植物染色體原位雜交

1、(AT，GC)一、熒光原位雜交一、熒光原位雜交二、基因組原位雜交二、基因組原位雜交 三、原位三、原位PCR四、引物原位雜交技術(shù)四、引物原位雜交技術(shù)五、原位雜交結(jié)合顯帶標(biāo)記技術(shù)五、原位雜交結(jié)合顯帶標(biāo)記技術(shù)六、原位雜交結(jié)合免疫組織化學(xué)的雙標(biāo)記技術(shù)六、原位雜交結(jié)合免疫組織化學(xué)的雙標(biāo)記技術(shù)七、電鏡原位雜交技術(shù)七、電鏡原位雜交技術(shù)八、整體熒光原位雜交技術(shù)八、整體熒光原位雜交技術(shù)九、九、DNA纖維熒光原位雜交纖維熒光原位雜交 fiber-FISH一、熒光原位雜交一、熒光原位雜交 (Fluorescence (Fluorescence in situin situ Hybridization) Hybrid

2、ization) 是原位雜交技術(shù)大家族中的一員，因其所用是原位雜交技術(shù)大家族中的一員，因其所用探針被熒光物質(zhì)探針被熒光物質(zhì)標(biāo)記標(biāo)記（間接或直接）而得名，基本原理是熒光標(biāo)記的核酸探（間接或直接）而得名，基本原理是熒光標(biāo)記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火溫度下復(fù)性；通過顯微針在變性后與已變性的靶核酸在退火溫度下復(fù)性；通過顯微鏡觀察熒光信號(hào)可在不改變被分析對(duì)象（鏡觀察熒光信號(hào)可在不改變被分析對(duì)象（即維持其原位即維持其原位）的）的前提下對(duì)靶核酸進(jìn)行分析。前提下對(duì)靶核酸進(jìn)行分析。 DNADNA熒光標(biāo)記探針是其中最常用的一類核酸探針。利用此探熒光標(biāo)記探針是其中最常用的一類核酸探針。利用此探針針可對(duì)

3、組織、細(xì)胞或染色體中的可對(duì)組織、細(xì)胞或染色體中的DNADNA進(jìn)行染色體及基因水平進(jìn)行染色體及基因水平的分析的分析。 二、基因組原位雜交二、基因組原位雜交 (Genome in situ Hybridization)三、原位三、原位PCR 原位原位PCRPCR技術(shù)的基本原理，就是將技術(shù)的基本原理，就是將PCRPCR技術(shù)的高效擴(kuò)增與原技術(shù)的高效擴(kuò)增與原位雜交的細(xì)胞定位結(jié)合起來，從而在組織細(xì)胞原位檢測(cè)單位雜交的細(xì)胞定位結(jié)合起來，從而在組織細(xì)胞原位檢測(cè)單拷貝或低拷貝的特定的拷貝或低拷貝的特定的DNADNA或或RNARNA序列。序列。 原位原位PCRPCR技術(shù)的待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)技術(shù)

4、的待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性，胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性，當(dāng)進(jìn)行當(dāng)進(jìn)行PCRPCR擴(kuò)增時(shí)，各種成分，如引物，擴(kuò)增時(shí)，各種成分，如引物，DNADNA聚合酶，核苷聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的核內(nèi)的RNARNA或或DNADNA為模板，于原位進(jìn)行擴(kuò)增。為模板，于原位進(jìn)行擴(kuò)增。 擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細(xì)胞膜擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細(xì)胞膜或在膜內(nèi)外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細(xì)胞內(nèi)或在膜內(nèi)

5、外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定單拷貝或低拷貝的特定DNADNA或或RNARNA序列在原位以呈指數(shù)極擴(kuò)序列在原位以呈指數(shù)極擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。增，擴(kuò)增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。 四、引物原位雜交技術(shù)四、引物原位雜交技術(shù) 是通過退火一個(gè)是通過退火一個(gè)寡核苷酸寡核苷酸DNA DNA 引物引物到制備在載玻到制備在載玻片上的染色體的變性片上的染色體的變性 DNA DNA 上上 , ,用滲入用滲入 的標(biāo)記核的標(biāo)記核苷酸在原位進(jìn)行酶促延長(zhǎng)并進(jìn)行檢測(cè)的染色體標(biāo)苷酸在原位進(jìn)行酶促延長(zhǎng)并進(jìn)行檢測(cè)的染色體標(biāo)記技術(shù)記技術(shù) 染色體原位雜交簡(jiǎn)單流程圖染色體原

