生物制藥基本技術(shù)

1、內(nèi)容提要內(nèi)容提要概述概述各種提取與純化技術(shù)各種提取與純化技術(shù)小結(jié)小結(jié)Chapter 6 Basic Technique For Biopharmaco 生物制藥是把生物體內(nèi)的具有生物活性的基生物制藥是把生物體內(nèi)的具有生物活性的基本物質(zhì)，保持原來的結(jié)構(gòu)和功能，又能在含有多本物質(zhì)，保持原來的結(jié)構(gòu)和功能，又能在含有多種物質(zhì)的液相或固相中較高純度的分離出來。它種物質(zhì)的液相或固相中較高純度的分離出來。它是一項(xiàng)嚴(yán)格、細(xì)致、復(fù)雜的工藝過程，涉及物理、是一項(xiàng)嚴(yán)格、細(xì)致、復(fù)雜的工藝過程，涉及物理、化學(xué)、生物學(xué)、工程等方面的知識和操作技術(shù)。化學(xué)、生物學(xué)、工程等方面的知識和操作技術(shù)。 對于一個(gè)新研制的生物藥物，從查

2、閱文獻(xiàn)開對于一個(gè)新研制的生物藥物，從查閱文獻(xiàn)開始，到探索實(shí)驗(yàn)、條件考察（記錄客觀），還要始，到探索實(shí)驗(yàn)、條件考察（記錄客觀），還要總結(jié)制定工藝規(guī)程、制定分析鑒定方法，再進(jìn)行總結(jié)制定工藝規(guī)程、制定分析鑒定方法，再進(jìn)行中試放大，全面考察工藝是否成熟，是否穩(wěn)定等中試放大，全面考察工藝是否成熟，是否穩(wěn)定等過程。過程。問題：問題：1、標(biāo)準(zhǔn)化方法？、標(biāo)準(zhǔn)化方法？ 2、如何發(fā)現(xiàn)或研制新藥？、如何發(fā)現(xiàn)或研制新藥？概概 述述1. 基本制藥技術(shù)和方法基本制藥技術(shù)和方法種類種類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。1）提取法）提取法(Extraction)2）發(fā)酵法（）發(fā)酵法（ Zymotechni

3、cs）3）化學(xué)合成（）化學(xué)合成（Chemical synthesize）4）組織培養(yǎng)法（）組織培養(yǎng)法（Tissue culture）5）現(xiàn)代生物技術(shù)）現(xiàn)代生物技術(shù)(Modern Biotechnics): Gene engineering, Enzyme engineering, Cell engineering , protein Engineering,1）原料的選擇和預(yù)處理）原料的選擇和預(yù)處理2）原料的粉碎）原料的粉碎3）提?。簭脑现薪?jīng)溶劑分離有效成分，制）提?。簭脑现薪?jīng)溶劑分離有效成分，制成粗品的工過程。成粗品的工過程。4）純化：粗制品經(jīng)鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸）純化：粗制品經(jīng)鹽析、

4、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步附、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步驟進(jìn)行精制的工藝過程。驟進(jìn)行精制的工藝過程。5）濃縮、干燥及保存）濃縮、干燥及保存6）制劑：原料藥（精制品）經(jīng)精細(xì)加工制成片）制劑：原料藥（精制品）經(jīng)精細(xì)加工制成片劑、針劑、凍干劑、粉劑等供臨床應(yīng)用的各種劑、針劑、凍干劑、粉劑等供臨床應(yīng)用的各種劑型。劑型。Raw Material Selecting and Pretreatment1、原料選擇的基本準(zhǔn)則、原料選擇的基本準(zhǔn)則 1）在大量的信息資料和在大量的信息資料和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇目標(biāo)原料。實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇目標(biāo)原料。2）選擇有效成選擇有效

5、成分含量高的新鮮材料；分含量高的新鮮材料；3）來源豐富易得；來源豐富易得；4）制造工制造工藝簡單易行；藝簡單易行；5）成本比較低；成本比較低；6）原料的采集不破壞原料的采集不破壞生態(tài)環(huán)境生態(tài)環(huán)境, 選擇對環(huán)境友好的原材料資，防止生物入選擇對環(huán)境友好的原材料資，防止生物入侵。侵。2、預(yù)處理方法、預(yù)處理方法 1）動(dòng)物組織先要剔除結(jié)締組織、脂肪組織等非活性動(dòng)物組織先要剔除結(jié)締組織、脂肪組織等非活性部分；植物種子去殼除脂；微生物要進(jìn)行菌體與發(fā)部分；植物種子去殼除脂；微生物要進(jìn)行菌體與發(fā)酵液分離等基本操作。便于貯存和運(yùn)輸。酵液分離等基本操作。便于貯存和運(yùn)輸。 2）冷凍法預(yù)處理：有些材料要冷凍保存或低溫保

6、存，冷凍法預(yù)處理：有些材料要冷凍保存或低溫保存，以便抑制微生物和酶的作用。以便抑制微生物和酶的作用。 3）有機(jī)溶劑除去部分水分：用丙酮或乙醇進(jìn)行脫水有機(jī)溶劑除去部分水分：用丙酮或乙醇進(jìn)行脫水和脫脂，有利于貯存。和脫脂，有利于貯存。Comminution of Raw Materialu原料的粉碎原料的粉碎：在提取前先將大塊的原料粉碎或絞碎在提取前先將大塊的原料粉碎或絞碎成適度的粒度，或?qū)⒓?xì)胞破碎，使胞內(nèi)活性物質(zhì)充成適度的粒度，或?qū)⒓?xì)胞破碎，使胞內(nèi)活性物質(zhì)充分釋放到溶液中，有利于提取或吸附。分釋放到溶液中，有利于提取或吸附。微生物：常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、微生物：常用自溶、冷熱交替、加砂研

7、磨、超聲、加壓等處理方法。超聲、加壓等處理方法。動(dòng)物臟器組織：常用絞肉機(jī)機(jī)械法粉碎；動(dòng)物臟器組織：常用絞肉機(jī)機(jī)械法粉碎；植物肉質(zhì)組織：常用磨碎法；植物肉質(zhì)組織：常用磨碎法； 1. 1. 機(jī)械法：機(jī)械法：組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽、球磨機(jī)、組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽、球磨機(jī)、萬能粉碎機(jī)、絞肉機(jī)、擊碎機(jī)、刨片機(jī)。萬能粉碎機(jī)、絞肉機(jī)、擊碎機(jī)、刨片機(jī)。動(dòng)物組織多在冰凍狀態(tài)絞碎、溶漿。動(dòng)物組織多在冰凍狀態(tài)絞碎、溶漿。u冷熱交替法：冷熱交替法：將材料投入沸水中，在將材料投入沸水中，在90左右維持左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。此法多用

