人胰島素的制備

1、-作者xxxx-日期xxxx人胰島素的制備【精品文檔】人胰島素的制備一、 獲得目的基因從供體細胞中提取mRNA，以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成胰島素mRNA互補DNA，再以cDNA第一鏈為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶I的作用在，最終合成編碼它的雙鏈DNA序列。即得到了目的基因。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應法(一)從人體細胞內(nèi)提取胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA1, 細胞總RNA的提取 :取胰島B細胞，用PBS洗后，加入TRIZOL試將細胞破裂，后用DEPC處理，多次離心后，取RNA白色沉淀，測OD值，電泳。2 ，從總RNA中分離mRNA：取上述提取的總RNA若干，加入Buffer OBB ，Ol

2、igotex Suspension ，打勻。 70水?。呀釸NA的二級結(jié)構(gòu)）， 20-30條件下，靜置（讓Oligotex與mRNA結(jié)合）。 將Oligotex/mRNA復合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速離心，加Buffer將其他RNA洗脫，最后用瓊脂糖凝膠電泳純化mRNA。（二）mRNA轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈cone 第一鏈的合成 加入上步獲得的mRNA和適當引物于EP管中，加入RNase-free water，混勻后,70反應10分鐘，反應完成后,立刻將反應體系置于冰上5min;稍微離心一下,順序加入緩沖液、 RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、 dNTP（加入放射性同位素利于檢驗）， 混勻，

3、稍微離心反應物之后,42放置2分鐘。取出置于冰上。電泳分析，同位素活性測定。（三）PCR法擴增，特異合成目的cDNA鏈通過胰島素的特異引物，用PCR法進行擴增，特異的合成胰島素的cDNA鏈 。PCR法的操作步驟：預變性引物退火引物延伸循環(huán)25-35次最后延伸 前端引物： 5-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3 后端引物： 5-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc

4、cag ctg gta-3二、 組建重組質(zhì)粒采用pQE-30質(zhì)粒作為載體，用雙酶切法進行基因重組。用兩種酶限制性內(nèi)切核酸酸消化載體DNA和外源DNA片段，使載體和外源目的基因的兩端分別形成不同黏性末端，將它們混合，在連接酶的作用下相同的黏性末端可退火連接成重組DNA分子，從而實現(xiàn)DNA的定向連接。pQE-30用Hind 和BamH酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離、回收純化酶切片段。外源DNA片段同樣也用Hind 和BamH酶切并回收純化酶切片段。雙酶切后的載體外源DNA片段混合退火，因為Hind 和BamH的黏性末端不匹配，避免了載體和外源DNA片段的自身連接，外源DNA片段只能定向地連接到載體的Hi

5、nd 和BamH位點之間。當然也不可避免發(fā)生載體的Hind 和BamH的黏性末端之間的兩個堿基互補形成開環(huán)，轉(zhuǎn)到大腸桿菌中被修復，但這樣的重組子占少數(shù)，是低效轉(zhuǎn)化。三、構(gòu)建基因工程菌(一) 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈同時表達法將人胰島素的A鏈和B鏈編碼序列拼接在一起，然后組裝在大腸桿菌-半乳糖苷酶基因的下游。重組子表達出的融合蛋白經(jīng)CNBr處理后，分離純化A-B鏈多肽，然后再根據(jù)兩條鏈連接處的氨基酸殘基性質(zhì)，采用相應的裂解方法獲得A鏈和B鏈肽段，最終通過體外化學折疊制備具有活性的重組人胰島素。重組DNA的轉(zhuǎn)化1, CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞：取100 ml 菌體培養(yǎng)至

6、OD600 = 0.5，離心收集菌體，用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心，收集菌體，用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液懸浮菌體 ，冰浴放置12 - 24小時，備用。2，大腸桿菌感受態(tài)細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取100 ml 感受態(tài)細胞，加入相當于50 ng 載體的重組，DNA連接液，混勻。冰浴放置半小時 。在42 保溫 2 分鐘（熱脈沖），快速將轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 2 分鐘 。加入1 ml 新鮮培養(yǎng)基，于37 培養(yǎng) 1 小時（擴增） 。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選。經(jīng)典的CaCl2轉(zhuǎn)化方法：a將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4下3000g離

7、心10分鐘。b 棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘后,4下3000g離心10分鐘。 c棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細胞懸液。d 感受態(tài)細胞分裝成200l的小份, 貯存于-70。e從-70冰箱中取200l感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。f 加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10l),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。 g42水浴中熱擊90秒或37水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。 h向管中加入1ml

