《食品安全地方標(biāo)準食品中諾如病毒檢測》

1、食品安全地方標(biāo)準食品中諾如病毒檢測（DBS13/001-2014）編制說明（一）標(biāo)準起草的基本情況1、任務(wù)來源根據(jù)河北省食品安全地方標(biāo)準制定、修訂項目委托協(xié)議書（2014年），河北省衛(wèi)計委食品安全標(biāo)準與監(jiān)測評估處委托河北省疾病預(yù)防控制中心制訂食品安全地方標(biāo)準 食品中諾如病毒檢測 （DBS13/001-2014）。b5E2RGbCAP2、起草單位本標(biāo)準起草單位：河北省疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準參與（協(xié)作）單位：秦皇島市疾病預(yù)防控制中心、邯鄲市疾病預(yù)防控制中心。3、起草人主要起草人有申志新、關(guān)文英、白雪、張淑紅、侯鳳伶、申玉學(xué)、韓艷青、王英豪、史 紅。4、起草過程簡介（1）收集國內(nèi)外標(biāo)準與文獻：標(biāo)準

2、起草負責(zé)人組織起草人員收集國內(nèi)外諾如病毒檢測方法標(biāo)準和相關(guān)文獻共 40余篇。plEanqFDPw（2） 召開河北省食品安全地方標(biāo)準專家論證會：省衛(wèi)計委于2014年7月，在北戴河組織部分省內(nèi)食品安全專家委員會委員對本項目建議書進行了論證和研討。與會專家認為本項目建議書思路清晰嚴謹，科學(xué)合理，計劃周密可行，具有可操作性，經(jīng)費預(yù)算合理，并已按 專家意見進行了修改，經(jīng)審查合格，同意實施。DXDiTa9E3d（3）制定初步檢測方法：在參閱國內(nèi)外標(biāo)準和文獻基礎(chǔ)上，確定方法制定原則、主要內(nèi)容和方法驗證，草擬實施方案。RTCrpUDGiT（4）樣品檢測：2014年6月-7月，省疾控中心和秦皇島市疾控中心對北戴

3、河區(qū)市售生食海產(chǎn)品進行了諾如病毒檢測。共采集貝類樣品100份，其中5份諾如病毒陽性，檢出率為5%，為我省在食品安全風(fēng)險監(jiān)測中首次檢出諾如病毒，同時檢測包裝飲用水樣品50份，未檢出陽性。5PCzVD7HxA（5）試驗驗證：根據(jù)項目制定方案，秦皇島市疾控中心和邯鄲市疾控中心對本方法進1 / 5行驗證試驗，并出具正式的驗證報告。jLBHrnAlLg(6) 起草標(biāo)準文本：參照國際標(biāo)準、行業(yè)標(biāo)準規(guī)定和實驗室驗證試驗情況，編制河 北省地方標(biāo)準 食品中諾如病毒檢測 (DBS13/001-2014 )標(biāo)準文本和編制說明 XHAQX74J0X(7) 召開研討會：2014年10月11日，省疾控中心在北戴河組織召開

4、河北省地方標(biāo)準 食品中諾如病毒檢測(DBS13/001-2014 )征求意見稿專家論證會，邀請國家食品安全風(fēng)險評估中心、省衛(wèi)生綜合執(zhí)法局和部分市疾控中心專家參會，對本標(biāo)準進行全面審核，對需要進一步修改、確認和完善之處提出建議。LDAYtRyKfE(8) 完成標(biāo)準征求意見稿：標(biāo)準起草人根據(jù)專家意見建議，進一步查閱和分析參考文獻及修訂標(biāo)準內(nèi)容，進行修改完善，形成標(biāo)準征求意見稿。Zzz6ZB2Ltk(9) 專家審核：省衛(wèi)計委組織我省食品安全委員會有關(guān)專家對標(biāo)準征求意見稿進行審核，提出修改意見，標(biāo)準起草人修改后形成標(biāo)準報批稿。公開向社會征求意見。dvzfvkwMI1(10) 標(biāo)準報批：標(biāo)準起草人對修改

