動(dòng)物細(xì)胞工程復(fù)習(xí)重點(diǎn)

1、動(dòng)物細(xì)胞工程復(fù)習(xí)重點(diǎn)簡述卵母細(xì)胞成熟的過程：嬰兒時(shí)期：卵原細(xì)胞（位于原始卵泡內(nèi)）經(jīng)有絲分裂形成更多的卵原細(xì)胞。后者經(jīng)染色體復(fù)制，形成初級(jí)卵母細(xì)胞（初級(jí)卵泡內(nèi)），進(jìn)而進(jìn)行第一次減數(shù)分裂（簡稱減I期），并停留在減I期的前期的雙線期。核成熟期：隨著機(jī)體的生長發(fā)育，體內(nèi)營養(yǎng)、激素水平，特別是激素水平的上升，原來停滯在減I期的初級(jí)卵母細(xì)胞恢復(fù)分裂，初級(jí)卵泡也迅速增大，逐漸變?yōu)榕怕亚暗拇渭?jí)卵泡。在體內(nèi)FSH、LH等激素的刺激下，初級(jí)卵母細(xì)胞徹底完成減I分裂，形成次級(jí)卵細(xì)胞和第一極體，并隨卵泡的破裂排出到輸卵管中。第二次減數(shù)分裂期：輸卵管中的次級(jí)卵母細(xì)胞一邊向輸卵管壺腹部進(jìn)發(fā)，一邊進(jìn)行第二次減數(shù)分裂（簡稱減

2、II期），并最終在壺腹部停留在減II期的中期。此時(shí)，卵母細(xì)胞若受精，則恢復(fù)減II分裂至徹底完成減II期，形成受精卵和第二極體，此時(shí)卵巢排卵破裂處的黃體持續(xù)存在（妊娠黃體），并大量分泌孕激素支持受精卵的發(fā)育和著床；若卵母細(xì)胞不受精，則暫停在減II期的卵母細(xì)胞則凋亡，此時(shí)卵巢上的黃體萎縮為白體直至逐漸消退，等待受體內(nèi)激素水平調(diào)控的下一輪排卵周期的開始。簡述成熟卵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與各組分作用：放射冠：由卵丘顆粒細(xì)胞組成的層疊狀結(jié)構(gòu)，一是起保護(hù)作用，形成卵母細(xì)胞的外圍結(jié)構(gòu)；二是其分泌的一些蛋白質(zhì)因子等，可通過細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)輸送到卵母細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)卵泡的發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟。透明帶（ZP）：一是對(duì)卵母細(xì)

3、胞起到賦予彈性的保護(hù)結(jié)構(gòu)；二是在受精過程中參與對(duì)精子的識(shí)別（ZP3）和結(jié)合（ZP2），誘發(fā)頂體反應(yīng)；三是通過透明帶反應(yīng)在防止多精受精過程中起重要作用。細(xì)胞膜：一是起卵母細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)、信息、能量交換的媒介作用；二是通過卵黃膜反應(yīng)在防止多精受精過程中起作用。細(xì)胞質(zhì)：主要是指皮質(zhì)顆粒，皮質(zhì)顆粒在精子進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)部激活卵母細(xì)胞的過程中，迅速與卵黃膜融合，發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)卵黃膜反應(yīng)和透明帶反應(yīng)，阻止多精受精。其他成分主要是大量mRNA及蛋白質(zhì)，在受精后激活受精卵的發(fā)育和分裂中起到重要作用。簡述精子發(fā)生的基本過程：精原干細(xì)胞先分化成精原細(xì)胞，后者經(jīng)有絲分裂形成更多精原細(xì)胞，精原細(xì)胞經(jīng)染色體復(fù)制形

4、成初級(jí)精母細(xì)胞，后者經(jīng)過減I期，形成兩個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞，每個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞再經(jīng)減II期，形成四個(gè)精子細(xì)胞，后者再經(jīng)變態(tài)反應(yīng)，形成4個(gè)精子。簡述精卵融合受精的主要過程：1穿入卵丘和放射冠。精子頭部質(zhì)膜上的透明質(zhì)酸酶可水解卵丘顆粒細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)，使得卵丘細(xì)胞松散，精子在尾部擺動(dòng)的作用下穿透卵丘，到達(dá)透明帶。2識(shí)別與結(jié)合卵母細(xì)胞：精子質(zhì)膜上ZP3受體與卵母細(xì)胞ZP上的ZP3結(jié)合，在精子尾部供能下，粘附于卵子，同時(shí)誘發(fā)頂體反應(yīng)。隨后，精子質(zhì)膜上的ZP2受體與卵子ZP2結(jié)合，使精子緊密結(jié)合于卵子上。3頂體反應(yīng)：精子頂體釋放的酶溶解透明帶等外圍結(jié)構(gòu)（頂體酶溶解透明帶，透明質(zhì)酸酶松解卵丘，酸性蛋白酶溶解放射

