內(nèi)蒙古高?？蒲许椖扛事短墙Y(jié)合凝集素基因多態(tài)性及血清表達(dá)與COPD患者急性加重的相關(guān)性研究申請書

1、附件2a表：內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目申 請 書項目類別（在相應(yīng)選項上劃）1、自然科學(xué)研究（ ）重點項目（ ）一般項目 （ ）自籌經(jīng)費項目 2、人文社會科學(xué)研究（ ）重點項目（ ）一般項目 （ ）自籌經(jīng)費項目學(xué) 科 門 類： 二級學(xué)科 課 題 名 稱：甘露糖結(jié)合凝集素基因多態(tài)性及血清 表達(dá)與copd患者急性加重的相關(guān)性研究項目負(fù)責(zé)人： 孫麗蓉 所 在 學(xué) 校：包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院申 請 日 期： 2014年8月14日 內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳科學(xué)技術(shù)處制2014年6月填表說明1學(xué)科門類按照國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局1992年公布的學(xué)科分類與代碼，填寫一級和二級學(xué)科。2申請書一律用a4紙雙面打印，

2、于左側(cè)裝訂，a表一式1份，b表一式5份。3本表各欄除特別規(guī)定外，均可以自行加行、加頁。4為填報內(nèi)容提供的證明材料，統(tǒng)一裝訂在申請書最后部分。項目負(fù)責(zé)人承諾我確認(rèn)本申請書及附件內(nèi)容真實、準(zhǔn)確。如果獲得資助，我將認(rèn)真履行項目負(fù)責(zé)人職責(zé)，積極組織開展研究工作，合理安排研究經(jīng)費，按時報送有關(guān)材料并接受檢查。若申請書及附件內(nèi)容失實或在項目執(zhí)行過程中違反科研項目管理的有關(guān)規(guī)定，本人將承擔(dān)全部責(zé)任。 負(fù)責(zé)人簽字：孫麗蓉 20 1 4 年 08 月 14 日項目依托學(xué)校承諾已經(jīng)按照項目申報要求對項目申請人的資格及項目申請書內(nèi)容進行了審核。項目如獲資助，我單位將根據(jù)教育廳要求和項目申請書內(nèi)容，落實項目研究所需配

3、套經(jīng)費及其他條件；按照科研項目管理有關(guān)規(guī)定，認(rèn)真履行項目承擔(dān)單位的管理職責(zé)。學(xué)校公章 20 年 月 日 申請者姓名孫麗蓉性別女出生年月1962.10.19職稱教授所在院系包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科職務(wù)科主任最后學(xué)歷碩士研究生最后學(xué)位碩士外語語種英語外語水平國家六級專業(yè)領(lǐng)域 copd通訊地址包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科郵政編碼014030辦公電動電目組其他成員情況（不包括項目負(fù)責(zé)人，最多不能超過9人）姓名職稱年齡所在單位專業(yè)項目分工簽名蘇日娜住院醫(yī)師28歲包醫(yī)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科項目實施張毅主治醫(yī)師34歲包醫(yī)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科統(tǒng)計數(shù)據(jù)馬顯

4、軍主治醫(yī)師31歲包醫(yī)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科收集資料高揚副主任醫(yī)師41歲包醫(yī)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科收集資料李水霞主治醫(yī)師35歲包醫(yī)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科收集資料 孔祥成住院醫(yī)師28歲包醫(yī)第二附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科整理資料 李冬梅副主任醫(yī)師45歲包醫(yī)第二附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科整理資料 申請者承擔(dān)省級以上項目及完成情況項目批準(zhǔn)單位項目名稱批準(zhǔn)時間是否完成內(nèi)蒙古科研項目il-1、il-6基因多態(tài)性與copd肺動脈高壓相關(guān)性研究2011是 申請者本人進三年來的主要研究成果：1、 enos基因多態(tài)性與copd肺動脈高壓相關(guān)性研究 中華結(jié)核和呼吸病雜志2、人防御素1基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病關(guān)系的研究 醫(yī)學(xué)研究雜志3、