8、 LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37振蕩培養(yǎng)1小時,使細菌恢復正常生長狀態(tài),并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。 i將上述菌液搖勻后取100l 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37培養(yǎng)16-24小時。(二)重組子的篩選和鑒定（載體遺傳標記檢測）隨機挑取轉(zhuǎn)化單菌落，在LBAK培養(yǎng)基(含100p gml氨芐青霉素和50ug/ml卡那霉素)中進行培養(yǎng)，用LIPTG誘導表達。表達情況用165SDSPAGE進行分析。直接電泳檢測法將初篩選獲得的重組菌擴大培養(yǎng)后，提取其質(zhì)粒DNA，通過PCR對其進行擴增，利用有插入片段的重組載體的分子量比

9、野生型載體分子量大，用電泳法檢測質(zhì)粒是否為重組質(zhì)粒。目的蛋白表達檢驗所得菌體經(jīng)溶菌酶超聲破碎細胞后得到的包涵體進行SDSPAGE分析，所需基因工程菌表達的外源蛋(His)6Arg-Arg-人胰島素原以包涵體形式存在，其分子大小約為13kb，經(jīng)電泳與胰島素原marker對比，如條帶顯示有所需目的蛋白，則所得菌既可做工程菌使用，經(jīng)擴大培養(yǎng)后，斜面保存以便后續(xù)使用。 15%甘油保存菌種，菌液=20:80,充分混勻后,-70度保藏。四、 培養(yǎng)工程菌優(yōu)化發(fā)酵條件采用比濁法測定不同時間培養(yǎng)基中菌量，繪制基因工程菌的生長曲線，在搖瓶培養(yǎng)的水平下，采用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵基因工菌，培養(yǎng)4小時候即進入對數(shù)生長期

10、，而且對數(shù)生長期可延長至17小時。1，正交優(yōu)化實驗：采用正交法，選取搖瓶培養(yǎng)條件中七個主要因素進行兩水平正交優(yōu)化，該七個因素為：種子活化方式，搖床轉(zhuǎn)速(通風量)，IPTG誘導溫度，接種量，IPTG添加量，誘導時間，補料方式。分別用A、B、C、D、E、F、G表示以每升培養(yǎng)基收獲濕菌體的量及發(fā)酵液的A600為目標量，考察條件優(yōu)化的效果，進行八次實驗，對實驗結(jié)果進行分析，優(yōu)化出最佳實驗條件。2，其他條件優(yōu)化：在優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，進一步就各種金屬元素對苗體生長發(fā)重組蛋白誘導的影響作了分析。3，放大培養(yǎng)（比較不同發(fā)酵工藝產(chǎn)量）：在優(yōu)化搖瓶水平發(fā)酵試驗的基礎(chǔ)上，放大至1 L培養(yǎng)基中比較兩種發(fā)酵工藝。在

11、不同轉(zhuǎn)速，通氣量，pH條件下，比較選擇產(chǎn)量最高的發(fā)酵工藝。五、 產(chǎn)物分離純化由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細胞、而不是從正常細胞生產(chǎn)的，所以對產(chǎn)品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產(chǎn)品?；蚬こ趟幬锏姆蛛x純化一般不應超過4-5個步驟，包括細胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。發(fā)酵液進行細胞分離，分別得到胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物。胞外產(chǎn)物直接進行透析濃縮然后進行再復性及酶轉(zhuǎn)化，再對產(chǎn)物進行高度純化，最后制劑即可。胞內(nèi)產(chǎn)物用溶酶菌或超聲波將細胞破碎，細胞破碎后用高速離心法進行固液分離。分離后用變性劑或者離子去污劑得到包含體，再用變性劑（尿素）使其變形，接著用二次復性法將其復性。對復性后的產(chǎn)

12、物進行透析濃縮，然后進行再復性及酶轉(zhuǎn)化，再對產(chǎn)物進行高度純化，最后制劑即可。重組蛋白分離純化的特點重組蛋白質(zhì)分離純化的特點為：(1)大多數(shù)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品是生物活性物質(zhì)，在分離純化過程中，有機溶劑、溶液pH值、離子強度的變化均可使蛋白質(zhì)變性失活a(2)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品在物料中含量很低，凰物料組成非常復雜。例如，利用基因工襁菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白藤，物料中含有大量綴成復雜的培養(yǎng)基、榮體生產(chǎn)代謝物等，疆揀蛋鑫囊魏含量囂豢不瑟蛋鑫凄慈爨鵑1。舂些囂揀鬣囊矮存在予綴懿武或在胞內(nèi)形成包含體，為獲敬蛋白質(zhì)，還需避行細脆破碎，結(jié)鬈物料中含有大量的細胞碎片和胞內(nèi)產(chǎn)物。(3)含蛋白質(zhì)產(chǎn)晶的物料不穩(wěn)定，蛋白質(zhì)產(chǎn)品易受料液中蛋

