色譜分析中國(guó)藥科大學(xué)超高效液相色譜UPLC

1、色譜分析（中國(guó)藥科大學(xué)）超 高效液相色譜（UPLC）超高效液相色譜（UPLC）超高效液相色譜技術(shù)（ultra performance liquid chcromatography,簡(jiǎn)稱UPLC）是一種綜合了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積（死體積）及快速檢測(cè)手段等全 新的檢測(cè)技術(shù)。在全面提升HPLC的速度、靈敏度及分離度的同時(shí)，保留其原有 的實(shí)用性及原理?；谛☆w粒技術(shù)的UPLC,并非普通HPLC系統(tǒng)改進(jìn)而成。它 不但需要耐壓、穩(wěn)定的小顆粒填料（可達(dá)1.7pm）,而且需要耐壓的色譜系統(tǒng) （15,000psi）.最低交叉污染的快速進(jìn)樣器、快速檢測(cè)器及優(yōu)化的系統(tǒng)體積等諸多 方面的保障，以充分發(fā)揮小顆粒技

2、術(shù)優(yōu)勢(shì)。這就需要對(duì)系統(tǒng)所有硬件和軟件的進(jìn) 行全面創(chuàng)新。世界第一個(gè)商品化UPLC產(chǎn)品是Waters ACQUITY UPLC超高 效液相色譜系統(tǒng)，它于2004年3月投入市場(chǎng)。七十年代卑期 簿充無(wú)孔填料柱壓：100-500 psi 柱效：4000/米 柱氐俅七十年代后期無(wú)規(guī)則徽孔填料 柱壓：1000-2500 psi 柱效，25,000 /米 柱規(guī)格：3 9 x 300mm八十年代至今3.5-5um球形微孔填斜 1500-4000 psi柱參:二 50,000 80,000/米柱規(guī)格：3.9 x 300mm圖1:填料技術(shù)的沿革1.小顆粒填料改善分離的理論與科學(xué)基礎(chǔ)液相色譜30年的發(fā)展史是顆粒技術(shù)的

3、發(fā)展史。顆粒大小的改變直接影響到柱 效，從而對(duì)分離結(jié)果產(chǎn)生直接影響。由上圖可知：隨著顆粒度的不斷降低，色譜 分離度不斷提高。事實(shí)上，上述規(guī)律的理論基礎(chǔ)是著名的Van Deemetei方程。 Van Deemeter方程是色譜科學(xué)家預(yù)測(cè)顆粒度變化而引起的色譜變化的根本依據(jù)。 Van Deemeter曲線（見(jiàn)圖2）預(yù)測(cè)最佳柱效與相應(yīng)的流動(dòng)相流速。由Van Deeineter 方程得知：隨著顆粒度減小，相應(yīng)的理論塔板高度（HETP）也下降，得到的柱 效會(huì)更高。還應(yīng)該注意到1.7 pm顆粒的HETP最小值區(qū)域擴(kuò)大了（見(jiàn)圖2）,這 #表明可以在比大顆粒更寬的流量范圍內(nèi)得到最高的柱效，結(jié)果可以不損失高分離

4、 度的同時(shí)來(lái)適當(dāng)提高流動(dòng)相的流速(分析速度)。小顆粒填料為色譜分離帶來(lái)如此 的高柱效和速度優(yōu)勢(shì)，使得利用小顆粒技術(shù)成為色譜科學(xué)家夢(mèng)寐以求的目標(biāo)。然 而HPLC系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，一直難于發(fā)揮出最小顆粒的優(yōu)點(diǎn)。小顆粒技術(shù)的運(yùn)用，不 但要求儀器在超出目前限度(6000 ps 400 bar)的壓力下工作，同時(shí)要求儀器系 統(tǒng)的死體積要更小，以便不影響梯度性能，而且還要檢測(cè)器能高速檢測(cè)出峰寬只 有幾秒的色譜峰。在利用雜化顆粒技術(shù)合成出耐壓的新一代小顆粒色譜填料之后，UPLC超高 效液相色譜系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，充分利用了小顆粒填料的所有優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)HPLC系 統(tǒng)的不足。Lin ear Velocity u. mm/s

5、ec0.040.070.100.130.170.200.24Flow RateID = 1 0 mmID = 2.1 nur0.150.30.450.60.750.91.05圖2:范德米特(an Deemeter)線1. 1超高分離度根據(jù)等度液相色譜分離的分離度(Rs)方程，分離度(Rs)與柱效(N)的平方根成正比。3(i)00,HPLC按Van Deemter色譜理論，柱效(N)與顆粒度(dp)成反比:(2)故：隨著dp的降低，N值會(huì)增加；而N值增加，則Rs值增加。HPLC與UPLC的基本分離理論，進(jìn)一步說(shuō)明了顆粒度大小和分離度密不可分的關(guān)系。新一代UPLC系統(tǒng)發(fā)揮了 1-7 pm顆粒提供柱