8、于細(xì)菌或病毒中提取蛋白和細(xì)胞被破壞。此法多用于細(xì)菌或病毒中提取蛋白和核酸。核酸。u反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法：把待破碎的樣品冷至把待破碎的樣品冷至-20-15 ，使，使之凝固，然后緩慢的溶解，如此反復(fù)操作，大部分之凝固，然后緩慢的溶解，如此反復(fù)操作，大部分動(dòng)物性細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？梢云扑?。動(dòng)物性細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？梢云扑?。u超聲波處理法超聲波處理法：多用于微生物材料，處理的效果與多用于微生物材料，處理的效果與樣品濃度、使用頻率有關(guān)。用大腸桿菌制備各種酶樣品濃度、使用頻率有關(guān)。用大腸桿菌制備各種酶時(shí)，常用時(shí)，常用50100mg/L菌體濃度，在菌體濃度，在110KC頻率下頻率下處理處理1015min。操

9、作時(shí)注意避免溶液中氣泡的存。操作時(shí)注意避免溶液中氣泡的存在。在。u加壓破碎法：加壓破碎法：加氣壓或水壓，達(dá)加氣壓或水壓，達(dá)0.5934.32 MPa (210350kgf/cm2)的壓力時(shí)，的壓力時(shí)， 可使可使90%以上細(xì)胞被以上細(xì)胞被壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。A.A.自溶法自溶法 將新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當(dāng)溫度下,利用組織細(xì)胞中自身的酶系將細(xì)胞破壞,使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來的方法。自溶的溫度,動(dòng)物材料在0-4,微生物在室溫下。自溶時(shí),需加少量的防腐劑,甲苯、氯仿,以防止外界細(xì)菌的污染。由于自溶時(shí)間較長,不易控制,故制造具有活性的核酸和蛋白

10、質(zhì)時(shí)比較少用。C.C.表面活性劑處理法表面活性劑處理法 表面活性劑的分子中,兼有親脂性和親水性基團(tuán),能降低水的界面張力,具有乳化、分散、增溶作用。B.B.溶菌酶處理法溶菌酶處理法 溶菌酶是專一地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的酶。多用于微生物,對蝸牛酶、纖維酶及植物細(xì)胞也適用。如用噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞制造DNA時(shí),采用pH8.0的0.1mol/L Tris-0.01mol/LEDTA制成2億/ml的細(xì)胞懸液,然后加入100g1mg的溶菌酶,在37C保溫10min,細(xì)菌胞壁即被破壞。u常用有:SDS、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉。1 1、提取條件的選擇提取條件的選擇 1）溶劑:常用水/稀鹽/稀酸/稀堿,有機(jī)溶

11、劑如乙醇/丙酮/氯仿/四氯化碳/丁醇等。丁醇提取的pH、溫度范圍較廣(pH3-6, 20-40)。適用于動(dòng)植物和微生物原料。 2）pH:與溶解度和穩(wěn)定性有很大關(guān)系,一般選擇在pI的兩側(cè) 3）溫度:一般在5 以下,但對溫度耐受力較大的藥物,可適當(dāng)?shù)奶岣邷囟?使雜蛋白變性分離,有利于提取和純化。如胃蛋白酶/酵母醇脫氫酶及多肽激素類,選擇37-50 提取,效果較好。u提?。禾崛。阂卜Q抽提、萃取,就是利用一種溶劑對物質(zhì)的不同溶解度,從化合物中分離出一種或幾種組分的過程。分為固體處理（液固萃取）和液體處理（液液萃?。?。2 2、影響提取的因素影響提取的因素 1）被提取物質(zhì)溶解度的大小,一般極性對極性；非極

12、性對非極性；酸對堿；堿對酸；高溫；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)。2）擴(kuò)散作用的影響,擴(kuò)散方程式G=DF*C/X*t3）分配作用的影響,分配定律(C1/C2)恒溫、恒壓=K 利用不同的蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中,溶解度不同程度的降低來進(jìn)行分離純化。在低鹽濃度下,溶解度隨著鹽濃度升高而增加,稱鹽溶作用；當(dāng)鹽濃度不斷升高時(shí),不同蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀,稱鹽析作用。u優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備和條件要求低,安全應(yīng)用范圍廣泛。在高鹽情況下蛋白質(zhì)不易發(fā)生變化,一般在室溫下操作。缺點(diǎn)：分級分離能力不高。硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉等等u 鹽析時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題：1）鹽飽和度：由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

13、和性質(zhì)不同,鹽析要求的飽和度也不同。要按工藝要求,正確計(jì)算飽和度。2）pH 值的選擇:蛋白質(zhì)在pI時(shí)的溶解度最小。因此,進(jìn)行鹽析時(shí)的pH,要選擇在被分離蛋白質(zhì)的pI 附近。3）蛋白質(zhì)濃度：在相同條件下,蛋白質(zhì)濃度越大越易沉淀,使用鹽的飽和度極限也愈低。蛋白質(zhì)濃度愈高,其他蛋白質(zhì)共沉作用也愈強(qiáng),這是不希望的。選擇適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度,可避免共沉的干擾。4）溫度：一般在室溫下進(jìn)行,濃鹽對蛋白質(zhì)有保護(hù)作用。但對溫度敏感的,要在低溫下進(jìn)行。常在0-4 范圍內(nèi)迅速操作。如尿激酶。5）鹽析沉淀物的脫鹽：鹽析的沉淀分離后,經(jīng)脫鹽才能獲得純品。最常用的脫鹽方法是透析,時(shí)間一般較長,應(yīng)常換透析液,注意防止污辱。 利

14、用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度差異而分離目的蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)的沉淀與溶解,與溶劑的介電常數(shù)有關(guān)。降低溶液的介電常數(shù),使其溶解度變小.同時(shí),還破壞蛋白質(zhì)的水化膜而使蛋白質(zhì)沉淀析出。 幾種溶劑的介電常數(shù)幾種溶劑的介電常數(shù)溶劑名稱溶劑名稱 20 時(shí)的介時(shí)的介電常數(shù)電常數(shù)溶劑名稱溶劑名稱20 時(shí)的時(shí)的介電常數(shù)介電常數(shù)乙醚乙醚4.33甲醇甲醇33丙酮丙酮21.4水水80乙醇乙醇242.5mol/L甘氨酸水溶液甘氨酸水溶液 137介電常數(shù)與靜電力的關(guān)系：介電常數(shù)與靜電力的關(guān)系： F=Q1Q2/Kr2。式中：。式中： K介電介電常數(shù)。指帶相反電荷的微粒之間的靜電引力。常數(shù)。指帶相反電荷的微粒

