胡蘿卜中類胡蘿卜素積累與主要合成基因轉錄水平相關性分析

1、園藝學報，（）： 2014411225132520 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140613；修回日期：20141013 胡蘿卜中類胡蘿卜素積累與主要合成基因轉錄水平相關性分析 王 慧，歐承剛，莊飛云*，趙志偉，馬振國 （中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，農業(yè)部園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，北京 100081） 摘 要：以胡蘿卜白色野生資源松滋野生和歐洲橘色栽培品種amsterdam及其回交重組自交系（bils）中的5個不同根色株系為試材，研究其根和葉中胡蘿卜素、

2、胡蘿卜素合成途徑分支點上lcye、lcyb1、chxe、chxb1基因轉錄表達與類胡蘿卜素含量之間的關系。cdna測序結果表明，松滋野生和amsterdam之間存在多個snp變異位點。類胡蘿卜素測定發(fā)現(xiàn)，amsterdam葉中胡蘿卜素含量（87.3 g g-1）顯著高于松滋野生（2.8 g g-1），而其胡蘿卜素含量（122.7 g g-1）顯著低于松滋野生（237.9 g g-1）。qrt-pcr結果顯示，lcye、lcyb1、chxe和chxb1在不同材料的根和葉中均表達，其中l(wèi)cye與根中胡蘿卜素、胡蘿卜素及總類胡蘿卜素含量之間呈顯著正相關；與葉中葉黃素和總類胡蘿卜素含量之間呈顯著負相關

3、，說明lcye對類胡蘿卜素積累起著關鍵性作用。 關鍵詞：胡蘿卜；類胡蘿卜素；積累；轉錄表達 中圖分類號：s 631.2 文獻標志碼：a 文章編號：0513-353x（2014）12-2513-08 relationship of carotenoid accumulation and transcript of main genes in carotenoid biosynthesis in carrot wang hui，ou cheng-gang，zhuang fei-yun*，zhao zhi-wei，and ma zhen-guo （institute of vegetables an

4、d flowers，chinese academy of agricultural sciences，key laboratory of biology and genetic improvement of horticultural crops，beijing 100081，china） abstract： the relationship of carotenoid content and expression level of lcye，lcyb1，chxe and chxb1 in the -carotene，-carotene branches of carrot root and

5、leaf was investigated with carrot wild species songzi，orange cultivar amsterdam and their five backcross inbred lines（bils）with different color. cdna sequences analysis revealed several snp of the four genes exist between songzi and amsterdam. amsterdam leaves had higher levels of -carotene（87.3 mg

6、g-1）than songzi leaves（2.8 mg g-1），but the content of -carotene was higher in songzi（237.9 mg g-1）than in amsterdam（122.7 mg g-1）. qrt-pcr results showed that lcye，lcyb1，chxe and chxb1 were functional in roots and leaves，and that the expression of lcye was positively correlated with -carotene，-carot

7、ene and total carotenoid content in roots，and negatively correlated with lutein and carotenoid content in leaves，which indicated lcye playing a key role in carotenoids accumulation. key words：carrot；carotenoid；accumulation；transcript 基金項目：國家自然科學基金項目（31101543，31272162）；國家科技支撐計劃項目（2013bad01b04）；中國農業(yè)科學

8、院創(chuàng)新工程項目 * 通信作者 author for correspondence（e-mail：zhuangfeiyun） 2514 園 藝 學 報 41卷 類胡蘿卜素是植物中廣泛存在的天然色素，參與植物光合作用，賦予植株器官豐富的顏色，是植物激素（脫落酸、獨角金內酯）的前體物質，對植物生長和發(fā)育以及細胞膜的穩(wěn)定性起著關鍵性作用（van norman & sieburth，2007；xie et al.，2010）。類胡蘿卜素也是維生素a和抗氧化劑的主要來源，培育富含胡蘿卜素和胡蘿卜素的作物品種成為育種的一個重要目標，但多數(shù)作物食用器官中的胡蘿卜素和胡蘿卜素含量很低（bai et al.，20