5、意見進行整理，進一步完善標(biāo)準。報省衛(wèi)計委批準、 發(fā)布、實施。(二) 標(biāo)準的重要內(nèi)容及主要制定情況1. 諾如病毒的定義參考楊大進，李寧主編的2014年國家食品污染和有害因素風(fēng)險監(jiān)測工作手冊中諾 如病毒檢驗標(biāo)準操作程序關(guān)于諾如病毒的定義。rqyn14ZNXI2. 方法提要在甘氨酸緩沖液中通過物理研磨對分離出的樣品均質(zhì)以釋放病毒，或通過混合硝酸纖維素膜過濾病毒，再加入 PEG8000富集病毒。用具有核酸結(jié)合表面的磁珠或濾膜吸附RNA進行進一步純化。利用普通RT-PCR和實時熒光RT-PCR方法進行檢測，對可疑的PCR產(chǎn)物進行 測序分析確定其基因型別。EmxvxOtOco3. 樣品處理(1) 貝類我國

6、和加拿大通常采用甘氨酸-PEG沉淀法，2013版ISO標(biāo)準采用蛋白酶K消化法。我國近幾年研究和應(yīng)用較多的是甘氨酸-PEG沉淀法。經(jīng)過氯仿抽提，能有效去除樣品中的蛋白質(zhì)、脂類等對PCR有抑制的物質(zhì)；經(jīng)過PEG沉淀濃縮病毒，能有效提高病毒濃度， 適用于檢測食品中濃度較低的諾如病毒，并可以直接用于自動核酸提取設(shè)備。SixE2yXPq5(2) 生食葉類蔬菜參考ISO/TS 15216-2:2013(E)標(biāo)準8.2.4中對樣品的處理方法，即甘氨酸-PEG沉淀法，經(jīng)過3 / 5甘氨酸洗脫，直接用PEG沉淀濃縮病毒，能有效提高病毒濃度，可直接用于自動核酸提取設(shè)備。6ewMyirQFL（3）包裝飲用水水富集通

7、常采用固相吸附法，所用膜有正離子膜、負離子膜、纖維素膜等。正離子膜價格較昂貴，負離子膜不易購得，混合硝酸纖維素膜價格便宜，來源廣泛，吸附效果較好，并且不需要特殊設(shè)備（超高速離心機等），適合大多數(shù)實驗室。（水中諾如病毒富集及定量檢測研究 周曉紅等；熱帶醫(yī)學(xué)雜志 2010年2月第10卷第2期。）kavU42VRUs4. 引物和探針序列來源普通RT-PCR引物序列：引自貝類中諾沃克病毒檢測方法普通RT-PCR方法和實時熒光 RT-PCR 方法；SN/T 1635-2005。y6v3ALoS89表1普通RT-PCR檢測引物檢測的病毒類群引物序列片段大小/bpGI 和 GII正向引物 F： 5-ATAC

8、CACTATGATGCAGATTA-3326反向引物 R: 5 -TCATCATCACCATAGAAAGAG-3實時熒光RT-PCR引物和探針序列：引自Microbiology of food and animal feedHoriz on tal method for determ in atio n of hepatitis A virus and no rovirus in food using real-timeRT-PCR Part 2: Method for qualitative detection ; ISO_TS 15216-2。M2ub6vSTnP表2實時熒光RT-PCR檢

9、測引物和探針檢測的病毒類群引物和探針序列片段大小/bpGI正向引物 F: 5 -CGC TGG ATG CGN TTC CAT-3反向引物 R: 5 -CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC-3 探針：5 -FAM-TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT-TAMRA-386GII正向引物 F: 5 -ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA-3反向引物 R: 5 -TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA-3探針:5 -FAM-AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG-TAMRA-3895、試驗的靈敏度和

10、特異性標(biāo)準中諾如病毒檢測引物與感染部位相同或感染癥狀相似且常見的其他病原體（副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、嗜水氣單胞菌、沙門氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、扎如病毒、腸道腺病毒、輪狀病毒A型、輪狀病毒B型、輪狀病毒 C型、人星狀病毒、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、蠟樣芽孢桿菌、霍亂弧菌）均無交叉反應(yīng)，特異性強。OYujCfmUCw用普通RT-PCR法檢測最低檢測限為1 x 107copy/mL。實時熒光RT-PCR檢測最低檢測限為 1 x 102 copy/ mL ,線性范圍為1 x 104 copy/ mL -19x 10 copy/ mL。eUts8ZQVR

