超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展前景

1、超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展前景 生物分離工程課堂報(bào)告之 Speaker:黃妙珍 09生物技術(shù)三班 2011.11.3 色譜分離精度高，設(shè)備簡(jiǎn) 單，操作方便，根據(jù)各種 原理進(jìn)行分離的色譜法不 僅普遍應(yīng)用于物質(zhì)成分的 定量分析和檢測(cè)，而且廣 泛應(yīng)用于生物物質(zhì)的制備 分離和純化。是目前最好 的生物純化技術(shù)。 常見(jiàn)的分離方式 蒸餾蒸餾 離心 電泳電泳 過(guò)濾過(guò)濾 超濾超濾 色譜色譜 色譜分類(lèi) 4 2 3 1 色譜色譜 柱狀色譜柱狀色譜 薄層色譜薄層色譜 紙色譜紙色譜 色相色譜色相色譜 高效液相色譜高效液相色譜 超高效液相色譜超高效液相色譜 色譜典型的儀器配置 色譜泵及控制器色譜泵及控制器 數(shù)據(jù)處理及

2、控制數(shù)據(jù)處理及控制 進(jìn)樣器進(jìn)樣器 色譜柱色譜柱 檢測(cè)器檢測(cè)器 W ate rs 486 分離度 色譜條件的優(yōu)化 速度容量 開(kāi)發(fā)液相色譜方法 分辨率是色譜分離中主要考慮的因素 在開(kāi)發(fā)色譜方法時(shí)，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下幾個(gè)因素 都要考慮。 靈敏度 載樣量 分析速度 溶劑損耗 Click to add title in here 自自20世紀(jì)世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著高效液相色譜年代以來(lái)，隨著高效液相色譜 (High Performance Liquid Chromatography， HPLC)技術(shù)的不斷發(fā)展，美國(guó)技術(shù)的不斷發(fā)展，美國(guó)Waters公司于公司于2004 年的匹茲堡會(huì)議上

3、推出了最新研制的年的匹茲堡會(huì)議上推出了最新研制的ACQUITY超超 高效液相色譜高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)，其采用，其采用17 Ixm細(xì)細(xì) 粒徑的新型固定相，可獲得高達(dá)粒徑的新型固定相，可獲得高達(dá)2萬(wàn)塊萬(wàn)塊m理論塔理論塔 板數(shù)的超高柱效，并以系統(tǒng)整體設(shè)計(jì)的創(chuàng)新技術(shù)，板數(shù)的超高柱效，并以系統(tǒng)整體設(shè)計(jì)的創(chuàng)新技術(shù)， 全面提升了液相色譜的速度、靈敏度和分離度，全面提升了液相色譜的速度、靈敏度和分離度， 造就了液相色譜性能上的飛躍和進(jìn)步并形成分離造就了液相色譜性能上的飛躍和進(jìn)步并形成分離 科學(xué)的一個(gè)新興領(lǐng)域。科學(xué)的一個(gè)新興領(lǐng)域

4、。 超高效液相色譜 Click to add title in here 超高效液相色譜 （UPLC）的原理 UPLC的理論基礎(chǔ)為： 范德米特范德米特(Van Deemeter)方程方程 HETP=AdP+Bv+CdP2 HETP：理論塔板高度：理論塔板高度 A：渦流擴(kuò)散系數(shù)：渦流擴(kuò)散系數(shù) 由該方程可得出結(jié)論： 顆粒度越小柱效越高；每個(gè)顆粒度尺寸有自己的最佳柱 效的流速；更小的顆粒度使最高柱效點(diǎn)向更高流速(線速度)方 向移動(dòng)，而且有更寬的線速度范圍所以降低顆粒度不但提高柱 效，同時(shí)也提高速度。 dlP：填料粒徑：填料粒徑 B：分子徑向擴(kuò)散系數(shù)：分子徑向擴(kuò)散系數(shù) C：傳質(zhì)因子為流動(dòng)相線速度：傳質(zhì)

5、因子為流動(dòng)相線速度 van Deemter曲線的提示 Click to add title in here Click to add title in here 如果填料的顆粒繼續(xù)演變?nèi)绻盍系念w粒繼續(xù)演變 未來(lái)的色譜:更小的顆粒度 液相色譜30年的發(fā)展史是顆粒技術(shù)的發(fā)展史。顆粒度的改變直 接影響到柱效，從而對(duì)分離結(jié)果產(chǎn)品直接影響。由上圖可知：隨 著顆粒度的不斷降低，色譜分離度不斷提高。 小顆粒分離的理論與科學(xué)基礎(chǔ)小顆粒分離的理論與科學(xué)基礎(chǔ) 更小顆粒度所面臨的挑戰(zhàn) Click to add title in here 小顆粒帶來(lái)生產(chǎn)力 基于17 m小顆粒技術(shù)的UPLC與人們熟知的高效液相色譜(