9、11）。植物類胡蘿卜素是在質體中通過類異戊二烯途徑合成的，包括縮合、脫氫、環(huán)化、羥基化及環(huán)氧化等一系列反應，番茄紅素環(huán)化形成胡蘿卜素和胡蘿卜素合成的重要分支點（park et al.，2002）。在胡蘿卜素分支途徑中，由番茄紅素環(huán)化酶（lcye）和番茄紅素環(huán)化酶（lcyb）共同催化胡蘿卜素的合成，再由環(huán)羥化酶（chxe）和環(huán)羥化酶（chxb）轉變?yōu)槿~黃素；在胡蘿卜素分支途徑中，由lcyb催化胡蘿卜素的合成，再由chxb轉變成玉米黃質（park et al.，2002）。通過轉基因技術改造作物中類胡蘿卜素合成途徑關鍵酶基因，已實現(xiàn)食用器官類胡蘿卜素含量大幅提高，例如“黃金水稻”（ye et al

10、.，2000），還有番茄、馬鈴薯等（bai et al.，2011），但植物中胡蘿卜素和胡蘿卜素積累的分子機理仍不清楚。 胡蘿卜是富含胡蘿卜素和胡蘿卜素的蔬菜作物之一，橘色類型中類胡蘿卜素含量能達到2 000 4 000 g g-1 dw，可作為類胡蘿卜素合成研究的模式植物（just et al.，2007；clotault et al.，2008）。目前許多研究主要關注胡蘿卜肉質根（just et al.，2007；cavagnaro et al.，2011），但葉中類胡蘿卜素合成機理研究報道較少。在已發(fā)表的胡蘿卜遺傳圖譜中有22個相關合成酶基因的報道，但這些基因與胡蘿卜根色性狀之間并沒有建

11、立連鎖關系（santos & simon，2002；just et al.，2007，2009）。通過對不同品種資源類胡蘿卜素含量與合成關鍵基因相關性分析發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜素脫氫酶基因（zds）的表達水平與紅色類型根中番茄紅素積累相關，lcye的表達則與黃色類型根中的葉黃素積累相關，但沒有發(fā)現(xiàn)與橘色類型根中胡蘿卜素和胡蘿卜素積累相關的基因（clotault et al.，2008）?，F(xiàn)代測序發(fā)現(xiàn)不同胡蘿卜種質資源中類胡蘿卜素合成基因存在snp位點變異（clotault et al.，2012；iorizzo et al.，2013），通過對基因選擇偏差分析發(fā)現(xiàn)番茄紅素分支點的下游基因lcyb、lcy

12、e、chxe和玉米黃素環(huán)氧酶基因（zep）的選擇壓力顯著高于上游基因異戊烯基焦磷酸異構酶基因（ipi）、八氫番茄紅素脫氫酶基因（pds）和類胡蘿卜素異構酶基因（crtiso），其中l(wèi)cyb1和lcye是平衡選擇的目標基因（clotault et al.，2012）。但胡蘿卜葉和根中類胡蘿卜素合成與積累之間是否存在相似性仍是個未知問題。 本研究基于前期轉錄組測序結果，以胡蘿卜白色野生資源松滋野生（ws）、橘色栽培品種amsterdam（af）及其回交重組自交系（backcross inbred lines，bils）為試材，著重分析根和葉中胡蘿卜素和胡蘿卜素合成途徑分支點上lcye、lcyb1、

13、chxe和chxb1基因轉錄表達與類胡蘿卜素含量之間的關系，為進一步研究胡蘿卜中類胡蘿卜素的合成和積累機制提供依據。 1 材料與方法 1.1 材料 供試材料為胡蘿卜白色野生資源松滋野生（ws），歐洲橘色栽培品種amsterdam（af），及以兩者為親本，af為回交親本構建的回交重組自交系（bils；bc2s4代）中的e09041（白色肉質根）、e52081（黃色肉質根）、e04041（橘黃色肉質根）、e35073（淺橘色肉質根）、e2003（橘色肉質根）。各材料于2013年8月初在中國農業(yè)科學院南口試驗基地進行露地播種，10月底對植株的根和葉進行取樣。每份材料取5個植株，重復3次，液氮速凍后置