15、之間的靜電引力。F相距為相距為r的的2個(gè)帶電量分別為個(gè)帶電量分別為Q1、Q2點(diǎn)電荷相互作用的靜電引力。點(diǎn)電荷相互作用的靜電引力。 經(jīng)驗(yàn)：如30-40%乙醇沉淀的物質(zhì),改用丙酮時(shí),其體積分?jǐn)?shù)可減少10%左右。即可用2030%的丙酮;而70-80%乙醇沉淀的物質(zhì),可用5060%的丙酮即可。 注:水有較高的介電常數(shù),具有很好的溶劑性能,是一種廣譜溶劑。有機(jī)溶劑法比鹽析法分辨力強(qiáng),沉淀也好過濾,易干燥,但對有些生物活性物質(zhì)能引起失活和變性。應(yīng)用時(shí)還要注意揮發(fā)和火災(zāi)等。有機(jī)沉淀法應(yīng)注意的問題有機(jī)沉淀法應(yīng)注意的問題（1）控制工藝過程的溫度:整個(gè)操作過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行,而且最好是同一溫度。（2）防止溶劑局部

16、濃度過高:加入有機(jī)溶劑時(shí)攪拌要均勻,速度要適當(dāng),避免局部濃度過高,引起沉淀物的破壞、變性或失活。（3）及時(shí)處理沉淀物:沉淀物經(jīng)過濾或離心后,要立即用水或緩沖液溶解,降低有機(jī)溶劑的濃度。（4）pH的選擇：在待沉淀蛋白質(zhì)的pI附近。（5）有機(jī)溶劑是酶和蛋白質(zhì)的變性因素,尤其是對敏感酶類。 利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)的溶解度最低,而各種蛋白質(zhì)又具有不同的等電點(diǎn)的特性進(jìn)行分離的工藝過程。由于各種蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí),仍有一定的溶解度而沉淀不完全,多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)又都十分接近,所以單獨(dú)使用效果不理想,分辨力差,多用于提取后除雜蛋白。實(shí)際生產(chǎn)中常與有機(jī)溶劑沉淀法、鹽析法聯(lián)合使用。 膜分離技術(shù)包括超濾、反滲透析、電

17、滲析、微孔過濾、氣體滲析和超精密過濾。根據(jù)溶質(zhì)分子和懸浮粒子是否通過多孔膜來進(jìn)行篩分。在液壓的驅(qū)動(dòng)下,能通過超濾膜的分離粒子的范圍,一般在0.0010.01m。n超濾即利用一種特制的膜對溶液中的各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾。 優(yōu)點(diǎn)：成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保持藥物活性、回收率高。適用于酶和蛋白質(zhì)藥物的分離、濃縮、脫鹽、提純、除菌、除病毒和熱原。以高分子透過性薄膜為分離介質(zhì),在超過溶液滲透壓力的情況下,使溶液中的溶劑透過薄膜,同時(shí)使溶質(zhì)和不溶物阻截在膜前。這一過程類似于滲透,但方向相反,即溶劑從高濃度一側(cè)傳遞到濃度低的一側(cè)，故稱反滲透。 特點(diǎn)：能耗少，體積小，適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)。由高分子材

18、料制成的薄膜過濾介質(zhì)，可以過濾一般介質(zhì)不能截留的細(xì)菌和微粒。膜的孔徑在0.2-10 m。n 以聚乙烯醇為主體的中空多孔濾膜，分級性能在超濾膜與微孔濾膜之間。為0.010.2 m。用于水的精制、循環(huán)水的凈化、除懸浮固體粒子以及糖液、酶液的精制。5 5、離子交換層析、離子交換層析 采用不溶性高分子化合物作為離子交換劑,分離純化各種生化物質(zhì)。離子交換樹脂在水中能溶脹,溶脹后,其分子中的極性基團(tuán)（活性基團(tuán)）,具有可擴(kuò)散的離子,能與溶液中的離子起交換作用;非極性基團(tuán)作為樹脂的骨架,使樹脂不溶于水并具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),為離子交換的進(jìn)行及溶液和樹脂的分離創(chuàng)造了條件。離子交換層析包括吸附、吸收、穿透、擴(kuò)散、離子交換

19、、離子親和力等物理化學(xué)過程。(1)強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂：功能團(tuán)為磺酸基，pH一般沒有限制。(2)弱酸性陽離子交換樹脂：功能團(tuán)為羧基、酚基。在酸性溶液中不發(fā)生交換，pH愈大交換能力愈強(qiáng)。(3)強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂：功能團(tuán)為三甲基季胺基團(tuán)。pH沒有限制。(4)弱酸性陰離子交換樹脂：功能團(tuán)為伯胺基、仲胺基、叔胺基。pH愈低交換能力愈大。（1）樹脂顆粒的大小：顆粒小，表面積大，能促進(jìn)內(nèi)部和外部擴(kuò)散。（2）攪拌和流速：加快攪拌速度或加大液體流速，都能減少樹脂外液膜的厚度，從而使液相擴(kuò)散速度增加。（3）離子濃度：交換速度隨離子濃度的上升而增加，達(dá)到一定濃度后交換速度不在升高。（4）離子的水化半徑:水化半徑

20、小的易被吸附。（5）樹脂酸堿性的強(qiáng)弱和溶液的pH。（6）交聯(lián)度大小:交聯(lián)度愈小,樹脂愈易膨脹,交換速度愈快。但交聯(lián)度小的樹脂選擇性較差。（7）有機(jī)溶劑的影響:當(dāng)有有機(jī)溶劑存在時(shí),會(huì)降低樹脂對有機(jī)離子的選擇性,而容易吸附無機(jī)離子。6 6、凝膠層析、凝膠層析 指化合物隨流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠的固定相的層析柱時(shí)，因其各種物質(zhì)分子大小不同而被分離的技術(shù)。又稱凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾、阻滯擴(kuò)散層析、排阻層析。1)優(yōu)缺點(diǎn) 缺點(diǎn):分離速度慢。優(yōu)點(diǎn):設(shè)備簡單,操作方便,分離效果好,回收率高,分離條件緩和,不使活性物質(zhì)失活變性,凝膠可重復(fù)使用,無需再生處理。廣泛用于分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶及多糖等藥物

21、。2)幾種常用的凝膠：基本骨架是16糖苷鍵。由葡聚糖和甘油以醚橋形式交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最著名的商品為Sephadex葡聚糖凝膠,珠狀顆粒物,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不溶于水/弱酸/堿和鹽溶液。低溫時(shí),在0.1mol/L 鹽酸中保持1-2h不改變性質(zhì);室溫時(shí),在0.01mol/L 鹽酸中放置半年也不改變;在0.25mol/L的氫氧化鈉中, 60兩個(gè)月沒有發(fā)改變。可在120加熱30min滅菌而不破壞,但高于120即變黃。濕狀貯存易發(fā)霉,若長期不用,需加防腐劑。（由碳碳骨架構(gòu)成。完全為惰性。穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好,洗脫時(shí)不會(huì)有凝膠物質(zhì)下來。缺點(diǎn)：不耐酸。遇酸時(shí)酰胺鍵會(huì)水解為羧基,使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)。

