教學(xué)大腸菌群檢測(cè)

1、食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)（GB 4789.3-2010 ） 大腸菌群的定義大腸菌群的定義 o 大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需 氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。 o 大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，而是根據(jù) 衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出的與糞便污染有關(guān)的 細(xì)菌，即作為食品、水體等是否受過(guò)人畜糞便 污染的指示菌，根據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，可將 這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿 菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰 溝腸桿菌等。 大腸桿菌的定義大腸桿菌的定義 o 大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿 菌科，歸屬于埃希氏菌屬。 o 與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌， 包

2、括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致 病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌 （EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏 附性大腸桿菌（EAEC）。 衛(wèi)生學(xué)意義 o 大腸菌群和大腸桿菌是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指 標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。 o 食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染， 既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通 過(guò)污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌 群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映 了對(duì)人體健康危害性的大小。 o 1 范圍 o 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群（Coliforms） 計(jì)數(shù)的方法。 o 本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。 o 2 術(shù)語(yǔ)和定義 o 2.

3、1 大腸菌群 :在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳 糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性 無(wú)芽胞桿菌。 o 3 設(shè)備和材料 o 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其 他設(shè)備和材料如下： o 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 。 o 冰箱：2 5 。 o 恒溫水浴箱：46 1 。 o 電子天平：感量 0.1 g。 o 均質(zhì)器、振蕩器、接種環(huán) o 無(wú)菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器 及吸頭。 o 無(wú)菌錐形瓶：容量 500 mL。 o 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm。 o 杜氏小管 o pH 計(jì)或 pH 比色管或精密 pH 試紙。 o 菌落計(jì)數(shù)器。 o 4

4、 培養(yǎng)基和試劑 o 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽 （Brilliant Green Lactose Bile，BGLB） 肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（Violet Red Bile Agar，VRBA） o 磷酸鹽緩沖液、9毫升無(wú)菌生理鹽水、 o 無(wú)菌 1 mol/L NaOH、無(wú)菌 1 mol/L HCl 第一法 大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)法 o 操作步驟 o 7.1 樣品的稀釋 o 7.1.1 固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放 入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的 無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi) ,8000r/min10000r/min

5、 均質(zhì)1min2min,或放入盛有225mL磷酸 鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中,用拍 擊式均質(zhì)器拍打1min2min,制成1 10的 樣品勻液。 o 7.1.2 液體樣品:以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品 置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的 無(wú)菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃 珠)或其他無(wú)菌容器中充分振搖或置于機(jī)械 振蕩器中振搖,充分混勻,制成1 10的樣品 勻液。 o 7.1.5 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),按上述 操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。 每遞增稀釋1次,換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸 頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過(guò) 程不得超過(guò)15min。 o 7.1.3 樣品勻

6、液的pH 應(yīng)在6.57.5之間,必 要時(shí)分別用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl調(diào) 節(jié)。 o 7.1.4 用1mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1 10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中(注 意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖 試管或換用1支1mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打,使其 混合均勻,制成1 100的樣品勻液。 o 7.2 初發(fā)酵試驗(yàn) o 每個(gè)樣品,選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品 勻液(液體樣品可以選擇原液),每個(gè)稀釋度接 種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每 管接種1mL(如接種量超過(guò)1mL,則用雙料 LST肉湯),36 1 培養(yǎng)24h2

7、h,觀察 倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,24h2h產(chǎn)氣者進(jìn) 行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn)),如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培 養(yǎng)至48h2h,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未 產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。 o 7.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn)) o 用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng) 物1 環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管 中, 361培養(yǎng)48h2h,觀察產(chǎn)氣情況。 產(chǎn)氣者,計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。 o 7.4 大腸菌群最可能數(shù)(MPN)的報(bào)告 o 按7.3確證的大腸菌群BGLB陽(yáng)性管數(shù),檢索 MPN表(見(jiàn)附錄B),報(bào)告每g(mL)樣品中大腸 菌群的MPN值。 第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法 礦泉水中大腸菌群的測(cè)定 o 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