14、于80 超低溫冰箱中貯存待用。 12期 王 慧等：胡蘿卜中類胡蘿卜素積累與主要合成基因轉錄水平相關性分析 2515 1.2 基因rt-pcr 根據轉錄組測序以及ncbi（http：/www. ncbi. nlm. nih. gov/）中注釋的lcye（dq192192）、lcyb1（dq192190）、chxe（dq192196）、chxb1（dq192193）的cdna序列，分別在5utr和3utr區(qū)設計特異性引物（表1）。使用植物總rna提取試劑盒（天根生物技術公司）提取樣品總rna，采用primescript 1st strand cdna synthesis kit（takara公司）

15、反轉錄合成cdna第一鏈。利用合成的cdna第1鏈為模板，使用ex taq hs酶（takara公司）進行pcr擴增。pcr反應體系20 l：cdna（50 ng l-1）2 l，上下游引物（10 mol l-1）各0.8 l，10 pcr buffer 2 l，dntp mixture（2.5 mmol l-1）0.8 l，ex taq hs酶（2.5 u l-1）0.2 l，ddh2o 13.4 l。pcr反應條件：94 預變性3 min，94 變性30 s，50 （lcye、lcyb1）或56 （chxe、chxb1）退火30 s，72 延伸4 min，35個循環(huán)后72 延伸10 min

16、。pcr產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，連接pmd-18t載體（takara公司），轉化大腸桿菌dh5感受態(tài)細胞（天根生物技術公司），篩選陽性克隆，送北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序。利用dnaman分析工具和clustalw網站（http：/www. ebi. ac. uk/tools/msa/clustalw2/）進行序列比對。 1.3 類胡蘿卜素含量測定 分別對根和葉樣品進行冷凍抽干，稱取0.200 g干樣，使用11的丙酮和石油醚（含0.1%二丁基羥基甲苯，bht）提取類胡蘿卜素，重復2次。采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromato

17、graphy，uplc，waters公司，美國）檢測類胡蘿卜素含量。uplc檢測柱型：uplc beh c18（2.1 mm 100 mm，1.7 m；waters公司，美國），檢測波長450 nm，流動相為丙酮乙腈（11），流速為2 ml min-1。胡蘿卜素、葉黃素及玉米黃質的標樣均購自美國sigma公司?？傤惡}卜素含量為胡蘿卜素、胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃質之和。 1.4 基因相對表達量分析 提取樣品總rna，并反轉錄成cdna。根據lcye、lcyb1、chxe和chxb1的cdna序列設計熒光引物（表1），選取ubiquitin為內參基因（fuentes et al.，2012）。以

18、cdna（50 ng l-1）為模板，在steponeplus real-time pcr system（applied biosystems，ca）實時定量pcr儀上，使用sybr premix ex taqtm（perfect real time）試劑盒（takara公司）進行分析，重復3次。pcr反應體系：cdna（50 ng l-1）2 l，上下游引物（10 mol l-1）各0.8 l，sybr green master mix 10 l，rox 0.4 l，補ddh2o至20 l。pcr反應程序：95 變性5 s，56 退火30 s，72 延伸30 s，40個循環(huán)，反應結束后增加6

19、0 95 溶解曲線分析。試驗結果采用2-ct法計算相對表達量（livak & schmittgen，2001）。 表1 類胡蘿卜素合成相關基因rt-pcr及real-time qpcr分析引物 table 1 the primers of carotenoids biosynthesis genes for rt-pcr and real-time qpcr analysis 用途 use 基因 gene 正向引物（53） forward primer（53） 反向引物（53） reverse primer（53） 片段/bp size of the fragmentrt-pcr lcye a

