最新：血流感染實驗室診斷新進展文檔資料

1、內(nèi)容 什么是血流感染？ 血流感染流行病學(xué)特點 血培養(yǎng)流程優(yōu)化 提高陽性率 分析培養(yǎng)結(jié)果 減少污染 分子生物學(xué)方法檢測血流感染 基于pcr的技術(shù) maldi-tof ms pna-fish概念 感染炎癥+病原體 全身炎癥反應(yīng)綜合征（sirs） 體溫38c或90次/分 呼吸頻率20次/分，或paco212109/l或10% 膿毒血癥（sepsis）感染+sirs，血培養(yǎng)可以陽性或陰性 重度膿毒血癥（severe sepsis）sepsis+臟器功能障礙、組織灌注不良和低血壓 感染性休克（septic shock）概念 敗血癥（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的臨床綜合征，是一種

2、嚴重的全身感染。病原菌主要是細菌，也可為真菌、分枝桿菌等。 菌血癥（bacteremia）：細菌在血流中短暫出現(xiàn)的現(xiàn)象，一般無明顯毒血癥狀，在國外文獻中常與敗血癥通用。 血流感染（bloodstream infection, bsi）：敗血癥和菌血癥目前統(tǒng)稱為血流感染。血流感染 醫(yī)院獲得性血流感染 原發(fā)血流感染 實驗室證實血流感染（laboratory-confirmed bloodstream infection, lcbi） 臨床血流感染（clinical sepsis） 繼發(fā)血流感染：血培養(yǎng)分離出有意義微生物，而且此微生物與另一部位之院內(nèi)感染有關(guān)。唯不包括血管或血管內(nèi)導(dǎo)管裝置所引起之血流

3、感染。 社區(qū)獲得性血流感染實驗室證實血流感染（lcbi）標準一：從一次或多次血標本中培養(yǎng)出一種一致的致病菌，而且培養(yǎng)出的病原體與其它部位的感染無關(guān)。標準二：病人至少具有下列癥狀和體征之一：發(fā)熱（38 c ），寒顫或低血壓，并致病符合下列之一： 1.從兩次或兩次以上不同部位抽血的標本中培養(yǎng)出皮膚寄生菌（如類白喉桿菌、芽孢桿菌、丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌或微球菌）。 2.至少一次從帶血管內(nèi)導(dǎo)管的病人血標本中培養(yǎng)出皮膚寄生菌群（如類白喉桿菌、芽孢桿菌、丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌或微球菌），并且主管醫(yī)生開始了適當?shù)目咕幬镏委煛?3.血中抗原檢測陽性（如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌或b群

4、鏈球菌）。與實驗室陽性結(jié)果一致的癥狀和體征與其它部位的感染無關(guān)。標準三：年齡38 c ），低溫（37 c ），呼吸暫停、脈搏徐緩，并具有下列之一（同上3點略）臨床血流感染（clinical sepsis）具有下列二條件之一者：具有非其它已知原因所引起的發(fā)燒、血壓過低（收縮壓90mmhg或收縮壓低于平常超過40mmhg），少尿（每小時尿量低于30ml）等臨床癥狀任何一項，且符合下列所有條件者： 未做血培養(yǎng)，或血培養(yǎng)陰性或血液抗原反應(yīng)呈陰性者 其它部位無明顯感染者 醫(yī)生針對此感染中毒癥狀給予適當抗菌藥物治療1歲以下嬰兒 ，具有非其它書籍原因引起的發(fā)燒、體溫過低、呼吸中止或心跳過緩等臨床癥狀任何一項

5、，且符合下列所有條件者： 未做血培養(yǎng)，或血培養(yǎng)陰性或血液抗原反應(yīng)呈陰性者 其它部位無明顯感染者 醫(yī)生針對此感染中毒癥狀給予適當抗菌藥物治療bsi流行病學(xué)特點 bsi發(fā)病率逐年增加 凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌、真菌血流感染發(fā)病率逐年上升，革蘭陰性菌下降 耐藥菌比例逐年增加 社區(qū)獲得與醫(yī)院獲得血流感染病原譜存在差異 院內(nèi)bsi患者病死率高美國膿毒血癥流行病學(xué)+600%+300%+300%martin et al, nejm 2003;348:1546加拿大canword監(jiān)測2002-2009diag microbiolo infect dis. 2011; 69: 307加拿大canword監(jiān)測2

6、002-2009diag microbiolo infect dis. 2011; 69: 307美國49醫(yī)院bsi病原譜cid. 2004, 39: 309-317pumch2012年834血培養(yǎng)分離株pumch2012年144株bsi大腸埃希菌藥敏結(jié)果esbl 60.2%pumch2012年67株bsi肺炎克雷伯菌藥敏結(jié)果esbl 34.4%pumch2012年61株bsi鮑曼不動桿菌藥敏結(jié)果pumch2012年76株bsi金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果pumch2012年46株bsi草綠色溶血鏈球菌藥敏結(jié)果2011chif-net489株bsi酵母菌2011chif-net念珠菌對氟康唑的敏感性