5、冠，芳香基硫酸酯酶溶解卵黃膜等）。4穿越ZP和卵黃膜：頂體反應(yīng)釋放的酶的酶解及精子尾部的機(jī)械運(yùn)動(dòng)，使得精子最終進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)部。5精卵融合：精子進(jìn)入卵質(zhì)后，除染色質(zhì)結(jié)構(gòu)外，其他結(jié)構(gòu)降解，隨后染色質(zhì)解凝集，DNA重新與組蛋白結(jié)合，并逐漸形成雄原核。6卵子激活：隨著精子的入卵，卵母細(xì)胞恢復(fù)減II分裂，激活卵母細(xì)胞的分裂及其他反應(yīng)，其中以皮質(zhì)反應(yīng)所引發(fā)的透明帶反應(yīng)及卵黃膜反應(yīng)，在防止多精受精過程中起重要作用。7原核的形成：卵子激活后的結(jié)果之一便是徹底完成減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞細(xì)胞核逐漸形成雌原核，然后雌雄原核行DNA復(fù)制并相互靠近并發(fā)生膜融合，至此受精結(jié)束。簡述縮短細(xì)胞一代時(shí)間里的潛伏期的常用方法：增大

6、細(xì)胞密度；選擇合適的培養(yǎng)對(duì)象（幼小動(dòng)物、傳代細(xì)胞、胚胎細(xì)胞）；創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、血清濃度、合適的瓶壁底物）；培養(yǎng)基中額外添加促粘附物質(zhì)（纖粘連蛋白）什么是BSS？有何作用？在實(shí)驗(yàn)室操作中BSS主要用于那些操作？BSS是指平衡鹽溶液；生理作用為細(xì)胞提供生理性滲透壓和pH值的生長、生活環(huán)境；常用于洗滌組織、細(xì)胞及配制胰酶及培養(yǎng)基時(shí)作為溶劑。什么是完全培養(yǎng)基？其中血清的主要作用是什么？血清使用之前為什么要進(jìn)行滅活處理？如何進(jìn)行？完全培養(yǎng)基=合成培養(yǎng)基血清（10-20%）雙抗；血清主要作用是促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的生長、貼壁、分裂；主要為滅火補(bǔ)體，方法為5630min水浴。胰酶在原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)中的

7、消化對(duì)象和消化方法分別是什么？原代培養(yǎng)的消化對(duì)象為活體組織塊，方法一般為胰酶37攝氏度消化30min（視消化對(duì)象有所不同，但總的時(shí)間比較長），每隔5min搖勻一次；傳代消化對(duì)象為貼壁細(xì)胞，方法為室溫或37消化2-3min，直至鏡下由細(xì)胞變圓或瓶壁上出現(xiàn)空洞為止。細(xì)胞培養(yǎng)之前為什么要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)？細(xì)胞常用培養(yǎng)密度大約是多少？為了保持合理的細(xì)胞密度，密度太高需頻繁換液容易污染，且有貼不了壁的細(xì)胞會(huì)死亡，密度太低，細(xì)胞分泌的相互促進(jìn)生長的生長因子閾值不夠，細(xì)胞生長不好。常用密度為10的5-6次方個(gè)/ml。什么是干細(xì)胞？如何分類？干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞,能產(chǎn)生表型和基因型與自己完全相

8、同的子細(xì)胞，并具有不同分化潛能。分類：胚胎/成體干細(xì)胞；全能/多能/單能干細(xì)胞；神經(jīng)/骨髓造血/肝/干細(xì)胞。干細(xì)胞有什么生物學(xué)特性？增殖與分化特征：永生化且能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)；有穩(wěn)定的發(fā)育潛能，能被誘導(dǎo)增殖或分化；能參與胎兒所有組織的發(fā)育過程； 形態(tài)特征：體積小、核大，核仁明顯；胚胎干細(xì)胞克隆緊密堆積，細(xì)胞之間無明顯的界限，細(xì)胞克隆有一定形狀規(guī)律。生化特征：具有堿性磷酸酶和端粒酶活性；表達(dá)SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等表面標(biāo)志；表達(dá)OCT-4蛋白； 簡述來源于ICM的胚胎干細(xì)胞分離方法直接分離法：囊胚于飼養(yǎng)層上自行發(fā)育成孵化囊胚，待ICM擴(kuò)大增殖時(shí)挑取?；蚴褂面?/p>