20、ccgtaactaaaacacacat ataactttctgaaccgagca 1 682 lcyb1 gtctgtatctacctccaatc taacacaatgagtcaaaatc 1 795 chxe gagttaccaaactcccaa catcatcccacattctatac 1 712 chxb1 tctcactctcttcttccacc cctttacgttctcattccta 1 102 qpcr lcye aaaggaaacgccagagagc cgactgaggatagagaagaacc 153 lcyb1 agtgggaattggcggtacag gcagctagag

21、ttcttgctaccatatatc 72 chxe tggttccttcgcttcacaag ttcctccatattcacagcagag 128 chxb1 ctaaggaagttgaggatgtggg tatgatcggctagctctggaag 94 參照基因 reference gene ubiquitin acctcgttctgcgtctcc gccactctcatccaccttatag 134 2516 園 藝 學 報 41卷 1.5 數(shù)據分析 采用dps軟件對各試材根、葉中類胡蘿卜素含量及各基因轉錄水平進行鄧肯氏多重比較。類胡蘿卜素含量與基因表達量之間相關性采用sas 9.0軟

22、件中pearson方法分析（li et al.，2008）。 2 結果與分析 2.1 基因的rt-pcr rt-pcr顯示所有材料均擴增出了番茄紅素下游分支途徑中l(wèi)cye、lcyb1、chxe和chxb1的cdna片段（圖1）。測序結果表明橘色栽培品種af的4個基因與ncbi公布的序列一致，但白色野生資源ws中存在多個snp變異位點。lcye的cdna序列長為1 682 bp，ws中存在1個變異位點；lcyb1的cdna序列長為1 795 bp，ws中存在14個變異位點；chxe的cdna序列長為1 712 bp，ws中存在8個變異位點；chxb1的cdna序列長為1 102 bp，ws中存在

23、21個變異位點（表2）。 圖1 rt-pcr擴增產物 fig. 1 rt-pcr amplifications 表2 ws、af及ncbi中l(wèi)cye、lcyb1、chxe和chxb1 cdna編碼區(qū)序列的變異堿基 table 2 variable nucleotides of cdna coding sequences of lcye，lcyb1，chxe and chxb1 among ws， af and deposited sequences in ncbi 變異堿基 variable nucleotide 變異堿基 variable nucleotide 基因 gene 變異堿基位點

24、site of variable nucleotide ws af ncbi 基因 gene 變異堿基位點 site of variable nucleotide ws af ncbi lcye 291 a t t chxb1 96 t a a lcyb1 624 t c c 113 g a a 628 c t t 117 a g g 645 c t t 121 a c c 1 026 g a a 123 c t t 1 053 a g g 188 t g g 1 086 t c c 251 c g g 1 123 a c c 267 a g g 1 146 c t t 300 c t t 1

25、 153 a g g 318 g a a 1 201 a g g 354 a c c 1 212 t c c 366 a g g 1 248 c a a 400 t c c 1 353 a g g 537 a g g 1 449 a t t 585 a t t chxe 10 t c c 591 a t t 297 c t t 672 g a a 327 c t t 699 a c c 363 t c c 727 c g g 621 a g g 741 t c c 738 a c c 744 t c c 1 246 c g g 1 305 c t t 12期 王 慧等：胡蘿卜中類胡蘿卜素積累與

26、主要合成基因轉錄水平相關性分析 2517 2.2 根和葉中類胡蘿卜素含量差異分析 雖然ws根中沒有檢測出類胡蘿卜素，但其葉中的總類胡蘿卜素含量顯著高于af（圖2），而且兩者葉中的胡蘿卜素和胡蘿卜素含量存在顯著差異，其中ws中胡蘿卜素含量僅為2.8 mg g-1，胡蘿卜素含量為237.9 mg g-1，而af為87.3 mg g-1，胡蘿卜素含量為122.7 mg g-1。ws葉中的葉黃素和玉米黃質含量顯著高于af。白色e09041根中只檢測出了微量葉黃素，但其葉中類胡蘿卜素含量和組分與af相似。黃色e52081根中檢測出了微量胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃質，但其葉中類胡蘿卜素含量和組分更接近于ws