6、效增高的全部?jī)?yōu)越性。尤其是 1.7 pm顆粒提供的柱效比5 pm顆粒提高了 3倍。因?yàn)榉蛛x度與粒度的平方根成 反kt, 1.7 pm顆粒的分離度比5 pin顆粒提高了 70%。在梯度分離中也具有同樣 的優(yōu)越性，此時(shí)分離能力用峰容量衡量。UPLC用17 pm顆粒提高了分離能力，可以分離出更多的色譜峰(見(jiàn)圖3), 從而對(duì)樣品提供的信息達(dá)到了一個(gè)新的水平。而且又最大地縮短了開(kāi)發(fā)方法所需 的時(shí)間。圖3顯示UPLC可以大大提高分離度，同時(shí)色譜峰強(qiáng)度也得到了提高。4.8 pm 峰數(shù)=70 峰容量:1435圖3: UPLC與HPLC：分離度比較1. 2超高速度較小的顆粒能超乎尋常地提高分析速度而不降低分離度

7、o因?yàn)轭w粒度減小后, 柱長(zhǎng)可以按比例縮短而保持柱效不變（見(jiàn)式3）,而且Van Deemter理論表明最佳流 速與粒度成反比（見(jiàn)式4）。柱長(zhǎng)縮短會(huì)加快分離速度，而顆粒度越小，最佳流速也 越大，進(jìn)而可以通過(guò)提高流速來(lái)進(jìn)一步加快分離速度。LN g dP由于新一代UPLC系統(tǒng)用1.7 pm顆粒，柱長(zhǎng)可以比用5 pm顆粒時(shí)縮短3倍 而保持柱效不變，而且使分離在高3倍的流速下進(jìn)行，結(jié)果使分離過(guò)程快了9倍 而分離度保持不變。13超高靈敏度過(guò)去幾年中，提高靈敏度的工作集中在檢測(cè)器上，包括光學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè) 器。這種趨勢(shì)主要是受要求檢測(cè)化合物的濃度越來(lái)越低（如高效藥物）的驅(qū)動(dòng)。然 而采用超高性能色譜系統(tǒng)就能獲

8、得靈敏度的顯著提高。在UPLC中始終可得到較高的靈敏度。UPLC使用小顆粒技術(shù)可以得到更髙的 柱效（因而改善了分離度）、更窄的色譜峰寬（見(jiàn)式5）,即更高的靈敏度。為堡適島邕蕊方一因?yàn)樯V峰變得更窄，峰高也就更高了（見(jiàn)式6）；同樣，當(dāng)UPLC用于快速 分析、用較短色譜柱而使柱效不變時(shí)，色譜峰高會(huì)相應(yīng)增加（見(jiàn)式7）。因此，使 用UPLC技術(shù)，不僅可以在保持與HPLC相同分離度時(shí)提高峰髙，而且在改善分 離度的同時(shí)亦可提高峰高即靈敏度。圖5: HPLC到UPLC：靈敏度的改善無(wú)需折衷1.4 UPLC為最佳的質(zhì)譜入口UPLC與質(zhì)譜聯(lián)用，可以實(shí)質(zhì)性地改善質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量。UPLC的特殊性 能使質(zhì)譜檢測(cè)器

9、的性能首次得以充分體現(xiàn)。由于低流速下色譜峰擴(kuò)散不大，增加了峰濃度，有利于提高離子源的效率，因 而使靈敏度至少提高了 3倍。除UPLC技術(shù)本身帶來(lái)的速度、靈敏度和分離度的改 善外，UPLC的超強(qiáng)分離能力有助于待測(cè)物與同其競(jìng)爭(zhēng)電離的雜質(zhì)的分離，從而可 以使質(zhì)譜檢測(cè)器的靈敏度因離子抑制現(xiàn)象的減弱或克服而得到進(jìn)一步的提高。故使 用UPLCMS聯(lián)用，可以獲得靈敏度較HPLCMS聯(lián)用系統(tǒng)大有改善的分離結(jié) 果，獲得更多、質(zhì)量更好的信息。G舛3通量提島倍 靈敏度提高皿HPLC/MS$.237Drte arep4iican, Axwr Inhad樸tvHPLC Column.Peak 0.6min wide a

