血清球蛋白的提純

1、實驗實驗4 4血清血清- -球蛋白的提純球蛋白的提純purification of serum -globulin 遵義醫(yī)學院生物化學教研室遵義醫(yī)學院生物化學教研室 朱朱 欣欣 婷婷實驗實驗思路思路蛋白質的理化性質有哪些？蛋白質的理化性質有哪些？蛋白質的分離方法有哪些？蛋白質的分離方法有哪些？本次實驗利用了哪個性質？本次實驗利用了哪個性質？ 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質的基本原理及操作；的基本原理及操作；2.2.掌握離心機的操作；掌握離心機的操作；3

2、.3.熟悉蛋白質定性檢測的方法；熟悉蛋白質定性檢測的方法；分離蛋白質的方法分離蛋白質的方法分離方法分離方法沉淀法沉淀法鹽析法鹽析法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法層析法層析法電學法電學法電泳法電泳法等電聚焦等電聚焦超速離心法超速離心法離子交換層析離子交換層析吸附層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）凝膠過濾（分子篩）親和層析親和層析 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷定義：定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質的穩(wěn)定因素并加入大量中性鹽以破壞蛋白質的穩(wěn)定因素并 使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。 原理原理: : 破壞蛋白質兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層破壞蛋白質兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷

3、層中性鹽：中性鹽：(nh(nh4 4) )2 2soso4 4、nana2 2soso4 4、naclnacl等。等。優(yōu)點：優(yōu)點：蛋白質不變性，常用。蛋白質不變性，常用。 （一）鹽（一）鹽 析析 法法 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷【實驗原理【實驗原理】 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷（二）層析法（二）層析法待分離物質待分離物質( (流動相流動相) )經過一個固態(tài)物經過一個固態(tài)物質質( (固定相固定相) )時，根據溶液中待分離物質顆時，根據溶液中待分離物質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離蛋白組分在兩相中反復分配，并以不同流蛋白組

4、分在兩相中反復分配，并以不同流速流經固定相實現(xiàn)分離。速流經固定相實現(xiàn)分離。凝膠層析法凝膠層析法 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷定義：定義：（三）透（三）透 析析 法法 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷臨床應用：臨床應用：血液透析血液透析 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷（四）離心技術（四）離心技術 離心技術離心技術 是將含有微小顆粒的懸浮液置于離心是將含有微小顆粒的懸浮液置于離心轉子中，利用轉子繞軸旋轉產生的離心力將微小顆轉子中，利用轉子繞軸旋轉產生的離心力將微小顆粒按密度或質量的差異將其分離的方法。粒按密度或質量的差異將其分離的方法。沉降速度沉降速度(v) 指

5、在強大的離心力作用下，單位時間內指在強大的離心力作用下，單位時間內物質顆粒沿半徑方向運動的距離。物質顆粒沿半徑方向運動的距離。 v=6.09210-4d2（m）n2r/m d 顆粒直徑顆粒直徑 顆粒的密度顆粒的密度m 介質的密度介質的密度m 介質粘度介質粘度 r 旋轉半徑（物質質點所處位置與旋轉中心的距離）旋轉半徑（物質質點所處位置與旋轉中心的距離） n 轉子轉速轉子轉速 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷 離心操作要領離心操作要領1 1、根據待離心的溶液性質及體積選擇合適的離心管。裝、根據待離心的溶液性質及體積選擇合適的離心管。裝載液體時要按各種離心機操作說明進行。無蓋離心管載液體時

6、要按各種離心機操作說明進行。無蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以免離心管變形免離心管變形。 2 2、精確地平衡離心管及其內容物。、精確地平衡離心管及其內容物。3 3、平衡后的離心管和內容物（包括套筒）應對稱放置、平衡后的離心管和內容物（包括套筒）應對稱放置4 4、啟動離心時離心速度由慢到快，當?shù)竭_離心時間時，、啟動離心時離心速度由慢到快，當?shù)竭_離心時間時， 開啟減速或速度調節(jié)旋鈕減速。開啟減速或速度調節(jié)旋鈕減速。 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷檢測蛋白質檢測蛋白質 雙二縮脲

7、試劑：溶液顯紫紅色雙二縮脲試劑：溶液顯紫紅色 2020磺柳酸磺柳酸 ：有白色沉淀產生：有白色沉淀產生檢測檢測nhnh4 4+ + 納氏試劑：黃色或棕色納氏試劑：黃色或棕色五、檢測蛋白質、五、檢測蛋白質、 nhnh4 4+ +的方法的方法1. 1. 鹽鹽 析析2.2. 透透 析析3.3. 脫脫 鹽鹽4. 4. 檢檢 測測 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.鹽析鹽析取離心管一支加入血清取離心管一支加入血清2ml加入加入2ml pbs搖勻搖勻逐滴加入逐滴加入ph7.2飽和飽和(nh4)2so4 2ml,搖勻搖勻上清液（主要含清蛋白）上清液（