6、HPLC)技術(shù)，具有相 同的分離原理。不同的是，UPLC不僅比HPLC具有更高的分離能力，而且結(jié)束了 人們多年不得不在速度和分離度之間取舍的歷史。使用UPLC可以在很寬的線速 度、流速和反壓下進(jìn)行高效的分離工作，并獲得優(yōu)異的結(jié)果 -UPLC的優(yōu)點(diǎn) 超高分離度 圖3: UPLCTM與HPLC：分離度比較 由右圖可見(jiàn)：由右圖可見(jiàn)：UPLCTMUPLCTM 可以大大提高分離度，可以大大提高分離度， 同時(shí)色譜峰強(qiáng)度也得到同時(shí)色譜峰強(qiáng)度也得到 了提高。了提高。 小顆粒帶來(lái)生產(chǎn)力 -UPLC的優(yōu)點(diǎn) 超高速度 圖4: UPLC與HPLC：速度比較 圖5：UPLC美國(guó)藥典有關(guān)物質(zhì)分析實(shí)例 原有原有HPLCHP

7、LC分析需要分析需要4 4個(gè)不同的方法、個(gè)不同的方法、 三根不同的色譜柱，至少需要三根不同的色譜柱，至少需要6565分分 鐘才能完成；鐘才能完成；UPLCUPLC使用了一根色譜使用了一根色譜 柱、一種簡(jiǎn)單方法，在柱、一種簡(jiǎn)單方法，在1 1分鐘內(nèi)即可分鐘內(nèi)即可 完成。完成。 小顆粒帶來(lái)生產(chǎn)力 -UPLC的優(yōu)點(diǎn) 超高靈敏度速度 圖6: HPLC到UPLCTM：靈敏度的改善無(wú)需折衷 UPLCTM使用小顆 粒技術(shù)可以得到更 高的柱效（因而改 善了分離度）、更 窄的色譜峰寬，即 更高的靈敏度。 UPLC儀器構(gòu)造 UPLC儀器構(gòu)造 Click to add title in here UPLC儀器模式圖

8、UPLC數(shù)據(jù)采集軟件 Empower軟件軟件 MassLynx 為高性能質(zhì)譜應(yīng)用 程序，用于采集、分析、管理 和分布 UV 及質(zhì)譜數(shù)據(jù)。它提 供 了智能儀器控制，可以采集額 定質(zhì)譜、完全質(zhì)譜、MS/MS 和完全質(zhì)譜 MS/MS 數(shù)據(jù)。 MassLynx軟件軟件 Empower 具有基于圖標(biāo)和圖形的用 戶界面，可用于采集、處理、管理、 報(bào)告和存儲(chǔ)色譜數(shù) 據(jù)。 UPLC的樣品瓶和樣品板 與UPLC匹配 的色譜柱比較少 峰面積的重復(fù)性欠佳 對(duì)高頻檢測(cè)儀器的需要 超高效液相色譜的局限性 盡管UPLC能顯著減少?gòu)?fù)雜樣品的分析分離時(shí)間，提高檢測(cè)的靈敏度和分離度，但 目前UPLC的使用仍然存在局限性，其普及

9、應(yīng)用可能仍然需要一些時(shí)間。 色譜柱要能夠耐受由于粒徑減小而帶來(lái)的高 反壓，而且粒徑的減小也給色譜柱充填技術(shù) 帶來(lái)了挑戰(zhàn)。 UPLC分析樣品時(shí)峰面積的重復(fù)性略遜 于HPLC，特別是低濃度樣品時(shí)更加明 顯，其峰面積重復(fù)性的RSD約為HPLC 的2倍。 UPLC分離樣品色譜峰擴(kuò)展很小，通常峰底寬 度只有幾秒鐘，低濃度的樣品峰則更窄。 OConnor等 發(fā)現(xiàn)，使用UPLC測(cè)定低濃度 樣品時(shí)，準(zhǔn)確度、精密度都比較差。 Click to add title in here 超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀 1.食品安全領(lǐng)域 1.1農(nóng)藥殘留物檢測(cè)領(lǐng)域 1.2食品添加劑分析檢測(cè)中的應(yīng)用 農(nóng)藥殘留分析屬于微量至超微量分