22、:天然凝膠,不是共價(jià)交聯(lián),是以氫鍵交聯(lián)?？障抖纫云跫?zhí)堑臐舛葋砀淖?化學(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。沒有干凝膠，必須在溶脹狀態(tài)保存,遇脫水劑、冷凍和一些有機(jī)溶劑即破壞,丙酮和乙醇對它無影響。在pH4.5-9,溫度0-40穩(wěn)定。對硼酸有吸附,不能用硼酸緩沖液。他能分離及萬到幾千萬相對分子質(zhì)量的物質(zhì),彌補(bǔ)了葡聚糖和聚丙烯酰胺凝膠的不足。瑞典商品名Sepharose,美國稱生物凝膠A（Bio-Gel-A）,英國稱Sagavac。常用的為聚甲基丙烯酸酯（Polymethacrylate）凝膠、聚苯乙烯凝膠（如Styrogel,Bio-Beads-S）生物活性物質(zhì)都有親和作用,如酶與底物、激素與受體、核酸的互

23、補(bǔ)鏈間,多糖與蛋白質(zhì)復(fù)合體。n親和層析是利用生物大分子的特異親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)?？赡娼Y(jié)合的特異性物質(zhì)稱為配基,與配基結(jié)合的層析介質(zhì)稱為載體。n親和層析能從粗提液中,通過一次簡便處理,便可得到高純度的活性物質(zhì),既可分離一些生物材料中含量極微的物質(zhì),又能分離一些性質(zhì)十分相似的物質(zhì)。1)1)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn):設(shè)備要求不高,操作簡便,適用范圍廣,特異性強(qiáng),分離速度快,效果好,條件溫和。缺點(diǎn)：通用性較差,洗脫條件要求苛刻。自然界中數(shù)量最大的大分子生物材料,取材十分方便。但由于其結(jié)構(gòu)緊密、均一性差,不利于大分子的滲入?；罨蟪в须姾?非特異性吸附較強(qiáng),加上空間位阻等原因,其應(yīng)用不如凝膠載體廣泛。目

24、前主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)。如用寡聚脫氧胸腺核苷酸纖維素作固定相分離細(xì)胞提取液中的mRNA. 市售商品有:無定型微纖維/微晶纖維素/珠狀纖維素。用于親和層析的主要為交聯(lián)珠狀凝膠。瓊脂糖的質(zhì)量濃度為20g/L(2%)、40g/L(4%)、60g/L(6%)幾種，相應(yīng)的商品稱為Sepharose 2B、4B、6B(Pharmacia)和UltrogelsA-2,A-4,A-6)。這類載體能使吸附物質(zhì)保持活性,能迅速活化并接上各種功能基團(tuán),結(jié)構(gòu)疏松孔徑大,流速快。與瓊脂糖凝膠相比孔徑太小,特別是經(jīng)配基偶聯(lián)后,凝膠膨脹度會(huì)進(jìn)一步邊小,所以應(yīng)用受到限制。：碳碳骨架,有丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成

25、,具有網(wǎng)狀三維空間結(jié)構(gòu)。商品名為Biogel P。避免接觸強(qiáng)氧化劑,配基偶聯(lián)后會(huì)使它的網(wǎng)格縮小,在一定程度上限制了它的應(yīng)用?；瘜W(xué)和物理穩(wěn)定性好,機(jī)械強(qiáng)度高,不但能抵御酶及微生物的作用,還能耐受高溫滅菌和較劇烈的反應(yīng)條件。 缺點(diǎn):親水性不強(qiáng),對蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特異性吸附,而且可供連接的化學(xué)活性基團(tuán)也少。 改良方法:為了克服其缺點(diǎn),市售Bio-Glass的商品都已事先連接了氨烷基（烷基胺）。A)用葡聚糖包被玻璃珠,則可改善其親水性,并增加化學(xué)活性基團(tuán)。B)用抗原涂布的玻璃珠已成功地分離了免疫淋巴細(xì)胞，在DNA連接的玻璃珠上純化了大腸桿菌的DNA和RNA聚合酶。 由聚丙烯酰胺和瓊脂糖混合組

26、成的載體,商品名為Ultrogels ACA。它的特點(diǎn)是載體上既有羥基又有酰胺基,并且都能與配基單獨(dú)作用。但不能接觸強(qiáng)堿,以免酰胺水解,使用溫度不超過40C。在丙烯酰胺和瓊脂糖的混合膠中加入7%的四氧化三鐵,則可制得一種稱為磁性膠（Magnogels ACA44）的載體。 當(dāng)懸浮液中含有不均勻粒子時(shí),依靠磁性能將載體與其他粒子分離。磁性膠載體常用于酶的免疫測定、熒光免疫測定、放射免疫測定、免疫吸收劑和細(xì)胞分離等的微量測定和制備。（1）配基濃度；（2）空間障礙；（3）配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)；（4）載體的孔徑；（5）微環(huán)境（化學(xué)因素）。 濃縮：濃縮：低濃度溶液通過除去溶劑變?yōu)楦邼舛热芤旱倪^程。常在提

27、取后和結(jié)晶前進(jìn)行,有時(shí)也貫穿與整個(gè)制藥過程。蒸發(fā)裝置的設(shè)計(jì)原理蒸發(fā)裝置的設(shè)計(jì)原理: :加熱/擴(kuò)大液體表面積/低壓。薄膜蒸發(fā)濃縮Film evaporation concentration,臥式噴淋降膜蒸發(fā)器/Rose蒸發(fā)器/板式蒸發(fā)器;減壓蒸發(fā)濃縮Decompression evaporation concentration 減壓抽真空(真空濃縮),適用不耐熱的藥物和制品。吸收濃縮(Absorbing concentration) 通過吸收劑直接吸收除去溶液中的溶劑分子使溶液濃縮的方法。吸收劑與溶液不起化學(xué)反應(yīng),對生化藥物不起吸附作用,易與溶液分開。吸附劑除去溶劑后可重復(fù)使用。常用的吸收劑：聚

28、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、凝膠。凝膠可直接投入待濃縮的溶液中,溶劑和小分子被吸收到凝膠內(nèi),大分子留在溶液中,然后離心過濾。使用聚乙二醇時(shí),先將溶液裝入半透膜的袋內(nèi),扎緊袋口,外加聚乙二醇覆蓋,袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇吸去。 結(jié)晶：結(jié)晶：利用某些藥物具有形成晶體的性質(zhì)是目標(biāo)藥物（溶質(zhì)）呈晶態(tài)從溶液中析出的過程。 結(jié)晶的條件：結(jié)晶的條件：（1）純度purity：各種物質(zhì)在溶液中均需達(dá)到一定的純度才能析出結(jié)晶。 蛋白質(zhì)和酶，純度不低于50%?？傏厔菔窃郊冊揭捉Y(jié)晶，但已結(jié)晶的制品不表示達(dá)到了絕對的純化，只能說到了相當(dāng)純的程度。有時(shí)純度不高，但加入有機(jī)溶劑和制成鹽，也能達(dá)到結(jié)晶。（2）濃度consi

