預(yù)防病理性自身免疫反應(yīng)方面起作用；iTreg主要由成熟T細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，在微生物感染和移植免疫中起主要作用。nTreg主要為CD4+CD25+Treg，是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要Treg，其功能為通過下調(diào)自身免疫應(yīng)答來誘導(dǎo)自身免疫耐受和抑

17、制自身免疫疾病的發(fā)生28. 在轉(zhuǎn)基因動物實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著FOXP3表達水平的降低，nTreg的抑制功能喪失，并分化為Th2細胞，最終導(dǎo)致自身免疫綜合征29還有實驗證明，T細胞表面過度表達FOXP3可以使其轉(zhuǎn)變?yōu)門reg表型,并發(fā)揮其抑制活性30。持續(xù)表達FOXP3是維持Treg抑制活性的關(guān)鍵因素31。因此FOXP3對CD4+CD25+Treg的發(fā)育、外周表達和功能維持起關(guān)鍵性作用。TGF-由Th3分泌，是重要的免疫調(diào)節(jié)分子,通過調(diào)節(jié)FOXP3表達來影響Treg的功能研究表明TGF-對維持小鼠外周CD4+CD25+Treg的數(shù)量，功能及在外周誘導(dǎo)FOXP3的表達至關(guān)重要32,33。在沒有TGF-

18、存在的情況下，Treg細胞抑制功能減弱，在體內(nèi)存活率降低。此外，誘導(dǎo)FOXP3的表達還需要IL一2介導(dǎo)激活STAT5，TGF-和IL-2可維持分化后Treg細胞的生存和功能34Th17 細胞和Treg 細胞的分化發(fā)育和功能發(fā)揮受到多種細胞因子的正負調(diào)節(jié)。由于Th17細胞/Treg細胞失衡與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本研究認為TGF-、IL-2、IL-6可能是調(diào)控二者平衡的重要因素。右歸丸可能對關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子有調(diào)控作用,并通過上調(diào)Treg 細胞或下調(diào)Th17 細胞在疾病中的水平以達到動態(tài)平衡，發(fā)揮治療作用。故擬通過注射完全弗氏佐劑-透明帶多肽（CFA-PZP3）建立POF小鼠模型35，

19、觀察右歸丸有效成分干預(yù)前后卵泡形態(tài)學(xué)、垂體及卵巢內(nèi)分泌功能及Th17細胞/Treg細胞的平衡狀態(tài)的改變，并進一步從Th17細胞和Treg細胞的細胞因子正負調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)入手，找出右歸丸有效成分的治療靶點，豐富中藥治療機理的研究。三、實驗方案1 研究內(nèi)容（1）觀察動物模型是否造模成功：陰道脫落細胞檢查觀察小鼠的動情周期、放射免疫熒光法檢測血清中抗透明帶抗體、雌二醇、卵泡刺激素、黃體生成素及抗透明帶抗體水平，小鼠卵巢HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。 （2）小鼠眼球后動脈采血后予以頸椎脫臼處死，留取雙側(cè)卵巢組織稱重，并固定，脫水，石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色后置光鏡下觀察，探討右歸丸干預(yù)后卵巢重量

20、及超微結(jié)構(gòu)的變化。 （3）流式細胞儀檢測POF模型小鼠外周血血清及卵巢組織局部Th17細胞和Treg細胞的表達及并探討其相關(guān)機制。2 實驗材料2.1實驗藥物 右歸丸成藥由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，北京同仁堂生產(chǎn)，規(guī)格：9g/10丸，國藥準(zhǔn)字號：J20080036；交由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物工程實驗室制成中藥水提純液。中藥換算方法：按成人體重60kg，小鼠體重20g計算，成人每日成藥劑量：9g/60kg，小鼠劑量換算后約為9g1.0346.680.026g，即每20g小鼠每天約0.026g成藥。右歸丸水提純液配置成濃度為0.13g/mL（即每0.2ml含成藥0.026g）。對照組選用雌孕

21、激素序貫療法，參照文獻36：按大鼠的戊酸雌二醇日用藥量為0.12mg/kg換算，則每200g大鼠的日用藥量為0.024mg,那么每20g小鼠的日用藥量則為0.0241.07.040.0034mg， 配成的灌胃藥物濃度約為0.017mg/mL；按大鼠醋酸甲羥孕酮的用量為0.96mg/kg換算，則每200g大鼠的日用藥量為0.192mg,那么每20g小鼠的日用藥量則為0.1921.07.040.0273mg，配成的灌胃藥物濃度約為0.1365mg/mL。戊酸雌二醇片（補佳樂片）規(guī)格為1mg/粒，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，DELPHARM Lille S.A.S公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字號：J200