27、。橘黃色e04041根中葉黃素含量最高，為18.9 mg g-1，顯著高于ws和af，其胡蘿卜素、胡蘿卜素和玉米黃質含量分別是3.5、19.9和0.4 mg g-1；葉中的總類胡蘿卜素含量與af相當，但其組分則與ws相似。淺橘色e35073根中胡蘿卜素、胡蘿卜素含量與e04041相當，而其葉黃素含量只有2.8 mg g-1；葉中的總類胡蘿卜素含量最高，達到642.6 mg g-1，其組分與af相似。橘色e2003根中總類胡蘿卜素含量低于af，但葉中含量則高于af，根和葉中的組分均與af相似。 圖2 試材根和葉中類胡蘿卜素含量比較 鄧肯氏顯著性檢驗，小寫字母代表0.05顯著性水平。下同。 fig

28、. 2 comparison of carotenoid content in root and leaf duncans multiple test，different letter indicated the significant differences of 0.05 level. the same below. 2.3 根和葉中類胡蘿卜素合成基因的表達量分析 lcye、lcyb1、chxe和chxb1在不同材料的根和葉中均有表達，但相對表達量差異顯著（圖3）。ws根中這4個基因的表達量最低，但葉中l(wèi)cye、lcyb1和chxb1表達量最高，而chxe則最低。af根中4個基因均顯著高表

29、達，其中l(wèi)cye為ws的136倍，而lcyb1只有3.6倍，葉中l(wèi)cye、lcyb1和chxb1表達量相對ws較低，而chxe則是ws的3.3倍。e09041根中4個基因表達量與ws相似，但在葉中則與af相似。e52081根中4個基因均顯著表達，但在葉中l(wèi)cye、lcyb1 2518 園 藝 學 報 41卷 和chxb1表達量最低，而chxe介于ws和af之間。e04041和e2003的4個基因表達量相似，在根中e04041均低于e2003，在葉中則反之。e35073根中chxe的表達量最高，為ws的7.5倍，而chxb1表達量相對較低，只有ws的2.7倍，但在葉中4個基因的表達量與af較為相

30、似。 圖3 試材根和葉中相關基因的相對表達量分析 fig. 3 relative expression analysis of carotenoid biosynthesis genes in root and leaf 2.4 根和葉中類胡蘿卜素含量與基因表達量相關性分析 從表3可看出，在根中，lcye表達量與胡蘿卜素、胡蘿卜素和總類胡蘿卜素含量呈正相關，相關系數(shù)分別是0.96、0.95和0.97；但在葉中，lcye表達量與葉黃素、總類胡蘿卜素含量之間呈負相關，相關系數(shù)分別為0.80、0.77。 表3 葉和根中類胡卜素含量與基因相對表達量相關性分析 table 3 pearson corre

31、lation analysis between carotenoid content and gene expression in leaf and root 相關系數(shù) r 器官 organ 組分 component lcye lcyb1 chxe chxb1 胡蘿卜素 -carotene 0.96* 0.74 0.23 0.74 根 root 胡蘿卜素 -carotene 0.95* 0.73 0.30 0.72 葉黃素 lutein 0.37 0.44 0.06 0.50 玉米黃質 zeaxanthin 0.29 0.24 0.28 0.24 總類胡蘿卜素 total carotenoid

32、 0.97* 0.76 0.25 0.75 胡蘿卜素 -carotene 0.06 0.09 0.44 0.19 葉片 leaf 胡蘿卜素 -carotene 0.05 0.12 0.30 0.05 葉黃素 lutein 0.80* 0.69 0.09 0.58 玉米黃質 zeaxanthin 0.15 0.26 0.37 0.38 總類胡蘿卜素 total carotenoid 0.77* 0.72 0.08 0.62 注：* 表示0.05顯著水平，* 表示0.01極顯著水平。 note：* correlation is significant at the 0.05 level，* cor

