血紅蛋白的提取和分離”的實驗分析及教學(xué)組織

1、血紅蛋白的提取和分離”的實驗分析及教學(xué)組織人民教育出版社課程教材研究所吳成軍東北師范大學(xué)附屬中學(xué)趙偉濤“血紅蛋白的提取和分離”是人教版選修模塊生物技術(shù)實踐中的實驗內(nèi)容，其目的是使學(xué)生體驗從復(fù)雜細胞混合物體系中提取生物大分子的基本原理、過程和方法，該實驗雖然操作難度較大，但原理清晰，動手機會較多，因此，學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣很高。下面結(jié)合人教版教材對該實驗進行分析并提出相應(yīng)的教學(xué)建議。1.習(xí)得實驗原理和方法11 初步獲取血紅蛋白的原理和方法（樣品的處理和粗分離）實驗步驟實驗?zāi)康膶嶒炘聿僮鞣椒ńY(jié)果判斷洗滌紅細胞獲取較純凈的紅細胞通過離心將密度不同的物質(zhì)分離低速離心，去除上清液，反復(fù)加生理鹽水并離心直到上

2、清液未呈現(xiàn)黃色為止釋放血紅蛋白破裂紅細胞，釋放血紅蛋白低滲溶液中紅細胞破裂；甲苯溶解膜脂，加速細胞破裂（相似相溶原理）加蒸餾水，再加甲苯，磁力攪拌器充分攪拌無明顯現(xiàn)象分離血紅蛋白溶液初步得到血紅蛋白溶液通過離心將密度不同的物質(zhì)分離離心（較高速）試管溶液分為4層透析去掉液體中的小分子物質(zhì)小分子物質(zhì)容易透出透析袋透析（12小時）透析袋中物質(zhì)的顏色更紅12 分離純化蛋白質(zhì)的原理與方法凝膠色譜法（分子篩效應(yīng)）凝膠是一些由多糖類化合物構(gòu)成的多孔球體，當相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)直徑小于凝膠網(wǎng)孔，由于靜電吸附和擴散作用容易進入凝膠內(nèi)部的通道，可以自由地進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，

3、在向下移動的過程中，它們從凝膠顆粒的網(wǎng)孔擴散到凝膠顆粒間的孔隙，再進入另一凝膠顆粒的網(wǎng)孔，如此不斷地進出，使流程增長，而最后流出層析柱。而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著洗脫液流動，流程較短，因此首先流出層析柱。分子量介于二者之間的物質(zhì)，雖然能夠進入凝膠網(wǎng)孔，但比小分子難，因此進入凝膠網(wǎng)孔的幾率比小分子小，向下移動的速度比小分子快，而比大分子慢。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。需要注意的是，有部分小分子蛋白質(zhì)未進入凝膠內(nèi)部，而在外部移動，因此，如果需要得到純度更高的蛋白質(zhì)分子，可將色譜柱中的凝膠溶液進行平衡后進行再次冼脫和分離。13 鑒定

4、蛋白質(zhì)純度的原理與方法電泳蛋白質(zhì)分子的基本單位是氨基酸，氨基酸的一些基團在一定的pH下會發(fā)生水解或電離從而帶有電荷。但總的來說蛋白質(zhì)分子一般帶有負電。在電場的作用下，帶電的蛋白質(zhì)分子會向著電泳槽中的正極方向移動。由于樣品中各種蛋白質(zhì)分子凈電荷的量的差異以及蛋白質(zhì)分子本身的大小等因素，使蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生不同的遷移速率，從而將樣品中各種蛋白質(zhì)分子分離開。由于蛋白質(zhì)分子帶電電荷比較復(fù)雜，凈電荷總量與蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量不成正比，而蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量又是衡定的，電泳時在帶電量和分子質(zhì)量兩種因素的作用下會產(chǎn)生遷移速率的復(fù)雜化，不能正確地將分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子分離開，因此，實際操作中，一般會將蛋白質(zhì)分子與SD