11、d6、結(jié)果報告要求陰性結(jié)果報告方式若貝類檢測結(jié)果為陰性，則結(jié)果報告為 5g貝類消化腺未檢出諾如病毒。若生食葉類蔬菜檢測結(jié)果為陰性，則結(jié)果報告為25g生食葉類蔬菜未檢出諾如病毒。若包裝飲用水檢測結(jié)果為陰性，則結(jié)果報告為500mL包裝飲用水未檢出諾如病毒。陽性結(jié)果報告方式若貝類檢測結(jié)果為陽性，則結(jié)果報告為 5g貝類消化腺檢出諾如病毒。若生食葉類蔬菜檢測結(jié)果為陽性，則結(jié)果報告為25g生食葉類蔬菜檢出諾如病毒。若包裝飲用水檢測結(jié)果為陽性，則結(jié)果報告為500mL包裝飲用水檢出諾如病毒。（三）國內(nèi)和國際標(biāo)準情況1、Microbiology of food and an imal feed Horiz on

12、 tai method for determ in ati on of hepatitis A virus and no rovirus in food using real-time RT-PCR Part 2: Method for qualitative detecti on ;ISO_TS 15216-2國際化標(biāo)準組織規(guī)定了貝類、水果表面和瓶裝水諾如病毒的檢測方法。sQsAEJkW5T2、Laboratory Procedure OPFLP-01 CONCENTRATION OF NOROVIRUS GENOGROUPS IAND II FROM CONTAMINATED OYSTER

13、S AND THEIR DETECTION USING THE REVERSE-TRANSCRIPTASE POL YMERASE CHAIN REACTION加拿大微生物方法委員會研究的糧食理事會發(fā)布的實驗室程序中規(guī)定了甲殼類動物如牡蠣和貽貝中諾如病毒樣品 的濃縮方法和檢測程序。GMsIasNXkA3、 國內(nèi)SN/T 1635-2005貝類中諾沃克病毒檢測方法普通RT-PCR方法和實時熒光 RT-PCR方法為中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準，規(guī)定了貝類中諾如病毒檢測方法。TIrRGchYzg（四）專家論證會意見采納情況10月10日-12日，在北戴河舉行了該標(biāo)準的專家論證會。河北省衛(wèi)生計生

14、委食品處領(lǐng)導(dǎo)，我中心李建國副主任，國家食品安全風(fēng)險評估中心、河北省衛(wèi)生計生委綜合執(zhí)法監(jiān)督局及河北省4個設(shè)區(qū)市疾控中心的16位專家及課題組6人參加了專家論證會。國家和省市的各位專家對標(biāo)準初稿進行了仔細的論證，提出十六條寶貴意見均已采納（附件專家論證會征求意見匯總處理表 ）。根據(jù)專家意見對標(biāo)準初稿進行了補充和修改，完善了標(biāo)準條款。7EqZcWLZNX（五）參考文獻1. Microbiology of food and an imal feed Horiz on tai method for determ in ati on ofhepatitis A virus and norovirus in

15、food using real-timeRT-PCRPart 2: Method forqualitative detection; ISO_TS 15216-2。izq7iGfO2E2. 貝類中諾沃克病毒檢測方法普通RT-PCR方法和實時熒光RT-PCF方法；SN/T 1635-2005。3. 水中諾如病毒富集及定量檢測研究周曉紅，李暉，楊杏芬，柯昌文，陳傳德，鄭煥英，周惠瓊，陳秋霞，鄒麗容；熱帶醫(yī)學(xué)雜志2010年2月第10卷第2期。zvpgeqJ1hk4. 貝類食品中食源性病毒檢測方法納米磁珠-基因芯片法；SNJ/ T2518-20105. 國境口岸諾如病毒檢測方法；SNJ/T262620106.6. Laboratory Procedure OPFLP-01 CONCENTRATIO