29、deration 結(jié)晶液的濃度要較高,以利于分子間的碰撞聚合。但濃度過高,相應(yīng)雜質(zhì)和溶液黏度增大,反而不利于結(jié)晶,或生成純度較差的粉末結(jié)晶。（3）pH 選擇pH在pI附近,有利于晶體析出。（4）溫度temperature 通常在低溫條件進(jìn)行,活性物質(zhì)不易變性,又可避免細(xì)菌繁殖。（5）時(shí)間Time 結(jié)晶的生成和生長需要時(shí)間。但生物藥物要求在幾小時(shí)內(nèi)完成,時(shí)間不宜過長。（6）晶種Crystal seed 不易結(jié)晶的藥物常加晶種。 干燥：干燥：是從濕的固體生物藥物中,除去水分或溶劑而獲得相對或絕對干燥制品的工藝過程。它也是一種蒸發(fā),但不同于濃縮。通常包括原料藥的干燥和制成的臨床制劑的干燥。（1 1）

30、常壓干燥）常壓干燥Normal press desiccationNormal press desiccation：通風(fēng)與加熱結(jié)合。成本低干燥量大。但時(shí)間長，易污染。（2 2）減壓干燥）減壓干燥Decompression desiccationDecompression desiccation：利用專用設(shè)備減壓加速，使溶劑迅速蒸發(fā)。（4 4）冷凍干燥）冷凍干燥 Freezing desiccationFreezing desiccation：在低溫(-60 -10)及高真空6.67-40Pa(0.05-0.3mmHg)下,將物料與溶液中的水分直接升華的干燥方法。適用于高度熱敏的生物藥物。制劑應(yīng)

31、具有多孔性、疏松、易溶的特點(diǎn),一般含水量在1%-3%。設(shè)備投資及維護(hù)費(fèi)用高,生產(chǎn)能力不大。 優(yōu)點(diǎn):快速高效,可在無菌條件下操作.應(yīng)用廣泛。 缺點(diǎn):熱利用率不高,設(shè)備費(fèi)用投資大。減壓干燥時(shí)間短，溫度低。制藥常用方法。 （3 3）噴霧干燥）噴霧干燥Spray desiccationSpray desiccation: :將液體通過噴射裝置噴成霧滴后，在一定流速的熱氣流中,迅速蒸發(fā)干燥的方法。從理論推算:每升液體,如果噴成10m直徑的霧滴,約有1.91*1012多個(gè),表面積有600m2。實(shí)驗(yàn)表明:把含水量為80%的1L溶液,噴成直徑約10-60 m霧滴,當(dāng)與熱空氣接觸時(shí),僅3-5s可使霧滴水分氣化而

32、得到干燥產(chǎn)品。 改進(jìn)的干燥設(shè)備;環(huán)型噴射干燥器;振動(dòng)流動(dòng)干燥器;渦流干燥器。n 滅菌：指殺滅或除去一切微生物的操作技術(shù)。1）干熱空氣滅菌：通常在烘箱里利用熱空氣殺滅微生物,在100,1h可殺死繁殖的細(xì)菌。某些細(xì)菌在一定情況下可以變成芽孢,有較強(qiáng)的耐熱力,一般需160-170滅菌1h以上或140滅菌3h以上。 滅菌的時(shí)間應(yīng)自全部進(jìn)行滅菌的物品達(dá)到滅菌溫度時(shí)算起。待滅菌物品的溫度常落后于烘箱室的溫度，特別是導(dǎo)熱性能差或裝量大的待滅菌物品。要確保滅菌完全,應(yīng)測定溫度延后時(shí)間,將延后的時(shí)間考慮到規(guī)定的滅菌時(shí)間內(nèi)。 濕熱滅菌濕熱滅菌：常壓滅菌,即在常壓下用100 流通蒸汽或在水內(nèi)煮沸來殺滅細(xì)菌。 減壓滅

33、菌：在熱壓滅菌器中，用超過101.325kPa的飽和蒸汽殺滅細(xì)菌。n 熱壓滅菌所需溫度、相對壓力和時(shí)間： 115.5 1.7 kgf/cm2 (表壓0.7 kgf/cm2 ）30min 121.5 2.0 kgf/cm2 (表壓1.0 kgf/cm2 ）20min 126.5 2.4 kgf/cm2 (表壓1.4 kgf/cm2 ）15min 紫外線滅紫外線滅菌 主要用于空氣和物體的表面滅菌。一般紫外燈高度距操作臺面不超過1.5m，被滅菌物距燈與臺面的垂直點(diǎn)中心不超過1.5 m。用于室內(nèi)空氣滅菌時(shí)，約6-15m3的空間裝一盞紫外燈。人體若照射紫外線過久會(huì)產(chǎn)生眼結(jié)膜炎、紅斑和皮膚變紅等。故一般均

34、在操作前照射1-2h。若操作時(shí)必須照射時(shí)，對操作人員的眼睛和皮膚要加以防護(hù)。 過濾滅菌過濾滅菌 通過適宜的濾器除去藥液中所含的細(xì)菌.常用有硅藻土濾柱、素瓷濾柱、垂熔玻璃濾器、石棉板呂器和微孔濾膜（纖維素酯膜、聚碳酸酯膜）。濾器孔徑約為0.2m時(shí),滅菌結(jié)果才可靠。適用于不耐熱的藥物溶液的滅菌、除去活菌和死菌。滅菌后的藥液進(jìn)行分裝時(shí),要特別注意防止染菌,應(yīng)進(jìn)行無菌操作。 化學(xué)滅菌化學(xué)滅菌 用化學(xué)藥品抑制或殺滅細(xì)菌的方法。常用其氣體或蒸汽殺滅細(xì)菌的藥品有甲醛、丙二醇、乳酸等,適用于無菌室的空氣滅菌。 生物制藥是利用一定的生物制備技術(shù)從生物材料中獲取特殊的生物活性物質(zhì)的過程。需注意幾個(gè)問題：1.生物材

