《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)食品中諾如病毒檢測(cè)》

1、食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)食品中諾如病毒檢測(cè)（DBS13/001-2014）編制說(shuō)明（一）標(biāo)準(zhǔn)起草的基本情況1、任務(wù)來(lái)源根據(jù)河北省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)制定、修訂項(xiàng)目委托協(xié)議書(shū)（2014年），河北省衛(wèi)計(jì)委食品安全標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測(cè)評(píng)估處委托河北省疾病預(yù)防控制中心制訂食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 食品中諾如病毒檢測(cè) （DBS13/001-2014）。b5E2RGbCAP2、起草單位本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北省疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)參與（協(xié)作）單位：秦皇島市疾病預(yù)防控制中心、邯鄲市疾病預(yù)防控制中心。3、起草人主要起草人有申志新、關(guān)文英、白雪、張淑紅、侯鳳伶、申玉學(xué)、韓艷青、王英豪、史 紅。4、起草過(guò)程簡(jiǎn)介（1）收集國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)

2、起草負(fù)責(zé)人組織起草人員收集國(guó)內(nèi)外諾如病毒檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)共 40余篇。plEanqFDPw（2） 召開(kāi)河北省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)專(zhuān)家論證會(huì)：省衛(wèi)計(jì)委于2014年7月，在北戴河組織部分省內(nèi)食品安全專(zhuān)家委員會(huì)委員對(duì)本項(xiàng)目建議書(shū)進(jìn)行了論證和研討。與會(huì)專(zhuān)家認(rèn)為本項(xiàng)目建議書(shū)思路清晰嚴(yán)謹(jǐn)，科學(xué)合理，計(jì)劃周密可行，具有可操作性，經(jīng)費(fèi)預(yù)算合理，并已按 專(zhuān)家意見(jiàn)進(jìn)行了修改，經(jīng)審查合格，同意實(shí)施。DXDiTa9E3d（3）制定初步檢測(cè)方法：在參閱國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，確定方法制定原則、主要內(nèi)容和方法驗(yàn)證，草擬實(shí)施方案。RTCrpUDGiT（4）樣品檢測(cè)：2014年6月-7月，省疾控中心和秦皇島市疾控中心對(duì)北戴

3、河區(qū)市售生食海產(chǎn)品進(jìn)行了諾如病毒檢測(cè)。共采集貝類(lèi)樣品100份，其中5份諾如病毒陽(yáng)性，檢出率為5%，為我省在食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中首次檢出諾如病毒，同時(shí)檢測(cè)包裝飲用水樣品50份，未檢出陽(yáng)性。5PCzVD7HxA（5）試驗(yàn)驗(yàn)證：根據(jù)項(xiàng)目制定方案，秦皇島市疾控中心和邯鄲市疾控中心對(duì)本方法進(jìn)1 / 5行驗(yàn)證試驗(yàn)，并出具正式的驗(yàn)證報(bào)告。jLBHrnAlLg(6) 起草標(biāo)準(zhǔn)文本：參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定和實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證試驗(yàn)情況，編制河 北省地方標(biāo)準(zhǔn) 食品中諾如病毒檢測(cè) (DBS13/001-2014 )標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明 XHAQX74J0X(7) 召開(kāi)研討會(huì)：2014年10月11日，省疾控中心在北戴河組織召開(kāi)

4、河北省地方標(biāo)準(zhǔn) 食品中諾如病毒檢測(cè)(DBS13/001-2014 )征求意見(jiàn)稿專(zhuān)家論證會(huì)，邀請(qǐng)國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心、省衛(wèi)生綜合執(zhí)法局和部分市疾控中心專(zhuān)家參會(huì)，對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全面審核，對(duì)需要進(jìn)一步修改、確認(rèn)和完善之處提出建議。LDAYtRyKfE(8) 完成標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿：標(biāo)準(zhǔn)起草人根據(jù)專(zhuān)家意見(jiàn)建議，進(jìn)一步查閱和分析參考文獻(xiàn)及修訂標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容，進(jìn)行修改完善，形成標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿。Zzz6ZB2Ltk(9) 專(zhuān)家審核：省衛(wèi)計(jì)委組織我省食品安全委員會(huì)有關(guān)專(zhuān)家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿進(jìn)行審核，提出修改意見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)起草人修改后形成標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批稿。公開(kāi)向社會(huì)征求意見(jiàn)。dvzfvkwMI1(10) 標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批：標(biāo)準(zhǔn)起草人對(duì)修改