6、位雜交簡(jiǎn)單流程圖 探針探針 靶子靶子1.分離分離DNA 1. 染色體的制片準(zhǔn)備染色體的制片準(zhǔn)備2.標(biāo)記標(biāo)記 2. 雜交前處理雜交前處理3.變性變性 3.變性變性 4. 雜交雜交 5.雜交后處理（解離非特異性結(jié)合的雙鏈，雜交后處理（解離非特異性結(jié)合的雙鏈，除去未雜交的探針）除去未雜交的探針） 6.雜交體的檢測(cè)（雜交雜交體的檢測(cè)（雜交DNA呈現(xiàn)顏色呈現(xiàn)顏色A,未未雜交的呈現(xiàn)顏色雜交的呈現(xiàn)顏色B）單鏈單鏈DNA1 1制片在制片在6060烘箱中干燥過夜烘箱中干燥過夜2 2用用100ul100ulmlml的的RNaseA(2SSCRNaseA(2SSC配制配制) )，3737小時(shí)，小時(shí)，2SSC2SSC

7、漂去蓋漂去蓋片，片，2SSC32SSC35 5分鐘洗滌，分鐘洗滌，7070-95-95一一100100乙醇脫水，每乙醇脫水，每級(jí)級(jí)3 3分鐘。分鐘。3 3用用0.010.01Pepsin(10mMHCIPepsin(10mMHCI配制配制) )，3737，20-4020-40分鐘，分鐘，1 1PBS2PBS25 5分鐘。分鐘。4 41 1甲醛甲醛(50MmMgCl(50MmMgCl2 2，1XPBS1XPBS配制配制) )于室溫下固定于室溫下固定5 5分鐘，分鐘，2SSC32SSC35 5分鐘。分鐘。rDNA 在高等真核生物中，核糖體是合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所。一個(gè)完整的在高等真核生物中，核糖體是合成

8、蛋白質(zhì)的場(chǎng)所。一個(gè)完整的核糖體由核糖體由60S、40S大小亞基組成，構(gòu)成核糖體亞基的主要成分是大小亞基組成，構(gòu)成核糖體亞基的主要成分是核糖體核糖體-RNA(rRNA)與蛋白質(zhì)的復(fù)合物。與蛋白質(zhì)的復(fù)合物。 其中其中rRNA有有4種類型，即種類型，即18SrRNA、5.8S rRNA、28S rRNA和和5S rRNA。編碼這幾種。編碼這幾種rRNA的基因有的基因有2種，一種為種，一種為45S rDNA，另一種為另一種為5S rDNA。 45S rDNA 45S rDNA是高度保守串聯(lián)重復(fù)序列有幾千拷貝數(shù)，特異是高度保守串聯(lián)重復(fù)序列有幾千拷貝數(shù)，特異定位于染色體的定位于染色體的核仁組織區(qū)核仁組織區(qū)

9、(Nucleolar Organizing (Nucleolar Organizing Region,NOR)Region,NOR)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)上顯示為次縊痕，其遠(yuǎn)端是隨體細(xì)胞形態(tài)學(xué)上顯示為次縊痕，其遠(yuǎn)端是隨體(satellite)(satellite)。 其編碼區(qū)的保守性和非編碼區(qū)的多態(tài)性是研究動(dòng)植物系統(tǒng)其編碼區(qū)的保守性和非編碼區(qū)的多態(tài)性是研究動(dòng)植物系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化的一個(gè)有用標(biāo)記發(fā)育與進(jìn)化的一個(gè)有用標(biāo)記，而且由于該基因?yàn)楦叨戎貜?fù)序列，而且由于該基因?yàn)楦叨戎貜?fù)序列，在近緣物種中發(fā)生著位于染色體上的位點(diǎn)以及同一位點(diǎn)基因拷在近緣物種中發(fā)生著位于染色體上的位點(diǎn)以及同一位點(diǎn)基因拷貝數(shù)多少的變化，因而通過