35、料的組成成分復(fù)雜,各種化合物的形狀/大小/相對分子質(zhì)量和理化性質(zhì)都各不相同,有些還屬于未知.且這些化合物在分離時(shí)仍在不斷的代謝之中。 2.有些化合物含量很低或極微。制備時(shí),原材料用量很大，得到產(chǎn)品很少。 3.生物活性物質(zhì),一旦離開了生物體內(nèi)環(huán)境,很易變性。 4.分離制備的過程幾乎在溶液中進(jìn)行,各種溫度、PH、離子強(qiáng)度等參數(shù),對溶液中各種組成的綜合影響,常常無法固定,有些實(shí)驗(yàn)或工藝設(shè)計(jì)的合理性不強(qiáng),常帶有很大的經(jīng)驗(yàn)成分。因此,要建立重復(fù)性好的成熟工藝,對生物材料、各種試劑及其輔料都要加以嚴(yán)格規(guī)定。 5.生物藥物“均一性”證明與化學(xué)藥物的“純度”是不同的。結(jié)構(gòu)與功能（活性）的關(guān)系？無標(biāo)記的蛋白質(zhì)無

36、標(biāo)記的蛋白質(zhì)- -純化程序純化程序組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)純化程序純化程序第七章第七章 生物制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨生物制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢與希望勢與希望 生物制藥產(chǎn)業(yè)作為21世紀(jì)最具希望和發(fā)展?jié)摿Φ男屡d高技術(shù)產(chǎn)業(yè)，不僅對國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展產(chǎn)生巨大的拉動(dòng)作用，并且為人類的疾病防治帶來更多、更安全、更有效、甚至難以替代的手段?！罢湎完P(guān)注健康”是人類永恒的主題，因此生物制藥產(chǎn)業(yè)將永遠(yuǎn)是“朝陽產(chǎn)業(yè)”。 一一. .哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的生物技術(shù)藥物所占比重越哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的生物技術(shù)藥物所占比重越來越大來越大 生物制藥的發(fā)展初期都是表達(dá)一些分子量較小、結(jié)構(gòu)簡單的蛋白質(zhì),如胰島素、干擾素或集落刺激因子,氨基

37、酸殘基都在200aa以下,一般只有12對二硫鍵甚至沒有二硫鍵,因此用大腸桿菌表達(dá)既經(jīng)濟(jì)有簡便。生物制藥的發(fā)展趨勢是從細(xì)胞因子等激動(dòng)劑為主的產(chǎn)品,轉(zhuǎn)變?yōu)橐赞卓棺饔脼橹鞯男律锛夹g(shù)藥物,如天然IL-1拮抗劑、中和作用的單抗如Remicade、TNF-拮抗劑受體-Fc融合蛋白Enbrel,-1-蛋白水解酶抑制劑、抑制HIV-1與CD4+細(xì)胞融合的Pro-542等。 越來越多的分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的功能性蛋白得到開發(fā),如抗體和酶,都是分子量在50200kDa的糖蛋白。 由于這些蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜,二硫鍵多,并且翻譯后的修飾如糖基化對蛋白活性的影響很大,采用原核表達(dá)系統(tǒng)往往不能滿足蛋白表達(dá)的需要。采用哺乳動(dòng)物細(xì)

38、胞表達(dá)既能保證重組蛋白質(zhì)二硫鍵的正確配對和蛋白質(zhì)折疊、又能保證蛋白質(zhì)的糖基化,即用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白與天然蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上都高度一致。 從2000年以后FDA批準(zhǔn)的生物技術(shù)藥物來看,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更受到FDA和各大制藥公司的重視。我國生物制藥與歐美國家的主要差距就是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品極少。 從銷售情況看，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品也已占據(jù)主要地位，年銷售額超過20億美元的6個(gè)生物技術(shù)藥物均是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品，而銷售額位于前10位的生物技術(shù)藥物，有8個(gè)產(chǎn)品為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品。 隨著近年來越來越多的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的生物技術(shù)藥物獲準(zhǔn)上市，到2007年預(yù)計(jì)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)

39、品市場份額將占70%75%。在中國的生物制藥產(chǎn)業(yè)中，已批準(zhǔn)上市的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品只有促紅細(xì)胞生成素 (EPO)和乙肝疫苗，盡管這兩種產(chǎn)品的使用劑量都在g級水平，但是這兩種產(chǎn)品的生產(chǎn)能力都很小，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已成為生物技術(shù)藥物生產(chǎn)最關(guān)鍵和最具挑戰(zhàn)性的技術(shù)。 由于抗體分子與靶標(biāo)抗原具有高度特異的親和力，抗體類藥物在治療過程中表現(xiàn)出專一性強(qiáng)、毒副作用小等特點(diǎn)，成為各大制藥公司研究開發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。鼠源單抗在臨床試驗(yàn)中療效很不理想，存在以下缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：（1）半壽期很短，只有3040小時(shí)，遠(yuǎn)小于完整人源抗體的半壽期(1021天)，在人體中易被清除。（2）人體免疫細(xì)胞Fc()受體結(jié)合鼠IgG的Fc段

40、的能力很差,不能有效引發(fā)抗體依賴性介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)效應(yīng)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒效應(yīng)(CDC),即不能發(fā)揮抗體的生物學(xué)功能。（3）反復(fù)使用鼠源單抗會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA),HAMA反應(yīng)可以有效快速地破壞這種鼠源單抗,并且HAMA反應(yīng)可能會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。 鼠源抗體人源化技術(shù)的出現(xiàn),大大促進(jìn)了治療性抗體藥物的開發(fā),人源化技術(shù)包括嵌合抗體(chimeric antibody,60%70%人源化)制備技術(shù)和人源化抗體(90%95%人源化)制備技術(shù),用這些技術(shù)制備的抗體克服了鼠源抗體的缺點(diǎn),使得治療性抗體成為目前最大的一類生物技術(shù)藥物。 世紀(jì)90年代中期,FDA批準(zhǔn)了多種抗體類藥物,如嵌合抗體

41、Remicade、Rituxan、ReoPro,人源化抗體如Herceptin、Synagis等。 應(yīng)用噬菌體顯示人抗體庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠Xeno- Mouse技術(shù)可以制備人源抗體,這些技術(shù)又為治療性抗體藥物的研發(fā)提供了新技術(shù)方法。 2002年FDA批準(zhǔn)的用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的單抗HUMIRA,就是使用噬菌體顯示技術(shù)構(gòu)建的人源抗體,標(biāo)志著治療性抗體的研究與開發(fā)又上了一個(gè)新臺階。 2004年,FDA已批準(zhǔn)了17種治療性抗體,2種受體-Fc融合蛋白(抗體樣分子),這些藥物在治療腫瘤、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和Crohns病(克羅恩氏病,節(jié)段性回腸炎)、抗器官移植排斥,防治病毒感染,抗血小板凝聚等方