5、意見(jiàn)進(jìn)行整理，進(jìn)一步完善標(biāo)準(zhǔn)。報(bào)省衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)、 發(fā)布、實(shí)施。(二) 標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容及主要制定情況1. 諾如病毒的定義參考楊大進(jìn)，李寧主編的2014年國(guó)家食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)中諾 如病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序關(guān)于諾如病毒的定義。rqyn14ZNXI2. 方法提要在甘氨酸緩沖液中通過(guò)物理研磨對(duì)分離出的樣品均質(zhì)以釋放病毒，或通過(guò)混合硝酸纖維素膜過(guò)濾病毒，再加入 PEG8000富集病毒。用具有核酸結(jié)合表面的磁珠或?yàn)V膜吸附RNA進(jìn)行進(jìn)一步純化。利用普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)可疑的PCR產(chǎn)物進(jìn)行 測(cè)序分析確定其基因型別。EmxvxOtOco3. 樣品處理(1) 貝類(lèi)我國(guó)

6、和加拿大通常采用甘氨酸-PEG沉淀法，2013版ISO標(biāo)準(zhǔn)采用蛋白酶K消化法。我國(guó)近幾年研究和應(yīng)用較多的是甘氨酸-PEG沉淀法。經(jīng)過(guò)氯仿抽提，能有效去除樣品中的蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等對(duì)PCR有抑制的物質(zhì)；經(jīng)過(guò)PEG沉淀濃縮病毒，能有效提高病毒濃度， 適用于檢測(cè)食品中濃度較低的諾如病毒，并可以直接用于自動(dòng)核酸提取設(shè)備。SixE2yXPq5(2) 生食葉類(lèi)蔬菜參考ISO/TS 15216-2:2013(E)標(biāo)準(zhǔn)8.2.4中對(duì)樣品的處理方法，即甘氨酸-PEG沉淀法，經(jīng)過(guò)3 / 5甘氨酸洗脫，直接用PEG沉淀濃縮病毒，能有效提高病毒濃度，可直接用于自動(dòng)核酸提取設(shè)備。6ewMyirQFL（3）包裝飲用水水富集通

7、常采用固相吸附法，所用膜有正離子膜、負(fù)離子膜、纖維素膜等。正離子膜價(jià)格較昂貴，負(fù)離子膜不易購(gòu)得，混合硝酸纖維素膜價(jià)格便宜，來(lái)源廣泛，吸附效果較好，并且不需要特殊設(shè)備（超高速離心機(jī)等），適合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。（水中諾如病毒富集及定量檢測(cè)研究 周曉紅等；熱帶醫(yī)學(xué)雜志 2010年2月第10卷第2期。）kavU42VRUs4. 引物和探針序列來(lái)源普通RT-PCR引物序列：引自貝類(lèi)中諾沃克病毒檢測(cè)方法普通RT-PCR方法和實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 方法；SN/T 1635-2005。y6v3ALoS89表1普通RT-PCR檢測(cè)引物檢測(cè)的病毒類(lèi)群引物序列片段大小/bpGI 和 GII正向引物 F： 5-ATAC

8、CACTATGATGCAGATTA-3326反向引物 R: 5 -TCATCATCACCATAGAAAGAG-3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物和探針序列：引自Microbiology of food and animal feedHoriz on tal method for determ in atio n of hepatitis A virus and no rovirus in food using real-timeRT-PCR Part 2: Method for qualitative detection ; ISO_TS 15216-2。M2ub6vSTnP表2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢

9、測(cè)引物和探針檢測(cè)的病毒類(lèi)群引物和探針序列片段大小/bpGI正向引物 F: 5 -CGC TGG ATG CGN TTC CAT-3反向引物 R: 5 -CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC-3 探針：5 -FAM-TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT-TAMRA-386GII正向引物 F: 5 -ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA-3反向引物 R: 5 -TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA-3探針:5 -FAM-AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG-TAMRA-3895、試驗(yàn)的靈敏度和

10、特異性標(biāo)準(zhǔn)中諾如病毒檢測(cè)引物與感染部位相同或感染癥狀相似且常見(jiàn)的其他病原體（副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、嗜水氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、扎如病毒、腸道腺病毒、輪狀病毒A型、輪狀病毒B型、輪狀病毒 C型、人星狀病毒、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、蠟樣芽孢桿菌、霍亂弧菌）均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。OYujCfmUCw用普通RT-PCR法檢測(cè)最低檢測(cè)限為1 x 107copy/mL。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)最低檢測(cè)限為 1 x 102 copy/ mL ,線(xiàn)性范圍為1 x 104 copy/ mL -19x 10 copy/ mL。eUts8ZQVR