10、t 10% heightA5洛飛心帀m石ii廠必打弼/玄比飛心亦啟看亦廁宙胡血.GSrtCGWRMdCharaEU1A1MH?KUPLC/MSACQUITY UPLC Column.Peak - 0 13min wide at 10% height,y|,|U,八八八八伽冷5io wa w m 3Dm ww mxd odd “id sdcduoo cdCourtesy Frances Goryckl & Chung-ping Yu圖6: HPLC-MS到UPLC-MS：靈敏度的額外提高1.5簡(jiǎn)單方便的方法轉(zhuǎn)換UPLC與HPLC基于相同的分離機(jī)理，故相互之間的方法轉(zhuǎn)換非常容易和方 便?，F(xiàn)有HPL

11、C方法可以按照比例直接轉(zhuǎn)換成UPLC方法；相反，UPLC方法也 很容易可以轉(zhuǎn)換成HPLC方法供常規(guī)HPLC系統(tǒng)使用。UPLC不僅比傳統(tǒng)HPLC具有更高的分離能力，而且結(jié)束了人們多年不得不 在速度和分離度之間取舍的歷史。使用UPLC可以在很寬的線速度、流速和反壓 下進(jìn)行高效的分離工作，并獲得優(yōu)異的結(jié)果。2 UPLC的創(chuàng)新和技術(shù)基礎(chǔ)1高柱效的UPLC色譜柱是UPLC技術(shù)中最重要的部分。新一代應(yīng)用“雜化顆 粒技術(shù)” (Hybrid particle technology, HPT)研制的橋式乙烷一硅碳雜化顆粒具 有耐高壓，寬pH使用范圍(pH 2-12)的特點(diǎn)。Waters公司為UPLC色譜柱裝備了

12、一臺(tái)用獨(dú)立柱塞驅(qū)動(dòng)，能進(jìn)行4種溶劑 切換的二元高壓梯度輸液泵。耐壓可達(dá)16000psi,在這個(gè)壓力下，溶劑尤其是梯 度分離時(shí)使用的混合溶劑，其壓縮性會(huì)有顯著變化，因此溶劑輸送系統(tǒng)可在很寬 壓力范圍內(nèi)，具有補(bǔ)償溶劑壓縮性變化的能力。從而能在等度或者梯度條件下保 持流速的穩(wěn)定性和梯度的重現(xiàn)性。在UPLC中為保護(hù)色譜柱不受極端高壓力波動(dòng)的影響，進(jìn)樣過(guò)程應(yīng)當(dāng)相對(duì)無(wú) 壓力波動(dòng)；進(jìn)樣系統(tǒng)的死體積應(yīng)足夠小以降低樣品譜帶展寬；快速進(jìn)樣周期可以 使得UPLC在具有高樣品容量的同時(shí)也實(shí)現(xiàn)高速度，還具有極低交叉污染的小體 積進(jìn)樣的能力。Acquity UPLC采用的進(jìn)樣新技術(shù)包括：針內(nèi)針進(jìn)樣探頭 （XYZZ ）,它

13、是一種高速進(jìn)樣機(jī)械裝置，它是使用液相色譜管路（PEEK材料） 充當(dāng)進(jìn)樣針以減少死體積，而“外針”是一小段硬管，用來(lái)扎破樣品瓶塞；壓力 輔助進(jìn)樣，采用一強(qiáng)一弱的雙溶劑清洗進(jìn)樣針以降低進(jìn)樣時(shí)候的交叉污染。UPLC對(duì)于檢測(cè)器有兩個(gè)要求：高的采樣速度，使得它可以收集足夠多的數(shù) 據(jù)點(diǎn)，以獲得準(zhǔn)確，可重現(xiàn)的保留時(shí)間和峰面積；檢測(cè)池的死體積要盡可能小， 減少譜帶擴(kuò)展以保持高柱效o Waters公司的Acquity UPLC使用采樣速度為40 點(diǎn)/s,池體積僅為500 nl（約為HPLC的1/20）的新型光導(dǎo)纖維傳導(dǎo)的流通池。當(dāng)光 束通過(guò)光導(dǎo)纖維傳入流通池后，利用聚四氟乙烯池壁的全反射特征，不損失光能 量，而使得檢測(cè)靈敏度比HPLC高23倍。光源可使用可變波長(zhǎng)的紫外光或二極 管陣列系統(tǒng)。3 UPLC的缺陷UPLC可以更快的速度和更高的質(zhì)量完成以往HPLC的工作，為用戶節(jié)省寶 貴的時(shí)間和日常溶劑消耗，從而獲得最大的投資回報(bào)。但是小顆粒填料在帶來(lái)高 柱效高分離速度的同時(shí)也會(huì)引起高的反壓，使得工作柱壓比普通HPLC高許多， 導(dǎo)致UPLC的