42、面表現(xiàn)出非常理想的療效。目前抗體類藥物的銷售額已占整個(gè)生物技術(shù)藥物市場的1/5,而到2008年,抗體類藥物的年銷售額將達(dá)到200億美元,占生物技術(shù)藥物市場的1/3。盡管抗體類藥物的發(fā)展如火如荼,但我國抗體藥物的研發(fā)卻舉步為艱,其根本原因是我國上游構(gòu)建和下游生產(chǎn),尤其是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的落后。三、分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)三、分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)的生產(chǎn) 許多遺傳性疾病如血友病、溶酶體貯積病、肺囊性纖維化等都是難于治愈危及生命的疾病,其病因都是基因突變等導(dǎo)致體內(nèi)缺乏某種生理活動(dòng)（代謝過程）所需要的酶。 酶都是分子量大、結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的蛋白質(zhì),在基因工程時(shí)代到來之前,有的只能通過從人

43、體血液或組織中提取才能獲得,不僅來源有限,而且易傳播傳染性疾病,如治療血友病的凝血因子。還有一些非遺傳性疾病,由于某些蛋白的分泌不足導(dǎo)致疾病,如不孕癥?；蛘咛岣吣承┑鞍祝福┑臐舛瓤梢跃徑饣蛑斡承┘膊?如治療心梗的TNK-tPA、治療膿毒癥的蛋白C或治療高尿酸癥的Rasburicase尿酸酶。隨著真核表達(dá)系統(tǒng)的日臻成熟,以及大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步,FDA近年來批準(zhǔn)了多種高分子量的復(fù)雜蛋白藥物。 能挽救生命并且沒有其它替代藥物的生物技術(shù)藥物有著極好的市場表現(xiàn)。例如,全球戈謝病病人只有50006000,而用Cerezyme治療的病例達(dá)到3800,每1例病人1年的藥費(fèi)需要170000美元,1

44、998年銷售額達(dá)到4.7億美元,2001年為5.7億美元,位列當(dāng)年生物技術(shù)銷售額的第10位,2007年可達(dá)9.48億美元。又如2003年4月批準(zhǔn)上市的治療法布萊氏病的Fabrazyme,當(dāng)年的銷售額便達(dá)到0.57億美元,到2007年的銷售額可達(dá)3.97億美元。而凝血因子 NovoSeven和促濾泡素Gonal-F的年銷售額都超過4億美元。表3所列產(chǎn)品絕大多數(shù)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品,除了TNK-tPA正在申請臨床外,表中所列產(chǎn)品我國目前還不具備開發(fā)能力,更遑論生產(chǎn)能力。四、四、 PEG化以改善產(chǎn)品性能化以改善產(chǎn)品性能 對原產(chǎn)品的化學(xué)修飾，尤其是對原產(chǎn)品的化學(xué)修飾，尤其是PEG化以改善產(chǎn)品的化以

45、改善產(chǎn)品的性能，是近年來生物技術(shù)藥物發(fā)展的新趨勢。性能，是近年來生物技術(shù)藥物發(fā)展的新趨勢。 最近幾年FDA幾乎沒有批準(zhǔn)一個(gè)新的細(xì)胞因子類藥物,但是卻批準(zhǔn)了幾個(gè)PEG化的細(xì)胞因子產(chǎn)品(見表4)uPEG化指將聚乙二醇(PEG)分子通過化學(xué)交聯(lián)共價(jià)結(jié)合到多肽或蛋白質(zhì)藥物上,有以下優(yōu)點(diǎn):1）極大延長了藥物半壽期;2）降低了某些藥物的免疫原性;3）增強(qiáng)藥物活性;4）降低藥物毒性;5）血漿的藥物濃度波動(dòng)小,可提高療效;6）可減少給藥次數(shù);7）可改變藥物作用機(jī)制。l90年代批準(zhǔn)的PEG-L-天冬酰胺酶和PEG化酰苷脫氨酶都不是基因重組蛋白,而基因重組的干擾素和G-CSF,其PEG化的產(chǎn)品由于其更好的療效,在

46、市場中都比原產(chǎn)品表現(xiàn)更好。 由于PEG化干擾素的血漿濃度波動(dòng)小,其抗病毒能力遠(yuǎn)好于未PEG化干擾素,如治療丙肝的療效從24%28%提高至50%68%,因此兩種PEG化的干擾素-PEGASYS和VIRAFERON PEG的銷售情況遠(yuǎn)好于原代產(chǎn)品,并有逐漸替代原產(chǎn)品的趨勢。 利用基因工程技術(shù),對已有蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行改造,以獲得性能更好的產(chǎn)品,也是今些年生物技術(shù)藥物發(fā)展的趨勢,這明顯表現(xiàn)在胰島素、EPO和t-PA突變體藥物研究與開發(fā)方面。 Amgen公司利用定點(diǎn)突變技術(shù)開發(fā)的第二代EPO產(chǎn)品Aranesp,與第一代EPO相比,N-糖鏈從3條增加至5條,分子量從30kDa增加到37kDa，其半壽期延長了

47、3倍,因而給藥方式從23次/周改為1次/周,雖然2001年9月才獲準(zhǔn)上市,但該藥品的年銷售額已達(dá)到20億美元,排位第五。 一般速效、中效、長效和雙重胰島素都是通過劑型的改變以改變胰島素的吸收,其生物活性成分都是重組人胰島素。 如2002年10月歐洲共同體授權(quán)Novo Nordisk公司7個(gè)抗糖尿病藥物重組胰島素（rDNA）的更新?lián)Q代產(chǎn)品:長效Insulatard、雙重作用Mintard、長效作用Montard、長效作用Protaphane、非常長效Ultratard、快速作用Velosulin、速效作用Actrapid等。 通過定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建胰島素突變體如速效胰島素Humalog,Novol

48、og和長效胰島素Lantus則是改變胰島素分子結(jié)構(gòu)以改變藥物吸收速度或藥代動(dòng)力學(xué)，從而起到速效或長效的作用。 Humalog就是將胰島素B鏈的Pro28Lys29突變?yōu)長ys28Pro29,而Novolog則是將B鏈的Pro28突變?yōu)锳sp28。 胰島素突變體Humalog、Novolog在皮下注射后具有吸收快、起效快、作用時(shí)間短和餐后尖峰狀的生理學(xué)分泌相似的特點(diǎn),用藥更靈活方便。 Lantus是將胰島素A鏈的Asn21突變?yōu)镚ly21,在B鏈末端增加了Arg31 Arg32兩個(gè)氨基酸,使其成為第一個(gè)真正長效藥物,恒定的藥代動(dòng)力學(xué)（PK）和藥效動(dòng)力學(xué)（PD）時(shí)間至少持續(xù)24h,和相對恒定基線胰