13、自水解酶降解。(4)很多熏組蛋白質(zhì)產(chǎn)品作為醫(yī)藥、食品被人炎利用，因而要求蛋國艨產(chǎn)器必綏是裹癀縫銫瓣，產(chǎn)蘸無螢、茲致熱源等。與傳統(tǒng)麓生物大分子分離方式楣鐨，蘩綴蛋臼的分離純純恣憝秘用其攜理稻化學性質(zhì)的差異，即以分子的大小、形狀、溶解度、等電點、祭疏水性以及與其它分子的親和性等性質(zhì)建立起來的。二次復性法：05g包涵體溶解于一定量的緩沖液B(50mmolLGlyNaOH，8 molL尿素，B_巰基乙醇，pH 95)中，使之充分混懸，靜置1小時以上?；鞈乙悍植街鸬渭尤氲骄彌_液C(50mmolLGly-NaOH，半胱氨酸一胱氨酸，pH 95)中，4靜置復性過夜。上樣于已用50mmolLGlyNaOH(p

14、H 95)平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用01molL的氯化鈉梯度洗脫，通過SDS-PAGE確定RRhPI位置，用DEAE-Sepharose FF做離子交換層析，收集含RRhPI的洗脫峰2，層析圖譜見（圖6）。電泳檢測顯示(圖11)峰2主要為RRhPI，及少量高分子雜質(zhì)，收集峰2做再復性。峰1為pH高于95及一些疏水性蛋白質(zhì)形成的穿透峰，絕大部分pH低于RRhPI的蛋白質(zhì)和核酸類雜質(zhì)則牢固地結(jié)合在柱子上，在較高鹽濃度及2molL NaCl的條件下被洗脫下來，形成其他峰3和峰4。胰島素原（RRhPI）的再復性及酶切轉(zhuǎn)化：1,復性將初步復性及純化后的RRhPI通過透析濃縮，先后轉(zhuǎn)換

15、到緩沖液B和D(50mmolL G1y-NaOH，氧化型谷胱甘肽(GSSG)一還原型谷胱甘(GSH)pH95)中，使蛋白濃度為01O6 mgml，4靜置過夜。2,酶切復性后的RRhPI復性液調(diào)節(jié)pH后加入一定量的胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidase B)在37。C進行協(xié)同酶切一段時間，然后滴加2 molL ZnCI：至ZnCl：濃度為01molL終止反應并沉淀生成的hI，用雙蒸水洗滌沉淀得較純B9重組人胰島素約79 mg/L培養(yǎng)基。重組胰島素粗品的純化：胰島素粗品用02 molL NaAcHAc，pH40溶解。溶解后的樣品通過Superdex 75進行純化(圖

16、10)，得1、2、3峰，收集峰3，透析后凍干即為胰島素產(chǎn)品所得胰島素產(chǎn)品用SDS-PAGE分析為單帶，電泳檢測見圖。六、 除菌過濾 傳統(tǒng)過濾只能濾去空氣中的塵埃、液體中的異物微粒，很難去除微生物活體（細菌、病毒及熱原體）；薄膜過濾是微孔篩分，大于孔徑的微粒均被截留，微生物粒子大小為0.5-2微米，只要選用0.45微米 的微孔濾膜即可將微生物截留去除，用0.22微米的微孔濾膜則可能將病毒、熱原體去除。 注射用藥液除用傳統(tǒng)過濾器去除藥液中的異物外，現(xiàn)已采用微孔濾膜將澄清的藥液再次除菌、除熱原，其濾膜孔徑最好在0.22微米以下。制藥空氣的過濾亦因GMP的不同級別要求而采用相應的器材、過濾器。要指出的