22、80036；醋酸甲羥孕酮片（安宮黃體酮片）規(guī)格為2mg/粒，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，浙江仙琚制藥股份XXX生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字號：H33020715。2.2常用試劑 pZP3（小鼠透明帶3多肽片段，為透明帶3的第330-342個氨基酸，其序列為：Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Gln-Phe-Gln-Ile-His-Gly-Pro-Arg,經(jīng)過HPLC分析純度90%。）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG熒光抗體、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇、甲醇、戊二酸、蘇木精伊紅染色劑、二甲苯、檸檬酸緩沖液、小鼠PE-anti-CD4抗體、小鼠FITC-anti-CD25

23、抗體、小鼠anti-Th17抗體、Foxp3抗體、R0R-t抗體、生物素標(biāo)記的兔抗羊抗體、鏈霉素抗生物素一過過氧化物酶溶液、DBA顯色劑等等。2.3實驗動物SPF級BALB/c雌性小鼠90只，1月齡，體重1822g，由湖南斯萊克景達實驗動物XXX提供，中國科學(xué)院上海實驗動物中心檢驗。許可證號為CXK（湘）2009-0004。飼養(yǎng)條件：小鼠每籠8只，每5天更換消毒墊料一次。實驗室溫度221，濕度50%70%,通風(fēng)換氣2022次/h，壓力梯度為2050Kpa。實驗室環(huán)境符合SPF動物實驗室要求。2.4實驗儀器Biofuge primo臺式高速離心機；Millipore公司超純水系統(tǒng)；Baker公司

24、超凈工作臺；日本電子公司JEM-1200EX型透射電子顯微鏡；日本OLYMPUS BX41光學(xué)顯微鏡（帶顯微測微尺，0.01mm ）；德國Leitz公司冰凍切片機；Finland移液器；Derby低溫冰箱；SKG-01電熱恒溫干燥箱；XW-80A漩渦混合器YMS-28013手提式壓力蒸汽滅菌器；ET1-Max30000型DiaSorin全自動酶標(biāo)檢測儀；1ml、5ml一次性注射器；金諾天平儀器XXX的電子天平；英國Shandon公司的325型石蠟切片機。3.實驗方法3.1實驗分組按體重分層后將90只小鼠均衡的分為5組，每組18只（根據(jù)中藥一般藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則中每組不少于10只和動物實驗過

25、程中出現(xiàn)死亡的可能，故設(shè)每組18只），設(shè)其中一組為正常組。造模成功后再將72只自身免疫性卵巢早衰小鼠按體重分層后以隨機區(qū)組法的分成4組，分別為：模型組、右歸丸組（簡稱右歸組）、雌孕激素序貫療法對照組（簡稱西藥組）、序貫療法加右歸丸組(簡稱中西組)。正常組不變。3.2 造模3.2.1造模方法 小鼠自身免疫性POF模型建立參照文獻方法35：稱取4mg ZP3透明帶多肽粉末，加入4mL三蒸水配成溶液，取2mL溶液稀釋至12mL溶液，與弗氏完全佐劑按1:1比例配制成24ml免疫試劑，另取2mL溶液稀釋至12mL與弗氏不完全佐劑按1:1比例配制成24mL免疫強化試劑。實驗組各取0.15mL免疫試劑皮下多

26、點注射雙后腳掌及腹腔，2W后以免疫強化試劑0.15mL皮下多點注射小鼠雙后腳掌及腹腔加強免疫。7d后陰道脫落細胞檢查及每組隨機抽取一只小鼠觀察卵巢形態(tài)學(xué)及血清學(xué)改變確定造模是否成功。正常組雙后腳掌及腹腔皮下多點注射生理鹽水。若造模不成功則繼續(xù)予免疫強化劑注射。3.2.2 造模成功的檢測方法 （1）陰道脫落細胞學(xué)檢查，出現(xiàn)長的動情間期或一直未到動情期，即算作動情周期紊亂，有卵巢早衰可能。（2）每組取2只小鼠處死，取卵巢稱重，較正常組重量減輕。（3）熒光免疫法檢測小鼠外周血E2、FSH、LH含量。造模成功，則以上激素水平較正常組有明顯差異。（4）卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察，成熟卵泡減少，閉鎖卵泡增多，卵泡

27、結(jié)構(gòu)塌陷都是卵巢早衰表現(xiàn)。3.3 給藥方法（1）右歸組于造模成功后第2天予每日每20克小鼠0.2mL右歸丸水提純液灌胃,每日1次。4d一療程，每4d休息1d，共6療程；（2）西藥組于造模成功后第2日開始每4d予每20g小鼠0.2 mL西藥補佳樂灌胃,第4d每20g小鼠加用安宮黃體酮0.2mL。4d一療程，每4d休息1d，共6療程；（3）中西組于造模成功后第2d按上法分別予等量中藥和西藥。（4）正常組和模型組每日予每20g小鼠0.2mL蒸餾水灌胃。灌胃療程如前。每灌胃一周后重新稱重以調(diào)整用藥劑量。3.4 實驗取材所有動物末次給藥后禁食12h，乙醚麻醉，眶靜脈取2mL全血，4靜置30min后350