5、S（十二烷基硫酸鈉）發(fā)生反應(yīng)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，由于SDS所帶負電荷的量大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因此掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異，使蛋白質(zhì)的遷移率完全取決于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的大小。在電場條件下，分子量大的蛋白質(zhì)遷移率慢，離前沿較遠，而分子量小的蛋白質(zhì)遷移快，離前沿較近。這樣，不同分子量大小的蛋白質(zhì)得到了分離。如果蛋白質(zhì)的純度高，遷移率一致，就會形成前沿整齊、清晰的條帶。2.正確定位教學(xué)目標以上原理和方法中，“初步獲取血紅蛋白的原理和方法”比較簡單，又有必修的基礎(chǔ)，因此學(xué)生容易理解；凝膠色譜法的原理容易理解，但操作復(fù)雜，難度較高，是學(xué)生學(xué)習(xí)的重點；電泳的原理和方法比較復(fù)雜，絕大多數(shù)學(xué)

6、校目前缺乏相應(yīng)的實驗設(shè)備，而且是用于鑒定分離后蛋白質(zhì)純度的后續(xù)實驗，因此可作為選學(xué)內(nèi)容?；谝陨戏治觯卮_定如下的教學(xué)目標、教學(xué)的重點和難點。21 教學(xué)目標（1）說出從血液中初步獲取血紅蛋白的原理和方法。（2）說明凝膠色譜法的原理和方法。（3）說出電泳的基本原理和方法。（4）進行樣品的預(yù)處理。（5）運用凝膠色譜法對血紅蛋白進行分離純化。 22 教學(xué)重點和難點教學(xué)重點：凝膠色譜法的原理和方法。教學(xué)難點：樣品的預(yù)處理；色譜柱的裝填；純化分離操作。3.實驗前準備31 幾種重要實驗試劑的配制及注意事項311 磷酸緩沖液（20mmol/L）的配制及注意事項配制步驟配制的溶液配制方法注意事項02 mol/

7、L的Na2HPO4溶液將7164 g 的Na2HPO412H20充分溶解于1000 mL的蒸餾水中在混合兩種溶液時，注意用酸度計或pH試紙檢測，并調(diào)節(jié)溶液的pH在70左右02mol/L的 NaH2PO4溶液將 3121 g 的NaH2PO42H20充分溶解于1000 mL的蒸餾水中充分溶解pH約為70的20mmol/L磷酸緩沖液取61 mL步驟中配制的Na2HPO4溶液與39 mL步驟中配制的NaH2PO4溶液混合312 丙烯酰胺和N, N-甲叉雙丙烯酰胺的配制及注意事項將29 g丙烯酰胺和1 g N, N-甲叉雙丙烯酰胺溶于總體積為70 mL的水中，攪拌過夜使之充分溶解。注意事項：丙烯酰胺和

8、雙丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收，因此，操作時需要戴上手套和防毒面具，而且在通風櫥內(nèi)或通風處進行。價格較低的這兩種藥物中含有一些金屬離子，為除去這些金屬離子，可以在丙烯酰胺溶液中加入大約02倍體積的單床混合樹脂，攪拌放置一夜后，再用Whatman 1號濾紙過濾就可以純化。儲存期間，由于光或堿的催化作用，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酸和雙丙烯酸，因此，應(yīng)將配制好的溶液置于棕色瓶中，置于4 保存，并且使用前應(yīng)檢查該溶液的pH，以確保pH不超過70。313 SDS的配制及注意事項將SDS用去離子水配制成10%的貯存液，于室溫保存。注意事項：市售的SDS化學(xué)純度不夠，需要重結(jié)晶后使

9、用。重結(jié)晶方法如下：稱取20 g SDS,放入500 mL圓底燒瓶中，加半勺活性炭及300 mL無水乙醇，攪拌，搖勻。燒瓶上接一個小冷凝管。在水浴上加熱至乙醇微沸，回流約10min，用熱過濾漏斗趁熱過濾。濾液應(yīng)透明無色。濾液冷卻至室溫后，移至-20 過夜。第二天，通過預(yù)冷的布氏漏斗抽濾，用少量-20 無水乙醇洗沉淀3次，盡量抽干，將結(jié)晶置真空干燥器中干燥或40 烘箱中烘干。32 凝膠色譜柱的制作和裝填321凝膠色譜柱的制作取長100cm，內(nèi)直徑16cm的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上