17、是，制藥無菌空氣的供應僅采用傳統(tǒng)濾材、濾器往往不能達到要求，其終端必須選用微孔薄膜，孔徑必須在0。45微米以下。注射用無菌藥液的處理：按GMP要求，注射用藥液應當無菌無熱原，本品藥液配制好后，經(jīng)過粗砂棒、細砂棒（ 適當使用滑石粉或碳粉）過濾成澄明液后，再經(jīng)過0.45微米 多層微孔濾芯除菌，終端通過0.22微米單層超微孔濾膜后上機灌裝。目前，用于過濾器常用的主要過濾材料大致有以下幾種：混合纖維素酯常用來制成圓形的單片平板濾膜，用于液體和氣體的精過濾；聚丙烯(PP)做成折疊式，常用于筒式過濾器，有較大的孔徑，其具有親水性，屬粗過濾材料；聚偏二氟乙烯(PVDF)屬精過濾材料，耐熱和耐化學穩(wěn)定，蒸汽滅

18、菌承受性良好，可制成親水性濾膜，較廣泛應用于制藥工業(yè)無菌制劑用水及注射用水的過濾；聚醚砜(PES)做成折疊式，常用于筒式過濾器，耐溫耐水解性能好，親水性材料，用于精度較高的溶液的精過濾；尼龍做成折疊式，常用于筒式過濾器，親水性材料，常用作液體的精過濾；聚四氟乙烯(PTFE)做成折疊式，常用于筒式過濾器，疏水性材料，其是使用相當廣泛的一種材料，耐熱耐化學穩(wěn)定，常用于水、無機溶劑及空氣的精過濾。除菌過濾器的特點（1）除菌過濾器一般采用十字懸掛式，水平進出。多芯過濾器可設(shè)計成落地式。（2）有些使用場合根據(jù)實際需要分成預過濾器、精過濾器兩種。（3）空氣流向：從外向內(nèi)穿過濾芯。（4）進入除菌過濾器的壓縮

19、空氣必須先經(jīng)過至少三級的精密過濾器及干燥機。除油、除水、除塵，油霧濃度應0.01PPM，否則將影響除菌濾芯的壽命，達不到預期的除菌效果。（5）定期殺菌，根據(jù)實際使用情況每周或每月12次，每次30分鐘，采用經(jīng)過1過濾精度的潔凈飽和蒸汽殺菌。蒸汽溫度140，蒸汽壓力0.3MPa。閥門緩慢開關(guān)。（6）作為罐體、設(shè)備的呼吸器使用時，其作用主要在于連通大氣防止設(shè)備內(nèi)部負壓和隔離開空氣中的污染源，過濾方面的功能不大，因此在過濾上基本無要求。 對胰島素進行除菌過濾后采用胰島素凍干粉等凍干技術(shù)凍干，既得胰島素結(jié)晶。經(jīng)包裝等工序后的成品。如下圖：七、 半成品檢定重組人胰島素半成品檢測（檢測提取純化后重組人胰島素

20、樣品）：（一）雜質(zhì)檢定1，有關(guān)物質(zhì) ： 取本品適量，用鹽酸溶液制成每1ml中含的溶液，作為供試品溶液。取供試品溶液20ml注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按面積歸一化法計算，含A21脫酰胺人胰島素不得過1.5%，其他有關(guān)物質(zhì)總量不得過2.0%。2，高分子蛋白質(zhì) ：取本品適量，用鹽酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液，作為供試品溶液。按照分子排阻色譜法試驗。以色譜用親水改性硅膠為填充劑（510mm）；冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液（15：20：65）為流動相，流速為每分鐘，檢測波長為276nm。取重組人胰島素單體-二聚體對照品，用鹽酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液；取100ml注入液相色譜儀，重組

21、人胰島素單體與二聚體的分離度應符合要求。取供試品溶液100ml，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，除去保留時間大于人胰島素主峰的其它峰面積，保留時間小于人胰島素主峰的所有峰面積之和不得過1.0%。3，鋅 ：對照品溶液的制備 精密量取鋅標準溶液（1000g的溶液。將上述各溶液與供試品溶液，照原子吸收分光光度法，在213.9nm的波長處測定，按干燥品計，含鋅量不得過1.0%。4，熾灼殘渣 ：取本品約，依法檢查，遺留殘渣不得過2.0%。（二）效價測定：按照高效液相色譜法測定取本品適量，精密稱定，用0.01mol/L鹽酸溶液定量稀釋至每1ml中約含10單位的溶液（臨用新配）。精密量取20ml注入液相色譜儀，