7、2011chif-net念珠菌對伏立康唑的敏感性2011chif-net其他酵母菌對氟康唑的敏感性2011chif-net其他酵母菌對伏立康唑的敏感性采血量是影響血培養(yǎng)陽性率的獨立相關(guān)因素 clsi m47-a：每位患者采集23套血培養(yǎng)（4060ml） surviving sepsis campaign guidelines (worldwide)：抗菌藥物治療前至少采集2套血培養(yǎng) 英國nhs血培養(yǎng)標準：采集2套血培養(yǎng)采血量對血培養(yǎng)陽性率的影響jcm 2007采血量對血培養(yǎng)陽性率的影響j. clin. microbiol. 2011, 49(12):4047j. clin. microbiol

8、. 2011, 49(12):4047 routine set mayo clinic:2 bactec aerobic plus bottles + 1 bactec anaerobic lytic bottle采血量和陽性率26非條件致病菌27 在多次血培養(yǎng)中單次培養(yǎng)下列細菌陽性 凝固酶陰性葡萄球菌 棒狀桿菌 微球菌 丙酸桿菌 芽孢桿菌 如多次培養(yǎng)陽性，可能為條件致病菌，需結(jié)合臨床分析血培養(yǎng)污染菌非條件致病菌mayo clinic(p38c or 90/min; 呼吸 20/min; 白細胞12 or 10% 未成熟中性粒細胞 32%患者有1瓶以上cns陽性，bsi68 %，污染12% (

9、p 0.001) 沒有sirs癥狀：bsi 5%，污染29% (p 30秒1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒：從穿刺點向外畫圈消毒,直徑3cm70%酒精脫碘 一步法葡萄糖酸洗必泰作用30 s，或70%異丙醇消毒后自然干燥，但不適用于2個月以內(nèi)的新生兒。急診血培養(yǎng)污染率與工作量相關(guān) the university of michigan health system急診 血培養(yǎng)大多數(shù)由采血員采集，其次為護士和醫(yī)生 采血員:病人= 1:9，重癥區(qū)護士:病人= 2:3，其它區(qū)域護士:病人=1:4 年病人量82521人，采集血培養(yǎng)者7586人 11.4%至少1瓶陽性，病原菌陽性率8.0%，污染率3.

10、7% 多套培養(yǎng)患者陽性率7.4%，單套培養(yǎng)陽性率5.1%（p0.001），污染率無顯著差別（2.2% vs. 2.6%）schuyler halverson, et al. jcm. 2013 online急診小時工作量schuyler halverson, et al. jcm. 2013 online繁忙時血培養(yǎng)污染率增加or=1.23or=0.93schuyler halverson, et al. jcm. 2013 online抗菌藥物治療與血流感染死亡率死亡率chest 115 (2): 1999血培養(yǎng)三級報告制度血培養(yǎng)血培養(yǎng)陽性陽性終報告終報告革蘭染色革蘭染色傳種培養(yǎng)傳種培養(yǎng)初步

11、報告初步報告 (直接藥敏直接藥敏)鑒定菌株鑒定菌株電話報告電話報告鑒定標準藥敏鑒定標準藥敏41血培養(yǎng)結(jié)果回報對治療的影響 a = appropriate therapy(正確治療) i = inappropriate therapy(不正確治療)clin infec dis 24:584-602, 1997血流感染快速分子診斷 分子診斷不受抗菌藥物使用的影響 血培養(yǎng)陽性后分子診斷 直接使用血標本進行分子診斷 快速 但不能提供藥敏結(jié)果血培養(yǎng)陽性瓶分子鑒定antigone kotsaki, et al. expert opin. med. diagn. 2012, 6(3):209陽性血培養(yǎng)基于p

12、cr的檢測 pcr特異性檢測 病原特異性pcr 特定耐藥基因檢測：葡萄球菌meca, 腸球菌van 細菌載量：肺炎鏈球菌自溶毒a基因lyta拷貝數(shù) 廣譜檢測：pcr擴增特定靶位 多態(tài)性分析 測序 后續(xù)基因檢測 種特異性real-time pcrexpert opin. med. diagn. 2012, 6(3):209. curr opin infect dis. 2011, 24(2):137qpcr鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中銅綠假單胞菌 target：ecfx gene 血培養(yǎng)系統(tǒng)：bact/alert，87瓶fa、13瓶fn，涂片均顯示g-b 對照方法：氧化酶，api 20e dna提?。?.