10、部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分離不徹底。322凝膠色譜柱的裝填計算并稱取一定量的交聯(lián)葡聚糖凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。將色譜柱裝置固定在支架上，將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，凝膠沉集后，將溶劑放出至膠面不再下降，并且通過23倍柱床體積的溶劑（20mmol/L的磷酸緩沖液，pH 70）使柱床穩(wěn)定。裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300 mL的20mmol/L的磷酸緩沖液（pH為70）充分洗滌平衡12h。注意事項：凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空

11、隙；裝填凝膠柱時不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果；液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動，從而影響生物大分子物質(zhì)的分離效果；注意不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。4.實驗操作步驟及注意事項本課題的主要目的是運用凝膠色譜法對蛋白質(zhì)進行分離純化，以下是實驗操作流程。樣品的處理：取家兔一只，為保證取血量，取其頸動脈血，按1:1加入抗凝劑肝素（1250U/ mL）或適宜濃度的檸檬酸鈉溶液（將6檸檬酸鈉溶于100 mL的生理鹽水中），若要過夜，溫度須控制在4 左右。在樣品處理的流程中，第一步用到低速離心，而第三步用到高速離心，這主要是因為

12、血液中除有紅細胞外，還有其他細胞及大量的物質(zhì)，紅細胞與這些物質(zhì)之間的密度存在較大的差異，用低速離心就能將他們分離開；而“分離血紅蛋白溶液”步驟中，溶液的主要成份的密度相對要接近些，因此需要用較高速的離心，才能將這些物質(zhì)初步分離。攪拌好的混合液離心后明顯分為4層（如右圖），由上至下依次是甲苯層、脂溶性物質(zhì)的沉淀層、血紅蛋白的水溶液、紅細胞破碎物沉淀。取其上清液，用濾紙過濾除去脂類，再使濾液在分液漏斗中靜置5min，出現(xiàn)分層，分離出下層的血紅蛋白溶液。粗分離：將血紅蛋白溶液裝入規(guī)格為7000D的透析袋，按1:300的比例放入20mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH為70），透析12h。透析的目的一是為

13、了除去小分子蛋白質(zhì)，二是使血紅蛋白處于緩沖液環(huán)境中，便于后續(xù)的磷酸緩沖液在凝膠柱中進行洗脫。純化：可采用柱型為Sephadex G75，柱體積為500 mL的色譜柱；加樣量為10 mL（約含蛋白200 m g）；用20mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH為70）進行洗脫，洗脫速度可控制為05 mL /min，即20 min /管。此時可用A280的紫外線進行檢測，如果測得的數(shù)值很高，說明蛋白含量過高，此時需要進行稀釋。下圖是將每管取05 mL稀釋10倍后，用紫外線測量的結(jié)果（如下圖）。由圖中數(shù)值可知，33-38管對應(yīng)的數(shù)值為血紅蛋白的吸收值，選擇此時的試管進行蛋白質(zhì)純度的鑒定是比較合適的。純度鑒定

14、：經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定，以下是實驗操作流程。脫色的目的是脫去背景顏色以體現(xiàn)出蛋白條帶。一般來說，條帶分明，目的條帶清晰，無擴散，前沿比較直，說明實驗結(jié)果比較好，樣品比較純，下面為兔血實驗的電泳結(jié)果圖。5.課時安排及實施建議本課題可安排45課時。教師可在實驗前配制好磷酸緩沖液，并購買或制作好凝膠色譜柱，以備實驗時使用。課時安排授課或?qū)嶒瀮?nèi)容補充說明第12課時講授凝膠色譜法和電泳的基本原理透析和平衡凝膠需要的時間較長，可由教師完成；電泳可由教師演示完成第3課時進行樣品的處理（洗滌、釋放、分離和透析）第4課時運用凝膠色譜法對血紅蛋白進行純化增加1課時通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對提取的蛋白質(zhì)進行純度鑒定由于大多數(shù)學(xué)校缺乏相應(yīng)的實驗設(shè)備，操作難度較高，因此，本實驗可由教師以講清實驗原理和演示操作為主，并配以相應(yīng)的實驗錄像進行教學(xué)。6.教學(xué)體會本課題的實驗操作相對復(fù)雜，影響實驗效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是凝膠色譜柱的制作和裝填，對實驗者的操作有很高的要求，建議有條件的學(xué)校直接購買商品色譜柱。由于甲苯是劇毒試劑,不太