22、記錄色譜圖；另取重組人胰島素對照品適量，同法測定。按外標法以人胰島素峰面積（包括A21脫酰胺峰面積）計算，即得。（三）胰島素生物測定法本法系比較胰島素標準品（S）與供試品（T）引起小鼠血糖下降的作用，以測定供試品的效價。的0.9%氯化鈉溶液，使溶解成每1ml中含20單位的容易忘，48貯存，以不超過5天為宜。標準品稀釋液的制備 試驗當日，精密量取標準品溶液適量，按高低劑量組(ds2 , ds1)加0. 9氯化鈉溶液(pH2. 5)制成兩種濃度的稀釋液，高低劑量的比值(r)不得大于1:0. 5。高濃度稀釋液一般可制成每1 ml中含0. 060. 12單位，調(diào)節(jié)劑量使低劑量能引起血糖明顯下降，高劑量

23、不致差別。 供試品溶液與稀釋液的制備 按供試品的標示量或估計效價(AT)，照標準品溶液與其稀釋液的制備法制成高、低兩種濃度的稀釋液，其比值(r)應與標準品相等，供試品與標準品高低劑量所致的反應平均值應相近。 測定法取健康合格、同一來源、同一性別、出生日期相近的成年小鼠，體重相差不得超過3g，按體重隨機等分成4組，每組不少于10只，逐只編號，各組小鼠分別自皮下注人一種濃度的標準品或供試品稀釋液，每鼠0. 2 0. 3ml，但各鼠的注射體積(ml)應相等。注射后40分鐘，按給藥順序分別自眼靜脈叢采血，用適宜的方法，如葡萄糖氧化酶一過氧化酶法測定血糖值。第一次給藥后間隔至少3小時，按雙交叉設(shè)計，對每

24、組的各鼠進行第二次給藥，并測定給藥后40分鐘的血糖值。照生物檢定統(tǒng)計法(附錄XlV)中量反應平行線測定雙交叉設(shè)計法計算效價及實驗誤差。 本法的可信限率(FL%)不得大于25 %（四）注射液檢測1，滲透壓摩爾濃度： 除另有規(guī)定外，靜脈輸液及椎管注射用注射液按各品種項下的規(guī)定，照滲透壓摩爾濃度測定法檢查，應符合規(guī)定。 2，可見異物: 除另有規(guī)定外，照可見異物檢查法檢查，應符合規(guī)定。 3，不溶性微粒 ：除另有規(guī)定外，溶液型靜脈用注射液、注射用無菌粉末及注射用濃溶液照不溶性微粒檢查法檢查，均應符合規(guī)定。 3，無菌: 按照無菌檢查法檢查，應符合規(guī)定。 4，細菌內(nèi)毒素或熱原： 除另有規(guī)定外，靜脈用注射劑按

25、各品種項下的規(guī)定，照細菌內(nèi)毒素檢查法或熱原檢查法檢查，應符合規(guī)定。熱原（pyrogen） 1.熱原的定義 : 注射后能引起人體特殊致熱反應的物質(zhì)。 2.熱原的組成 : 熱原是微生物的代謝產(chǎn)物，是微生物的一種內(nèi)毒素，大多數(shù)細菌都能產(chǎn)生熱原，革蘭氏陰性桿菌致熱力最強。熱原由磷脂、脂多糖和蛋白質(zhì)所組成的復合物，其中脂多糖是致熱活性中心。脂多糖組成因菌種的不同而異，熱原的分子量106左右。 3.熱原的危害 : 含熱原的注射劑輸入人體后，約半小時人體就發(fā)冷、寒戰(zhàn)、體溫升高、全身痛、出汗、惡心嘔吐等，嚴重時高燒40度、昏迷、虛脫、甚至死亡。八、成品檢定重組人胰島素成品檢測（即檢測重組人胰島素注射液樣品）：

26、本品為重組人胰島素的無菌水溶液。其效價應為標示量的90.0110.。本品可加入適量的苯酚或間甲酚作抑菌劑?！捐b別】（1） 取本品，按照重組人胰島素項下的鑒別項試驗，顯相同的結(jié)果。（2）在苯酚或間甲酚檢查項下記錄的色譜圖中，供試品溶液中苯酚峰或間甲酚峰的保留時間應與苯酚或間甲酚對照品的保留時間一致。【檢查】1，有關(guān)物質(zhì) 取本品，每1ml中加9.6molL鹽酸溶液3l酸化，混勻后作為供試品溶液；取供試品溶液適量（約相當于人胰島素2單位），按照重組人胰島素項下的方法檢查，扣除苯酚峰和間甲酚峰，按面積歸一化法計算，A21脫酰胺人胰島素不得過2.0%，其他有關(guān)物質(zhì)總量不得過6.0%。2，高分子蛋白質(zhì) 取本品，每1ml加9.6molL鹽酸溶液3L酸化，混勻后作為供試品溶