10、析范疇，要求檢測(cè)儀器有非常 高的靈敏度；同時(shí)，由于其具有種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)，對(duì) 檢測(cè)方法的通量和速度也提出了更高的要求。在農(nóng)殘分析檢測(cè)中， UPLC與傳統(tǒng)的HPLC 相比較，不僅在分離度、靈敏度和分析速 度上得到較大提高，而且很大程度上減少了樣品和試劑的消耗量， 具有很好的應(yīng)用前景。 隨著食品品種和添加劑種類(lèi)的增加、多種添加劑的復(fù)配使用，迫 切需要建立多種添加劑同時(shí)快速檢測(cè)的方法。目前，HPLC 技術(shù) 是食品添加劑檢測(cè)的最常用方法；而較這一傳統(tǒng)方法而言，在技 術(shù)性能上擁有優(yōu)勢(shì)的UPLC 得到了更突出的應(yīng)用。 超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀 2.藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域 2.1化學(xué)藥品分析 2.2中藥藥品分

11、析 在針對(duì)藥物合成的分析方面，UPLC可實(shí)現(xiàn)隨時(shí)快速準(zhǔn)確檢測(cè)合成過(guò) 程中的中間體、副產(chǎn)物或降解產(chǎn)物等。 Waters公司合成了17 pm顆粒度的Acquity UPLC填料，減少了固 定相表面殘余硅羥基，因而在分析生物堿類(lèi)樣品時(shí)，流動(dòng)相中只加入酸 抑制劑，不需添加有機(jī)胺即可使其獲得良好的分離。由于在流動(dòng)相中避 免了有機(jī)胺及鹽的加入，可以在一定程度上降低質(zhì)譜噪音、減少對(duì)質(zhì)譜 的污染，且使用的流速適合與質(zhì)譜直接聯(lián)用，無(wú)需分流，可以進(jìn)一步提 高檢測(cè)靈敏度，為中藥分析提供良好的平臺(tái)。 超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀 3.其他領(lǐng)域 農(nóng)藥殘留物檢測(cè) 水質(zhì)和環(huán)境監(jiān)測(cè) 化妝品質(zhì)量控制 . 超高效液相色譜與其他技術(shù)的

12、交叉應(yīng)用 merit 超高效液相色譜和高效液相色譜聯(lián)合 固相萃取一超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法 氣相萃取一超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法 王文昭、李鵬等8基于超高效液相色譜和高效液相色譜的偏最小二乘 判別分析法建立了一種新型的區(qū)別診斷乳腺增生和乳腺癌患者的快速臨 床方法。 超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLCMS-MS)9具有更加簡(jiǎn)便、快 速、靈敏的特點(diǎn)，特異性好、能夠排除基質(zhì)干擾，定量限更低、定性 更準(zhǔn)確，是分析組織中氯羥吡啶殘留的理想方法。 陳躍 應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UPLCMSMS)技 術(shù)，建立了高靈敏、快速的同時(shí)檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中8種種衣劑農(nóng)藥 殘留量的方法。 超高效液相色譜儀的制造

13、在世界領(lǐng)域的UPLC研發(fā)生產(chǎn)中，Waters作為專(zhuān)業(yè)液相色譜的廠商，是業(yè)界 唯一同時(shí)擁有液相色譜所有組件技術(shù)包括液相色譜儀器硬件、填料技術(shù)和軟 件技術(shù)的供應(yīng)商，擁有液相色譜技術(shù)最強(qiáng)大的科研和生產(chǎn)機(jī)構(gòu)。 從六十年代首推世界上第一臺(tái)液相色譜(LC)系統(tǒng)，到七十年代高效液相色 譜(HPLC)技術(shù)的商品化，直至2004年超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)的推出， Waters是色譜技術(shù)公認(rèn)的領(lǐng)導(dǎo)者11。 Waters世界世界專(zhuān)業(yè)液相色譜的廠商 超高效液相色譜的發(fā)展前景 UPLC是一種較為新穎的技術(shù)手段，與傳統(tǒng)分析方法相比具有多 方面的優(yōu)勢(shì)。 UPLC可以更快的速度和更高的質(zhì)量完成以往HPLC的工作，沃 特世將致力于豐富已有的UPLC產(chǎn)品，現(xiàn)已推出了六種新的色 譜柱，包括:BEH C18、C8、苯基和ShieldRP18、 HILIC 及 HSS T3。同時(shí)還