13、5ml肉湯，離心后加裂解液，水煮法 定量pcr： 擴增：oligonucleotide primers 基因特異性檢測：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragmentannal clin microbiol antimicrob 2010, 9:2146qpcr鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中銅綠假單胞菌 33瓶pae，敏感性和特異性均為100% 1瓶kpn+pae，由于pae (20cfu/ml)kpn (108cfu/ml)，pcr(-) 檢測限：將atcc27853 ecfx基因克隆至top10 e.coliannal clin micr

14、obiol antimicrob 2010, 9:2147陽性血培養(yǎng)基于pcr的檢測 最常見病原體多重pcr 電泳譜、elisa雜交、多重real-time pcr hyplex bloodscreen (bag, lich, germany): 多重pcr+elisa, 4.5-6h完成 prove-it sepsis (mobidiag, helsinki, finland)：多重real-time pcr+微陣列分析，檢測多種病原及meca，3h完成 多重real-time pcrexpert opin. med. diagn. 2012, 6(3):209.血培養(yǎng)陽性多重real-ti

15、me pcrnew microbiologica, 36, 65-74, 2013血培養(yǎng)陽性多重real-time pcrnew microbiologica, 36, 65-74, 2013血培養(yǎng)陽性pna fish核酸熒光原位雜交 血培養(yǎng)陽性肉湯革蘭染色pna fish革蘭陰性菌：商品化試劑盒eco/kpn/paeefa/其它腸球sau/scncal/cgl/其它念珠菌報道salmonella spp.90min pna fish完成appl environ microbiol. 2010 ;76:4476 j. clin. microbiol. 2013, 51(4):1301j cli

16、n microbiol. 2009; 47: 247 51maldi-tof ms 基質(zhì)輔助激光解析電離（maldi） 原理：將樣品分散在基質(zhì)分子中形成結(jié)晶后直接進樣，當用激光照射結(jié)晶時，基質(zhì)吸收了激光的大部分能量，使基質(zhì)分子和樣品獲得能量投射到氣相并得到電離，成為帶電荷的離子。 基質(zhì)在樣品離子形成過程中起到了質(zhì)子化或去質(zhì)子化的作用，使樣品帶上正電荷或負電荷，成為帶電荷的離子 基質(zhì)會干擾被檢測分子質(zhì)譜峰的大小和濃度；不同類型的分析物選擇不同的基質(zhì)maldi-tof ms 飛行時間（tof） 原理：離子源產(chǎn)生的離子在加速電場獲得動能，當進入高真空無電場飛行管道并在此管道內(nèi)飛行時，質(zhì)量較輕的離子飛

17、行速度快，早到達檢測器；質(zhì)量較重的離子飛行速度慢，晚到達檢測器。因此依據(jù)離子的飛行時間與其質(zhì)荷比平方根（m/z）成正比的關(guān)系，通過測定飛行時間，計算出相應(yīng)離子的分子量。maldi-tof ms操作步驟maldi-tof ms快速鑒定陽性血培養(yǎng) 使用菌落、陽性血培養(yǎng)肉湯鑒定 快速：20分鐘(從報警到鑒定出結(jié)果）maldi-tof ms(bruker)+bactec(bd): 正確鑒定：193/213陰性菌（包括厭氧菌）(90.61%)，284/319陽性菌(89.02%) 80.9%復(fù)數(shù)菌正確鑒定出一種，7株緩癥鏈球菌鑒定為spnmaldi-tof ms(bruker)+bact/alert(b

18、iomrieux): 388個陽性瓶，種正確率91%（包括念珠、厭氧菌） 15瓶復(fù)數(shù)菌：使用通用庫多鑒定出一種，革蘭染色后使用陰性或陽性庫分析，6瓶鑒定出第二種菌clin microbiol infect 2010; 16: 1631j clin microbiol 2010; 48: 154255maldi-tof ms vitek ms(biomrieux) 以16s為金標準，980株臨床分離株，id正確率 腸桿菌科97.7% 非發(fā)酵菌92% 葡萄球菌屬94.3% 鏈球菌屬84.8% hacek84% 酵母菌85.2%56j clin microbiol. 2010; 48: 900pcr

19、/esi ms 廣譜pcresi ms（電噴射質(zhì)譜） 189陽性血培養(yǎng)和45陰性血培養(yǎng)，種一致率98.7% 6例spn標本方法陰性 提供定量結(jié)果評估病原體載量 假陰性率24%：幾乎均由混合感染導(dǎo)致 5-6h完成檢測 結(jié)合pcr的敏感性和esi ms特異性 可以直接檢測標本，不需要培養(yǎng)proc natl acad sci. 2005;102:8012血標本分子檢測 種特異性、屬特異性、廣譜、多重pcr、微陣列分析 血培養(yǎng)陰性的苛養(yǎng)菌，如bartonella spp.巴爾通體, coxiella burnetii伯氏考克斯體, mycoplasma spp.支原體, chlamydia spp.衣

20、原體, ricketssia spp.立克次體，tropheryma whipplei商品化分子生物學(xué)檢測方法:血標本 septifast(roche)：multiplex real-time pcr，種屬特異性熒光探針，檢測重要血流感染致病菌 sepsitesttm (molzym)：eubacterial and panfungal real-time pcr， a 16s and 18s rrna gene-based universal pcr+ sequencing，幾乎可以鑒定所有細菌、真菌 vyoo (sirs lab)：multiplex pcr，檢測重要血流感染菌，電泳分離擴增片段 plex-id (abbott)：eubacterial and panfungal pcr+質(zhì)譜，幾乎可以鑒定所有細菌、真菌59intensive care med. 2011 may, publish online. septifast test檢測的病原譜bmj open 2012;2:e000392intensive care med (2010) 36:4956