9、霉蛋白酶處理ZP，獲得裸胚培養(yǎng)。免疫分離法：鏈霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡ZP，依次轉(zhuǎn)移至補(bǔ)體滅活和未滅活的抗血清中，去除滋胚層細(xì)胞后，吸取ICM，移至飼養(yǎng)層培養(yǎng)。PEG是目前最常用的細(xì)胞融合方法，請以小鼠骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞的融合為例，簡述實(shí)驗(yàn)步驟。108小鼠脾細(xì)胞與107骨髓瘤細(xì)胞混合，離心（1000rpm，10min），棄上清。輕扣管底，混勻細(xì)胞， 37水浴。60s內(nèi)滴加0.6ml 50PEG，邊滴邊搖動(dòng)試管，30s內(nèi)將細(xì)胞懸液吸入吸管靜置30s，再在30s內(nèi)緩慢轉(zhuǎn)入離心管；5min內(nèi)后加入10mlDMEM終止PEG作用。離心，棄上清，加15mL HAT培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)入96孔板（預(yù)先有H

10、AT培養(yǎng)基培養(yǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞），每孔100 ul。37孵箱孵育，2-3天換 HAT一次，持續(xù)2周。陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆培養(yǎng)過程中往往需要制作飼養(yǎng)層細(xì)胞，最常用的飼養(yǎng)細(xì)胞是什么？其飼養(yǎng)原理是什么？飼養(yǎng)原理：提高培養(yǎng)細(xì)胞的密度，使待克隆細(xì)胞容易生存與繁殖。腹腔細(xì)胞能清除培養(yǎng)中的死亡細(xì)胞，從而促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞克隆的生長。飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放諸如細(xì)胞生長因子類物質(zhì)，起到促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖的作用。常用細(xì)胞：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞作為融合的親本細(xì)胞之一時(shí)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞有哪兩個(gè)最基本的要求？HGPRT酶和TK酶基因不表達(dá)；自身不合成抗體，也不干擾雜交瘤細(xì)胞合成抗體。ESC培養(yǎng)時(shí)常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有哪些？其作用是是

11、什么？鼠胚成纖維細(xì)胞最為常用（如STO細(xì)胞株）；飼養(yǎng)原理：提供促進(jìn)ESC生長、分裂的生長因子；提供抑制ESC分化的生長因子。比較雌激素與孕激素生理作用的對(duì)抗點(diǎn)：對(duì)卵巢，雌激素主要起活躍卵巢功能，孕激素則強(qiáng)烈抑制卵巢的活動(dòng)。對(duì)子宮，雌激素主要促進(jìn)子宮平滑肌收縮等功能，孕激素則起抑制收縮，分泌子宮乳等促進(jìn)安胎的作用。對(duì)乳腺，兩者均能促進(jìn)乳腺腺泡發(fā)育。簡述試管動(dòng)物技術(shù)的一般技術(shù)流程：卵母細(xì)胞的采集與體外培養(yǎng)；精子的采集與體外獲能處理；受精液微滴中精卵細(xì)胞的融合；受精卵胚胎的體外培養(yǎng)；移植受體，妊娠產(chǎn)犢。 動(dòng)物細(xì)胞工程：以動(dòng)物細(xì)胞或其組成成分為研究對(duì)象，以細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生殖生物學(xué)和分子生物學(xué)

12、的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合工程學(xué)原理和技術(shù)，對(duì)細(xì)胞或其組分進(jìn)行操作、加工或改造，使其按照規(guī)定目的發(fā)生結(jié)構(gòu)或功能等生物學(xué)特性的改變，獲得人類所需生物產(chǎn)品或創(chuàng)造新品種的學(xué)科。組織工程三要素(細(xì)胞、支架、信號(hào))研究內(nèi)容：動(dòng)物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞融合及雜交瘤技術(shù)、動(dòng)物染色體工程、動(dòng)物干細(xì)胞工程、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及生物反應(yīng)器、動(dòng)物胚胎工程、嵌合體技術(shù)、動(dòng)物克隆技術(shù)。精子發(fā)生場所：睪丸；精子發(fā)生時(shí)間：初情期生殖機(jī)能衰老精子細(xì)胞變形中的主要變化：細(xì)胞核精子頭的主要部分；高爾基體頭部的頂體； 中心粒精子的頸部；線粒體線粒體鞘；細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)原生質(zhì)滴。原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出組織或細(xì)胞接種培養(yǎng)到第一次傳代的操作過程。傳代培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)增殖到一定密度時(shí)，將細(xì)胞重新懸浮，經(jīng)稀釋后接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的過程稱為傳代培養(yǎng)。細(xì)胞系：初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。細(xì)胞株：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)細(xì)胞稱為細(xì)胞株。接觸抑制：貼壁細(xì)胞在瓶壁上相互接觸后，生長和分裂行為受到抑制的現(xiàn)象。匯合：貼壁細(xì)胞生長分裂后在細(xì)胞瓶壁上相互匯集在一起的狀態(tài)。下丘腦-垂體-性腺軸：機(jī)體內(nèi)外的刺激，通過感受器產(chǎn)生的神經(jīng)沖動(dòng)，傳到下丘腦，引起促性腺激素釋放激素（GnRH）分泌；釋放激素經(jīng)下丘腦的門靜脈系統(tǒng)運(yùn)至垂體前葉，導(dǎo)致促性腺激素釋放（FSH、LH等），