10、貝數(shù)多少的變化，因而通過rDNA-FISHrDNA-FISH技術(shù)對(duì)其在染色體上分技術(shù)對(duì)其在染色體上分布的位置、位點(diǎn)以及拷貝數(shù)多少進(jìn)行比較研究，可以確定近緣布的位置、位點(diǎn)以及拷貝數(shù)多少進(jìn)行比較研究，可以確定近緣物種的親緣進(jìn)化關(guān)系及起源。物種的親緣進(jìn)化關(guān)系及起源。 而而5S rDNA5S rDNA雖然也是串聯(lián)重復(fù)序列，但其并不位于核仁組雖然也是串聯(lián)重復(fù)序列，但其并不位于核仁組織區(qū)上?？梾^(qū)上。四、洗脫和信號(hào)檢測(cè)四、洗脫和信號(hào)檢測(cè) 7 7雜交制片用雜交制片用2SSC2SSC漂洗去蓋片漂洗去蓋片，0.10.1SDS(2SSCSDS(2SSC配配制制)373)3735 5分鐘，分鐘，0.10.1SDS(0

11、SDS(02 2SSCSSC配制配制) 373) 3735 5分分鐘，鐘，2SSC2SSC室溫下沖洗室溫下沖洗2 2次，甩干制片。次，甩干制片。 8 8加加50ul50ul片片5 5BSA(4SSCBSA(4SSCTeween20Teween20配制配制) )，加蓋片，加蓋片，3737封阻封阻3030分鐘。分鐘。 9 9甩干封阻液甩干封阻液( (制片不能見干制片不能見干) )，加，加30ul30ul片片AlUi-DIG-FITCAlUi-DIG-FITC或或Anti-DIG-RhodamineAnti-DIG-Rhodamine抗體抗體20ug20ugmlml溶于含溶于含5 5BSABSA的的

12、1XPBS1XPBS中中) )，加蓋片，加蓋片，3737溫育溫育1 1小時(shí)。小時(shí)。1010在在1XPBS1XPBSTeween20(0Teween20(02 2) )中，中，373X5373X5分鐘，用分鐘，用PI(2ugPI(2ugml,1ml,1PBSPBS配制配制)30ul/)30ul/片襯染片襯染7 7分鐘或用分鐘或用DAPI(2ugDAPI(2ugm1)m1)襯襯染染3 3分鐘，分鐘，1 1PBS3PBS33 3分鐘洗去襯染劑，甩干，分鐘洗去襯染劑，甩干，用抗熒光衰用抗熒光衰減劑減劑(Vectashied)(Vectashied)封片封片。 甘薯甘薯GISH45srDNA(45srD

13、NA(黑麥黑麥) ) 黑麥間期核黑麥間期核 玉米玉米 A A為雜交前核型；為雜交前核型； B B為同一核型雜交后結(jié)果為同一核型雜交后結(jié)果 玉米間期核玉米間期核 A A為雜交前間期核；為雜交前間期核；B B為雜交后結(jié)果為雜交后結(jié)果 豆角 A為雜交前核型； B為同一核型雜交后結(jié)果 豆角間期核 A為雜交前間期核；B為雜交后結(jié)果 水稻水稻 A A為雜交前核型；為雜交前核型； B B為同一核型雜交后結(jié)果為同一核型雜交后結(jié)果 水稻間期核水稻間期核 A為雜交前間期核；為雜交前間期核；B為雜交后結(jié)果為雜交后結(jié)果 白菜白菜 A為雜交前核型；為雜交前核型； B為同一核型雜交后結(jié)果為同一核型雜交后結(jié)果 芋頭間期核芋頭間期核 A為雜交前間期核；為雜交前間期核；B為雜交后結(jié)果為雜交后結(jié)果 荔枝 菜花西葫蘆黃瓜（津春四號(hào)）黃瓜（津優(yōu)一號(hào)）黃瓜（津優(yōu)一號(hào)）間期核黃瓜（津優(yōu)一號(hào)）間期核黃瓜（津優(yōu)一號(hào)）間期核黃瓜（津優(yōu)一號(hào)）間期核水稻核懸液涂片（水稻核懸液涂片（Giemsa染色）染色）PI染色示平行狀的染色示平行狀的DNA纖絲纖絲BAC1在水稻在水稻