5、il-1,il-6的基因多態(tài)性與copd肺動脈高壓的相關(guān)性研究 醫(yī)學(xué)研究雜志4、copd系統(tǒng)性炎癥與原發(fā)性高血壓的相關(guān)研究 5、copd大動脈彈性與血管內(nèi)皮功能的關(guān)系臨床肺科雜志6、copd系統(tǒng)性炎癥與大動脈彈性的相關(guān)性研究國際呼吸病雜志 2013年01月2013年12月 是項目計劃進度第一階段：查找資料，擬定題目（2014.1-2014.03）第二階段：采集標(biāo)本，訂購試劑及預(yù)實驗（2014.4-2014.06）第三階段: 預(yù)實驗（2014.07-2014.09）第四階段：實驗階段（2014.10-2015.09）第五階段：數(shù)據(jù)整理，實驗結(jié)果分析（2015.10-2015.12 ）項目成果形式

6、 慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病率及死亡率逐年上升，是一種具有氣流受限特征的疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性進展，與對有害氣體和有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。急性加重在copd患者的發(fā)病和死亡中起著關(guān)鍵作用，頻繁的感染引起copd反復(fù)急性發(fā)作，導(dǎo)致肺功能下降加速、合并癥的發(fā)生、住院，。以致致殘，導(dǎo)致生活質(zhì)量的降低因此，這種疾病帶來了巨大的經(jīng)濟及社會負(fù)擔(dān)。甘露糖結(jié)合外源凝集素（mbl）是凝集素途徑活化補體中的一種關(guān)鍵分子。其主要作用是在血漿作為一種模式識別受體，通過結(jié)合暴露在侵入細(xì)菌表面的甘露糖引發(fā)先天性免疫防御反應(yīng)。從而起到抵抗外界微生物感染的作用。copd其基因多態(tài)性會引起mbl生成下降。從而引起c

7、opd急性加重。 mbl缺乏的copd患者感染加重的頻率以及臨床預(yù)后的作用目前尚未完全明了，因此本研究旨在分析mbl基因多態(tài)性與copa急性加重的關(guān)系，為copd防治提供依據(jù)，進而起到減輕其經(jīng)濟及社會負(fù)擔(dān)。b表： 內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項目匿 名 評 審 書項目名稱甘露糖結(jié)合凝集素基因多態(tài)性及血清表達(dá)與copd患者急性加重的相關(guān)性研究起止時間2014.1-2015.12研究方向慢性阻塞性肺疾病一、本項目國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及趨勢，研究本課題的實際意義和理論意義（限1000字） 慢性阻塞性肺疾?。╟opd）的發(fā)病率及死亡率逐年上升，根據(jù)2002年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，copd位列世界上第四大主要死亡原因之

8、一。感染在copd患者的發(fā)病和死亡中起著關(guān)鍵作用，頻繁的感染引起copd反復(fù)急性發(fā)作，導(dǎo)致肺功能下降加速、增加住院以及死亡率。因此，這種疾病帶來了巨大的經(jīng)濟和社會負(fù)擔(dān)。因此需要了解copd患者的感染易感性，為copd防治提供依據(jù)，提高患者生活質(zhì)量，減輕其經(jīng)濟及社會負(fù)擔(dān)。 慢性阻塞性肺疾病，是一種具有氣流受限特征的疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性進展，與對有害氣體和有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。copd的發(fā)生及發(fā)展是環(huán)境、遺傳等多種因素共同參與的結(jié)果。比較確切的原因有感染、吸煙、職業(yè)性粉塵和有害氣體的長期吸入、過敏等。目前文獻闡述最為詳盡的copd遺傳因素是遺傳性a1-抗議蛋白酶缺乏癥。頻繁的感

9、染，引起copd反復(fù)急性發(fā)作，增加患者的住院及死亡率。本項研究將討論mbl基因多態(tài)性，甘露糖結(jié)合外源凝集素（mbl）是凝集素途徑活化補體中的一種關(guān)鍵分子。其主要作用是在血漿作為一種模式識別受體，通過結(jié)合暴露在侵入細(xì)菌表面的甘露糖激活補體系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)mbl2基因外顯子1區(qū)的第54位密碼子的多態(tài)性，由甘氨酸被天冬氨酸所替代所致，其基因多態(tài)性導(dǎo)致血清mbl水平下降。國外dahl m等研究發(fā)現(xiàn)缺乏mbl將增加copd、哮喘等疾病的易感性。研究發(fā)現(xiàn)mbl在黏液防御屏障中起著很重要的作用，并且出現(xiàn)在肺炎患者的支氣管肺泡灌洗液中。很多研究發(fā)現(xiàn)由mbl2基因第54位密碼子的多態(tài)性引起的mbl缺乏與copd患