8、o 1、了解大腸菌群在食品檢驗(yàn)中的意義 o 2、掌握礦泉水中大腸菌群的檢驗(yàn)原理和測(cè) 定方法； o 3、熟練稀釋分離和無(wú)菌操作技術(shù) o 二、實(shí)驗(yàn)原理 o 大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣， 需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。 該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便 指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，并推斷食品是 否污染腸道致病菌。 o 食品中大腸菌群數(shù)是指以1毫升（或1克）檢 樣中大腸菌群最可能數(shù)（MPN）來(lái)表示。本 實(shí)驗(yàn)依據(jù)GB 4789.3-2010制定。 o 三、設(shè)備和材料 o 設(shè)備： o 恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴鍋、電子天平、 均質(zhì)器、振蕩器、無(wú)菌吸管、無(wú)菌錐形瓶、 無(wú)菌培養(yǎng)皿、菌落計(jì)

9、數(shù)器、PH試紙、接種 環(huán)、杜氏小管、試管等。 o 培養(yǎng)基和試劑： o 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠 乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、無(wú)菌生理鹽水、 NAOH和HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液。 o 四、操作步驟： o 1、液體樣品:以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品置 盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú) 菌錐形瓶中振搖,充分混勻,制成1 10的樣 品勻液。 o 2、樣品勻液的PH值應(yīng)在6.57.5之間，必 要時(shí)可用標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)PH值。 o 3、用1mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1 10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中(注 意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖 試

10、管或換用1支1mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打,使其 混合均勻,制成1 100的樣品勻液。 o 4、根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),按上述操作, 依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞 增稀釋1次,換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。 從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過(guò)程不 得超過(guò)15min。 o （二）初發(fā)酵試驗(yàn) o 每個(gè)樣品,選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品 勻液(液體樣品可以選擇原液),每個(gè)稀釋度接 種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每 管接種1mL，36 1 培養(yǎng)48h2h, 觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù) 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。 o （三）復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn) o 用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯

11、管中分別取培養(yǎng) 物1 環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管 中, 361培養(yǎng)48h2h,觀察產(chǎn)氣情況。 產(chǎn)氣者,計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。 o 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 o （一）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄： o 將初發(fā)酵結(jié)果、復(fù)發(fā)酵結(jié)果填入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表 格中； o （二）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告確 證的大腸菌群BGLB陽(yáng)性管數(shù),檢索 MPN表 (見(jiàn)附錄B),報(bào)告每g(mL)樣品中大腸菌群的 MPN值。 大腸菌群實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄 根據(jù)初發(fā)酵和復(fù)發(fā)酵產(chǎn)氣情況填寫(xiě)表格，產(chǎn)氣記為“+”； 不產(chǎn)氣記為“”，最后根據(jù)產(chǎn)氣管數(shù)對(duì)照MPN表格得出 最后的結(jié)論。 10版MPN表 03版MPN表 o 瓶(桶)裝飲用純凈水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB

12、17324-2003) o 細(xì)菌菌落總數(shù)cfu/ml： 20 o 大腸菌群MPN/100ml： 3 在實(shí)驗(yàn)中如何選擇合適的稀釋度？ MPN表 o 1、新國(guó)標(biāo)的MPN表的基準(zhǔn)問(wèn)題: o 新國(guó)標(biāo)的MPN表采用了3個(gè)稀釋度，分 別是十倍百倍千倍，加樣量是3管，每 管1毫升，意味著加入樣品的量為0.333克。 o 在樣品加入量為0.333克的情況下，使 用新國(guó)標(biāo)MPN表，得到MPN/克 的數(shù)值。 o2、 改 變 加 樣 量 的 問(wèn) 題。 o 在 實(shí) 際 操 作 中， 因 為 一 些 原 因 需 要 改 變 加 樣 量， 一 般 是 1 0 倍 增 加 或 者 降 低， 同 樣 使 用 本 表， 得 到