11、d6、結(jié)果報(bào)告要求陰性結(jié)果報(bào)告方式若貝類(lèi)檢測(cè)結(jié)果為陰性，則結(jié)果報(bào)告為 5g貝類(lèi)消化腺未檢出諾如病毒。若生食葉類(lèi)蔬菜檢測(cè)結(jié)果為陰性，則結(jié)果報(bào)告為25g生食葉類(lèi)蔬菜未檢出諾如病毒。若包裝飲用水檢測(cè)結(jié)果為陰性，則結(jié)果報(bào)告為500mL包裝飲用水未檢出諾如病毒。陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告方式若貝類(lèi)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則結(jié)果報(bào)告為 5g貝類(lèi)消化腺檢出諾如病毒。若生食葉類(lèi)蔬菜檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則結(jié)果報(bào)告為25g生食葉類(lèi)蔬菜檢出諾如病毒。若包裝飲用水檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則結(jié)果報(bào)告為500mL包裝飲用水檢出諾如病毒。（三）國(guó)內(nèi)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)情況1、Microbiology of food and an imal feed Horiz on

12、 tai method for determ in ati on of hepatitis A virus and no rovirus in food using real-time RT-PCR Part 2: Method for qualitative detecti on ;ISO_TS 15216-2國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)組織規(guī)定了貝類(lèi)、水果表面和瓶裝水諾如病毒的檢測(cè)方法。sQsAEJkW5T2、Laboratory Procedure OPFLP-01 CONCENTRATION OF NOROVIRUS GENOGROUPS IAND II FROM CONTAMINATED OYSTER

13、S AND THEIR DETECTION USING THE REVERSE-TRANSCRIPTASE POL YMERASE CHAIN REACTION加拿大微生物方法委員會(huì)研究的糧食理事會(huì)發(fā)布的實(shí)驗(yàn)室程序中規(guī)定了甲殼類(lèi)動(dòng)物如牡蠣和貽貝中諾如病毒樣品 的濃縮方法和檢測(cè)程序。GMsIasNXkA3、 國(guó)內(nèi)SN/T 1635-2005貝類(lèi)中諾沃克病毒檢測(cè)方法普通RT-PCR方法和實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR方法為中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了貝類(lèi)中諾如病毒檢測(cè)方法。TIrRGchYzg（四）專(zhuān)家論證會(huì)意見(jiàn)采納情況10月10日-12日，在北戴河舉行了該標(biāo)準(zhǔn)的專(zhuān)家論證會(huì)。河北省衛(wèi)生計(jì)生

14、委食品處領(lǐng)導(dǎo)，我中心李建國(guó)副主任，國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心、河北省衛(wèi)生計(jì)生委綜合執(zhí)法監(jiān)督局及河北省4個(gè)設(shè)區(qū)市疾控中心的16位專(zhuān)家及課題組6人參加了專(zhuān)家論證會(huì)。國(guó)家和省市的各位專(zhuān)家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)初稿進(jìn)行了仔細(xì)的論證，提出十六條寶貴意見(jiàn)均已采納（附件專(zhuān)家論證會(huì)征求意見(jiàn)匯總處理表 ）。根據(jù)專(zhuān)家意見(jiàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)初稿進(jìn)行了補(bǔ)充和修改，完善了標(biāo)準(zhǔn)條款。7EqZcWLZNX（五）參考文獻(xiàn)1. Microbiology of food and an imal feed Horiz on tai method for determ in ati on ofhepatitis A virus and norovirus in

15、food using real-timeRT-PCRPart 2: Method forqualitative detection; ISO_TS 15216-2。izq7iGfO2E2. 貝類(lèi)中諾沃克病毒檢測(cè)方法普通RT-PCR方法和實(shí)時(shí)熒光RT-PCF方法；SN/T 1635-2005。3. 水中諾如病毒富集及定量檢測(cè)研究周曉紅，李暉，楊杏芬，柯昌文，陳傳德，鄭煥英，周惠瓊，陳秋霞，鄒麗容；熱帶醫(yī)學(xué)雜志2010年2月第10卷第2期。zvpgeqJ1hk4. 貝類(lèi)食品中食源性病毒檢測(cè)方法納米磁珠-基因芯片法；SNJ/ T2518-20105. 國(guó)境口岸諾如病毒檢測(cè)方法；SNJ/T262620106.6. Laboratory Procedure OPFLP-01 CONCENTRATIO