28、0r/min轉(zhuǎn)速離心10min，分離血清，分裝后分別置4和20冰箱中冷凍保存待檢測。取血后斷頸處死小鼠，取出雙卵巢，生理鹽水洗凈，濾紙干燥后稱重，一部分立即置液氮罐中冰凍，一部分固定于4 %多聚甲醛，待檢測。3.5 檢測方法3.5.1采用HE染色，在40倍電鏡下觀察小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，計數(shù)成熟卵泡及閉鎖卵泡數(shù)：無菌條件下取出卵巢組織生理鹽水沖洗血污，濾紙濾干稱重4%多聚甲醛室溫下固定梯度酒精脫水透明、浸蠟、包埋常規(guī)切片后（6m）裱于載玻片上切片放入蘇木精中染色10min自來水沖洗20min放入1%鹽酸乙醇（鹽酸一份加70%乙醇100份）中褪色自來水漂洗、梯度酒精脫水伊紅乙醇液對比染色5mi

29、n脫水干燥二甲苯透明、封片電子顯微鏡觀察卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，計數(shù)成熟卵泡及閉鎖卵泡數(shù)。3.5.2小鼠血清E2、P、FSH、LH、抗透明帶抗體采用定量酶聯(lián)檢測法。（E2試劑盒購自羅氏公司，P、FSH及LH試劑盒購自上海生物工程公司） 3.5.3用RT-PCR法檢測卵巢組織中Treg和Th17的表達及分布。（Th17及Trag試劑盒購自eBioscience公司）4. 統(tǒng)計學(xué)處理本實驗全部數(shù)據(jù)采用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件包處理。計量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(XS)表示，組間比較用單因素方差分析。計數(shù)資料用卡方檢驗，方差不齊者用秩和檢驗。（P0.05表示無統(tǒng)計學(xué)意義；P0.05說明有統(tǒng)計學(xué)意義；P0.01表

30、示有顯著統(tǒng)計學(xué)意義）5.技術(shù)路線圖用CFA-PZP3及弗氏佐劑皮下注射造模分成模型組、右歸組、西藥組、中西組，造模成功后分別灌胃處理處死后取卵巢及子宮稱重并用4%多聚甲醇保存探討小鼠Th17/Treg失衡與自身免疫性POF的關(guān)系，及右歸丸干預(yù)下Th17/Treg平衡狀態(tài)。酶聯(lián)免疫法檢測血清FSH、E2、LH、抗透明帶抗體產(chǎn)生量；RT-PCR法檢測卵巢組織局部Th17細胞和Treg細胞的分布。光鏡、電鏡觀察卵巢及子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)。計數(shù)卵泡細胞。 BALB/c雌性小鼠90只正常組，以等劑量生理鹽水皮下多點注射，治療予蒸餾水灌胃眼球取血2mL，靜置30min，3500r/min轉(zhuǎn)速離心10min，分

31、離血清結(jié)果分析統(tǒng)計學(xué)處理四、畢業(yè)論文整體設(shè)計(1) 標(biāo)題（2）目錄（3）中英文縮略詞表（4）中英文摘要（5）前言（6）材料與方法（7）結(jié)果（8）討論（9）結(jié)論（10）參考文獻（11）致謝（12）綜述五、時間安排2010.92010.12 文獻檢索 文獻綜述2011.12011.4 購買動物 預(yù)備實驗2011.4-2011.8 正式實驗 重復(fù)實驗2011.9-2011.12 整理資料 數(shù)據(jù)分析2012.1-2012.3 撰寫論文 發(fā)表論文2012.4-2012.6 修改論文 論文答辯主要參考文獻1 Alzubaidi Naharain H,Chapin Heather L,et al.Meeti

32、ng the needs of young women with secondary amenorrhea and spontaneous premature ovarian failure.Obstet GynecolJ.2002,99(5pt1):702-705.2 李靜,王建紅.卵巢早衰的研究現(xiàn)狀J.遼寧中醫(yī)雜志,2010,37(6):1172-1175.3 王錫貞,賴毛華.中醫(yī)對卵巢早衰的認識及證治體會.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報J.2003,27(5):21-22. 4 李婭玲，任艷玲.右歸丸藥理研究及證治探析J.實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2009，23（4）:87-88.5張永生.右歸丸治療更年期綜

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