10、者住院有著非常強的關(guān)聯(lián)，這種缺乏同樣也與反復(fù)呼吸道感染有關(guān)。yang ia等研究發(fā)現(xiàn)mbl缺乏會增加感染風(fēng)險。mbl2基因編碼區(qū)及啟動子區(qū)的核苷酸多態(tài)性會影響血漿mbl水平。mbl下降與兒童呼吸道感染頻率、肺部感染、成人中系統(tǒng)性紅斑狼瘡和侵入肺炎鏈球菌等疾病的發(fā)生有關(guān)。在囊性纖維化中mbl2下降會增加肺功能受損程度及死亡。mbl缺乏在copd患者感染加重的頻率以及臨床預(yù)后中的作用目前尚未完全明了，因此本前瞻性研究旨在評估它們關(guān)系，從而將研究結(jié)果服務(wù)于對copd的診治上面。關(guān)于此項研究目前國內(nèi)尚無相關(guān)性報道。2、 項目研究的內(nèi)容，預(yù)計突破哪些難題（限1000字） 1、研究內(nèi)容1）、研究對象：病例

11、組：選自包醫(yī)二附院呼吸科住院copd患者，年齡與性別不限，copd診斷符合2013年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會修定的copd診斷標(biāo)準(zhǔn)（使用支氣管舒張劑后fev1/fvc70%）。同時排除原發(fā)性高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤、肝腎功能異常。并根據(jù)慢性阻塞性肺疾病患者的癥狀、肺功能分級、急性加重的風(fēng)險來綜合評估。急性加重期需符合呼吸困難、咳嗽、咳痰、氣短喘息等癥狀短期內(nèi)明顯加重超過日常變異范圍，需要調(diào)整copd患者的治療方案。對照組：我院健康的體檢者，無copd病史，無心、肝、腎疾病史，體檢、常規(guī)化驗無異常。2） 研究方法： 根據(jù)急性加重次數(shù)分組：將本項研究中納入的copd患者分入2個組：一個組為（反復(fù)加

12、重者），入選2年內(nèi)感染加重發(fā)作的平均次數(shù)2次。 另外一個組為入選2年內(nèi)感染加重的平均次數(shù)2次的患者。 mbl基因多態(tài)性的檢測：每位受試對象均被抽取空腹靜脈血2ml，放入血常規(guī)中，edat抗凝，-20冰柜可長時間保存。用鹽析法提取白細(xì)胞中的基因組dna,以sds裂解白細(xì)胞,蛋白酶k消化蛋白和乙醇沉淀獲得基因組dna。利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(pcr-rflp）技術(shù)分析mbl2基因外顯子1區(qū)的第54位密碼子的多態(tài)性。mbl基因第54號密碼子存在ggc/gac的變異,表現(xiàn)為野生純合子a/a(ggc/ggc)、雜合子a/b(ggc/gac)、變異型純合子b/b(gac/gac)。pcr反

13、應(yīng)引物參考文獻設(shè)計。pcr反應(yīng)體系：10擴增緩沖液5ul；0.2mmdatp、dctp、dgtp、dttp 5ul；上游引物（5gtaggacagaggcatgctc-3）、下游引物（3-caggcagtttcctctggaagg-5）0.25um各2.0ul；耐熱dna聚合酶1.0u；dna模板1.0ul。擴增條件為94預(yù)變性3min，其后94預(yù)變性3min、55退火1min、72延伸1min，共35個循環(huán)，最后72延伸7min。酶切反應(yīng)體系：10內(nèi)切酶緩沖液2.0ul，pcr擴增產(chǎn)物8ul，加bani酶1.0ul，滅菌去離子水9.0ul總體積20.0ul混勻，37水浴6小時。酶切產(chǎn)物用2%