8、主要含清蛋白）傾入試管中傾入試管中靜止靜止10分鐘，再離心（分鐘，再離心（2000轉轉/分）分）10分鐘分鐘沉淀用沉淀用1ml pbs攪拌溶解攪拌溶解逐滴加飽和逐滴加飽和(nh4)2so4 0.5ml,搖勻搖勻靜止靜止10分鐘，再離心分鐘，再離心（2000轉轉/分）分）10分鐘分鐘傾棄上清液（主要含傾棄上清液（主要含、球蛋白）球蛋白）沉淀即為初步純沉淀即為初步純化的化的球蛋白球蛋白透透 析析脫脫 鹽鹽 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷2.2.透透 析析清蛋白清蛋白 換換 水水透析袋剛放入水中時透析袋剛放入水中時,立即取袋外液體檢查有無立即取袋外液體檢查有無nh4；每隔每隔4分鐘檢查一

9、次，分鐘檢查一次，共共3次，比較次，比較nh4透出的透出的情況。情況。 約約0.5小時，檢查袋外液體的小時，檢查袋外液體的nh4；取袋外液取袋外液2滴，置于小試管中，滴，置于小試管中，然后滴加然后滴加20磺柳磺柳 酸酸12滴，觀滴，觀察有無沉淀產生。察有無沉淀產生。 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷3.3.脫鹽脫鹽 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10上樣上樣球蛋白，球蛋白，pbs 10pbs 10滴溶解滴溶解 裝柱裝柱 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠g25，柱，柱 高高3/42/3柱長柱長流速：每分鐘流速：每分鐘10滴左右滴左右 加入洗脫劑加入洗脫劑pbs 10ml 收集收集20滴換一滴

10、換一支試管支試管. .層析后洗脫液檢測層析后洗脫液檢測n每組兩塊比色板每組兩塊比色板, ,洗凈備用。洗凈備用。n一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測nhnh4 4+ +）, ,另一塊滴加雙二縮脲另一塊滴加雙二縮脲試劑（檢測蛋白質）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應此孔顯色劑棄用。試劑（檢測蛋白質）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應此孔顯色劑棄用。n不用滴管不用滴管, ,避免污染避免污染, ,直接倒直接倒n用用“-”-”表示無現(xiàn)象，用表示無現(xiàn)象，用“+”, “+”, “+”+”, “+”, “+”等表示顏等表示顏色深淺色深淺 回收凝膠回收凝膠 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷表表1. 層析后洗脫液

11、的顯色結果層析后洗脫液的顯色結果表表2. 透析后的袋外溶液顯色結果透析后的袋外溶液顯色結果試管編號試管編號12345678910縮二脲試劑縮二脲試劑檢測后現(xiàn)象檢測后現(xiàn)象納氏試劑檢納氏試劑檢測后現(xiàn)象測后現(xiàn)象檢測次數(shù)檢測次數(shù)123456試試 劑劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑20%磺柳酸磺柳酸現(xiàn)現(xiàn) 象象棕色（棕色（+） 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷. .使用離心機的操作注意事項。使用離心機的操作注意事項。. .裝柱時檢查是否有尼龍布，是否漏水。裝柱時檢查是否有尼龍布，是否漏水。. .裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。裝柱后凝膠

12、均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。. .柱床面保持有緩沖液。柱床面保持有緩沖液。. .層析加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。層析加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。. .每用一次滴管，請用水清洗干凈，防止試劑及被測樣每用一次滴管，請用水清洗干凈，防止試劑及被測樣品交叉污染品交叉污染思思 考考 生物化學教研室生物化學教研室 朱欣婷朱欣婷1 1為何硫酸銨能沉淀蛋白質為何硫酸銨能沉淀蛋白質? ?第一次鹽析時硫酸銨的飽和度第一次鹽析時硫酸銨的飽和度是多少是多少? ?沉淀的是何種蛋白質，使沉淀溶解再次鹽析的目的是沉淀的是何種蛋白質，使沉淀溶解再次鹽析的目的是什么什么? ?2 2根據凝膠過濾原理解釋根據凝膠過濾原理解釋sephadexsephadex g g2525脫鹽的實驗結果。脫鹽的實驗結果。3 3用硫酸銨分段沉淀蛋白質時，透析袋外液體會出現(xiàn)蛋白質用硫酸銨分段沉淀蛋白質時，透析袋外液體會出現(xiàn)蛋白質嗎嗎? ?你能否做一個小實驗加以證實，并說明實驗原理。你能否做一個小實驗加以證實，并說明實驗原理。4. 4. 請用已學習的方法來證明本次實驗每次離心后所得的樣品請用已學習的方法來證明本次實驗每次離心后所得的樣品是血清蛋白中的哪種蛋白質？是血清蛋白中