13、 的 數(shù) 值 需 要 做 1 0 倍 調(diào) 整。 o下 面 我 們 一 起 來(lái) 看 幾 個(gè) 例 子！ o 比如： o 加樣量為3.33克，這樣查表得到的數(shù)值，應(yīng) 該降低10倍。 o 如果其陽(yáng)性管為210，查表為15，這樣 的話，結(jié)果應(yīng)該為 MPN 1.5/克，或者M(jìn)PN 15/10克，或者M(jìn)PN 150/100克。 o 再比如： o 加樣量為0.0333克（這樣的情況是， 不使用十倍稀釋液，而使用百倍千倍萬(wàn) 倍稀釋液，各用三管，每管1毫升）。這樣 查表得到的數(shù)值，應(yīng)該增高10倍。 o 如果其陽(yáng)性管為210，查表為15， 這樣的話，結(jié)果應(yīng)該為 MPN 150/克，或者 MPN 1500/10克，或

14、者M(jìn)PN 15000/100 克。 o 3、關(guān)于和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)的問(wèn)題。 o 大家應(yīng)該注意到，這個(gè)問(wèn)題其實(shí)是一個(gè) 稀釋度的選擇問(wèn)題。另外，這個(gè)問(wèn)題也可以 回答是否可以直接換算的問(wèn)題。 o 比如：某產(chǎn)品要求MPN30 /100克。 o 在這種情況下，我們?nèi)绻褂眉訕恿?0.333，如果全部是陰性0-0-0，得到的結(jié) 果為3/克，或者是30/10克，或者是 300/100克。很明顯，在這種加樣量情況 下是不能做出是否符合結(jié)果的判定的。 o 這樣的話，就需要增加加樣量，變成加樣量 為3.33克，如果全部是陰性0-0-0，得到結(jié) 果為0.3/克，或者是3/10克，或者是 30/100克。這樣的結(jié)果才能符

15、合要求。 o 如果更精確的操作，應(yīng)該是加樣量為 33.3克。這樣如果全部是陰性0-0-0，得到 3/100克，結(jié)果為2-1-0，得到MPN 15/100克，也是合格產(chǎn)品。 小結(jié) o 從這個(gè)意義上講，稀釋度的選擇是根據(jù)產(chǎn)品 要求進(jìn)行的，理論上： o 如果要求得到每克產(chǎn)品菌群含量，加樣 量應(yīng)該是0.333克比較合適。 o 如果要求得到每10克產(chǎn)品菌群含量，加 樣量應(yīng)該是3.33克比較合適。 o 如果要求得到每100克產(chǎn)品菌群含量， 加樣量應(yīng)該是33.3克比較合適。 o 當(dāng)然，對(duì)于上面的產(chǎn)品要求MPN30 /100 克，采用加樣量為33.3克，會(huì)比較麻煩，大 家可以采用加樣量為3.33克，要求9管全

16、陰 性，這樣也可以說(shuō)的過(guò)去。 o o 但是，如果上面的產(chǎn)品要求MPN5 /100 克，這是一個(gè)極端的例子，如果采用加樣量 為3.33克，9管全陰性，也是得不到合適的 結(jié)果的，這樣的話就應(yīng)該采用加樣量為33.3 克的規(guī)范做法。 o 再舉兩個(gè)極端的例子： o 產(chǎn)品要求5/噸（當(dāng)然這是不可能的）， 那么如果你采用0.333克加樣量，然后進(jìn)行 換算，是沒(méi)有任何意義的，如果真要測(cè)定， 就需要采用333千克的加樣量。當(dāng)然，這種 情況是不會(huì)發(fā)生的。 o 產(chǎn)品要求1100/克，這也是沒(méi)有任何意義的， 還是沒(méi)有辦法來(lái)判斷產(chǎn)品是否合格。這里就 可以看做是要求1000/0.1克，或者 100/0.01克，或者是10/0.001克，