14、瓊脂糖凝膠電泳，在紫外投射儀中觀察記錄并拍照，分析并判斷基因型。 mbl濃度的測定：所有處于穩(wěn)定的copd病人及對照健康人均經(jīng)禁食及無吸氧10h后，于6:008: 00am肘前靜脈采集外周血標(biāo)本。血液經(jīng)4000r/min離心除去血細(xì)胞，所有血清標(biāo)本保存于-70c待測。采用mbl的elisa試劑盒采用固相酶聯(lián)免疫法檢測血清mbl的質(zhì)量濃度，在450nm紫外線燈下讀吸光值。2、預(yù)計突破難題：1）mbl-2基因多態(tài)性的檢測2）mbl濃度的測定3）mbl-2基因多態(tài)性與血清mbl濃度的關(guān)系4）mbl缺乏組的定義 5）嚴(yán)格執(zhí)行同一規(guī)范的診斷標(biāo)準(zhǔn)和入選排除標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格按實驗流程操作。3、 現(xiàn)有研究基礎(chǔ)，課題

15、組開展此項研究具備的條件（限500字）1. 申請者本人主持了 ，等科研工作，并在國家級、省級刊物發(fā)表論文十余篇，積累了豐富的臨床、科研經(jīng)驗。 2.課題組人員結(jié)合專業(yè)知識、通過反復(fù)查閱國內(nèi)外文獻資料，對本研究的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及趨勢，研究本課題的實際意義和理論意義有了較全面的認(rèn)識。 3.具備專業(yè)的分子生物實驗室。 4.已具備的實驗條件及資料：肺功能儀、微量移液器、pcr擴增儀、照相機、低溫冰箱、電熱恒溫水槽、酶標(biāo)儀、研究對象充足。四、研究思路、工作方案、技術(shù)路線（限600字）1、根據(jù)急性加重次數(shù)分組：將本項研究中納入的copd患者分入2個組：一個組為（反復(fù)加重者），入選2年內(nèi)感染加重發(fā)作的平均次數(shù)

16、2次。 另外一個組為入選2年內(nèi)感染加重的平均次數(shù)2次的患者。 2、mbl基因多態(tài)性的檢測：每位受試對象均被抽取空腹靜脈血2ml，放入血常規(guī)中，edat抗凝，-20冰柜可長時間保存。用鹽析法提取白細(xì)胞中的基因組dna,以sds裂解白細(xì)胞,蛋白酶k消化蛋白和乙醇沉淀獲得基因組dna。利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(pcr-rflp）技術(shù)分析mbl2基因外顯子1區(qū)的第54位密碼子的多態(tài)性。mbl基因第54號密碼子存在ggc/gac的變異,表現(xiàn)為野生純合子a/a(ggc/ggc)、雜合子a/b(ggc/gac)、變異型純合子b/b(gac/gac)。pcr反應(yīng)引物參考文獻設(shè)計。pcr反應(yīng)體系：

17、10擴增緩沖液5ul；0.2mmdatp、dctp、dgtp、dttp 5ul；上游引物（5gtaggacagaggcatgctc-3）、下游引物（3-caggcagtttcctctggaagg-5）0.25um各2.0ul；耐熱dna聚合酶1.0u；dna模板1.0ul。擴增條件為94預(yù)變性3min，其后94預(yù)變性3min、55退火1min、72延伸1min，共35個循環(huán)，最后72延伸7min。酶切反應(yīng)體系：10內(nèi)切酶緩沖液2.0ul，pcr擴增產(chǎn)物8ul，加bani酶1.0ul，滅菌去離子水9.0ul總體積20.0ul混勻，37水浴6小時。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外投射儀中觀察記錄并拍照，分析并判斷基因型。 3、mbl濃度的測定：所有處于穩(wěn)定的copd病人及對照健康人均經(jīng)禁食及無吸氧10h后，于6:008: 00am肘前靜脈采集外周血標(biāo)本。血液經(jīng)4000r/min離心除去血細(xì)胞，所有血清標(biāo)本保存于-70c待測。采用mbl的elisa試劑盒采用固相酶聯(lián)免疫法檢測血清mbl的質(zhì)量濃度，在450nm紫外線燈下讀吸光值。五、項目經(jīng)費預(yù)算（單位：萬元） 項目經(jīng)費總額5萬申請資助數(shù)額配套資金數(shù)額開支明細(xì)經(jīng)費備注設(shè)備購置費0分析