33、relation is significant at the 0.01 level. 12期 王 慧等：胡蘿卜中類胡蘿卜素積累與主要合成基因轉錄水平相關性分析 2519 3 討論 胡蘿卜肉質根顏色豐富，不同根色性狀與其類胡蘿卜素組分和含量有密切的關系，如白色類型只含有微量類胡蘿卜素，黃色類型主要含有葉黃素和玉米黃質等，紅色類型主要含有番茄紅素和胡蘿卜素，橘色類型含有大量胡蘿卜素和胡蘿卜素（grassmann et al.，2007）。而且根色遺傳極為復雜，已報道了多個有關的性狀位點，如a（胡蘿卜素積累），l1和l2（番茄紅素積累），io、o和y（木質部顏色），y、y1和y2（胡蘿卜素、胡蘿卜素

34、的分布和含量），p1和p2（花青素積累）等（buishand & gabelman，1979；bradeen & simon，1998；simon，2000），但這些位點并沒有與類胡蘿卜素合成基因之間確立連鎖關系（santos & simon，2002；just et al.，2007，2009）。本研究中bils群體根色變異極為廣泛，e09041、e52081、e04041、e35073和e2003為5個不同根色代表性的株系，其類胡蘿卜素組分和含量截然不同，進一步驗證了胡蘿卜根色遺傳與類胡蘿卜素合成之間存在不同的調控機制。同時還發(fā)現(xiàn)白色野生資源ws和橘色栽培品種af葉片中的類胡蘿卜素組分和含

35、量差異極大，特別是ws葉中胡蘿卜素含量僅為2.8 mg g-1，不到總類胡蘿卜素含量的1%，與其它作物葉片中的組分較為相似（britton，1993），但af中的胡蘿卜素含量達到87.3 mg g-1，占到總類胡蘿卜素含量的21%，出現(xiàn)了一種傾向胡蘿卜素合成分支途徑的特異現(xiàn)象，而且這一現(xiàn)象與地下部根色的變化似乎沒有關聯(lián)，可以遺傳給后代，e52081和e04041與ws相似，而e09041、e35073和e2003則與af相似，這在其它植物中尚未見報道。 在不同基因型玉米中，lcye和chxb1基因的多態(tài)性是造成籽粒胡蘿卜素含量差異的主要原因（harjes et al.，2008；yan et

36、al.，2010）。在西瓜中，lcyb基因1個單核苷酸多態(tài)性（c572a）的變異導致保守催化位點上1個氨基酸改變，造成酶結合底物活性減弱，從而使果肉呈現(xiàn)紅色和黃色的分離（bang et al.，2007）。在甘薯塊根中，lcyb是胡蘿卜素合成途徑的關鍵酶基因（陳選陽和張招娟，2011）。在胡蘿卜品種馴化過程中，下游基因lcyb、lcye、chxe和zep選擇偏差顯著高于上游基因ipi、pds和crtiso（clotault et al.，2012）。本研究中亦發(fā)現(xiàn)lcye、lcyb1、chxe和chxb1在ws和af之間存在多個snp位點變異，從根和葉中轉錄水平分析表明各個基因均表現(xiàn)出其功能，

37、但是否影響類胡蘿卜素合成效率還需要深入研究。從根和葉中4個基因的表達水平與類胡蘿卜素含量的相關性分析發(fā)現(xiàn)根中l(wèi)cye表達量與胡蘿卜素、胡蘿卜素及總類胡蘿卜素含量之間達到顯著正相關，葉中l(wèi)cye表達量與葉黃素、總類胡蘿卜素含量之間呈負相關，說明lcye對根和葉中主要類胡蘿卜素的積累起著關鍵性作用，但作用方式可能存在不同。 references bai c，twyman r m，farr g，sanahuja g，christou p，capell t，zhu c. 2011. a golden erapro-vitamin a enhancement in diverse crops. the

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