49、島素生理水平相似。 近25年來,一系列新技術(shù)的出現(xiàn)改變了藥品開發(fā)的狀況,帶來了前景和希望。這些技術(shù)包括基因工程、合理藥物設(shè)計(jì)、組合化學(xué)、有效篩分以及現(xiàn)在出現(xiàn)的基因組技術(shù)。 專家們認(rèn)為,藥品研制的失敗率仍然居高不下,由此造成的損失占了研制成本的很大部分。研制過程早期的候選藥物約每5000種才有1種進(jìn)入市場,進(jìn)入臨床試驗(yàn)的藥物每5種才有1種能進(jìn)入市場。其余的藥物則被淘汰掉,因?yàn)橛械牟划a(chǎn)生療效,有的則有毒性。n制藥公司通常在開始時(shí)要確定出研制目標(biāo),目標(biāo)常常是人體中的一種被認(rèn)為對某種疾病起作用的蛋白質(zhì)。然后設(shè)計(jì)出或找到一種能夠依附于目標(biāo)蛋白質(zhì)的化合物,由此來改變疾病發(fā)展過程。弄清這種化合物在其它方面是

50、否合適,比如說是否可以做成藥丸。然后在動(dòng)物身上做毒性試驗(yàn),在此之后方可在人身上做試驗(yàn)。 1)利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)開發(fā)新產(chǎn)品; 2)采用新的高效表達(dá)系統(tǒng)，利用動(dòng)物細(xì)胞，特別是整體動(dòng)物大量表達(dá)基因工程醫(yī)藥產(chǎn)品; 3)將基因組研究成果轉(zhuǎn)化為生物技術(shù)新藥; 4)開發(fā)新劑型的生物技術(shù)藥物。 人類基因組測序工作完成，對人的健康與疾病起因有更深入的認(rèn)識。盡管第一張人類基因組測序工作草圖尚未弄清所有人類基因的功能。但是這些基因產(chǎn)物（即活性蛋白質(zhì)）被表達(dá)出來，將會(huì)有幾千種甚至更多具有特殊療效的蛋白藥物的誕生。因此，基因工程藥物具有很大的增長空間和發(fā)展前景。 1303004500200400600億美元199820

51、012006年全球生物技術(shù)藥品銷售額全球生物技術(shù)藥品銷售額增長情況增長情況18303000100200300億元199019972005年中國生物技術(shù)藥品市場情況中國生物技術(shù)藥品市場情況當(dāng)前全球生物技術(shù)藥品分布當(dāng)前全球生物技術(shù)藥品分布北美6 3 %其他5%歐洲2 5 %日本7 %現(xiàn)狀和前景現(xiàn)狀和前景 據(jù)據(jù)2002年資料顯示，年資料顯示，至今世界上已取得的生至今世界上已取得的生物技術(shù)研究成果中，物技術(shù)研究成果中，70%以上為醫(yī)藥工業(yè)生以上為醫(yī)藥工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品。物技術(shù)產(chǎn)品。生物藥品名稱生物藥品名稱適應(yīng)性適應(yīng)性年銷售額年銷售額(億美元億美元)抗CD3MAb移植排斥0.80DNase囊性纖維變性1.

52、11EPO貧血16.50因子血友病2.50G-CSF嗜中性白細(xì)胞減少癥9.36葡萄糖腦苷酯酶Gaucher氏病2.15 GM-CSF骨髓移植0.41GPb/aMAb血管造形術(shù)中血凝塊1.30B型肝炎疫苗B型肝炎10.00人生長激素生長不良，腎功能不全4.50人胰島素糖尿糖7.00人白細(xì)胞介素-2腎癌0.40-干擾素癌癥，肝炎7.00-干擾素多發(fā)性硬化2.55-干擾素肉芽腫病0.04tPA心力衰竭/栓塞/中風(fēng)3.00總計(jì)68.6216種生物技術(shù)藥物銷售情況種生物技術(shù)藥物銷售情況 我國已批準(zhǔn)生產(chǎn)的生物技術(shù)藥物和疫苗我國已批準(zhǔn)生產(chǎn)的生物技術(shù)藥物和疫苗 名稱名稱 作作 用用rhu IFN1b (外用)

53、 病毒性角膜炎rhu IFN1b 乙肝、丙肝rhu IFN2a 乙肝、丙肝、皰疹等rhu IFN2a (酵母) 乙肝、丙肝rhu IFN2b 乙肝、丙肝白血病等rhu IFN2a (栓劑) 婦科病rhu IFN2b (凝膠劑) 皰疹等rhu IFN 類風(fēng)濕rhu EGF(外用) 燒傷、創(chuàng)傷EGF 衍生物 燒傷、創(chuàng)傷rhu IL2 癌癥輔助治療rhu IL2 125Ser 癌癥輔助治療上海華晨rhu GCSF 刺激產(chǎn)生白細(xì)胞rhu GMCSF 刺激產(chǎn)生白細(xì)胞、骨髓移植rhu EPO 產(chǎn)生紅細(xì)胞rhu GH 矮小病bFGF(外用) 創(chuàng)傷、燒傷RSK 溶血栓(心梗) 抗IL28 單 抗乳膏劑 銀屑病

54、人胰島素 糖尿病乙肝疫苗乙肝疫苗 預(yù)防乙肝預(yù)防乙肝痢疾疫苗 預(yù)防痢疾第二節(jié)第二節(jié) 新型生物藥物研制的理論和新型生物藥物研制的理論和方法方法新型生物藥物新型生物藥物是指利用是指利用生物體或生物過程生物體或生物過程產(chǎn)產(chǎn)生的生的結(jié)構(gòu)新穎結(jié)構(gòu)新穎的藥物。的藥物。結(jié)構(gòu)新穎結(jié)構(gòu)新穎是指與以前是指與以前藥物有著不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是藥物有著不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是種新的化學(xué)種新的化學(xué)實(shí)體實(shí)體(New chemical entity(New chemical entity，簡稱，簡稱NCE)NCE)。這。這類新型生物藥物國家認(rèn)定為一類新藥。國際類新型生物藥物國家認(rèn)定為一類新藥。國際上所說的新藥開發(fā)就是指開發(fā)上所說的新藥

55、開發(fā)就是指開發(fā)NCENCE藥物。根藥物。根據(jù)據(jù)NCENCE來源進(jìn)行生物藥物分類。來源進(jìn)行生物藥物分類。一類是一類是利用重組利用重組DNADNA技術(shù)技術(shù)，向大腸桿菌、酵，向大腸桿菌、酵母、動(dòng)物、植物細(xì)胞中導(dǎo)入目的基因，母、動(dòng)物、植物細(xì)胞中導(dǎo)入目的基因，構(gòu)建構(gòu)建重組細(xì)胞重組細(xì)胞，生產(chǎn)目的基因編碼的蛋白質(zhì)類、，生產(chǎn)目的基因編碼的蛋白質(zhì)類、多肽類藥物或疫苗，或?qū)⒁恍┨厥饣蚣盎嚯念愃幬锘蛞呙?，或?qū)⒁恍┨厥饣蚣盎蚱螌?dǎo)入宿主細(xì)胞后使宿主細(xì)胞產(chǎn)生原來因片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞后使宿主細(xì)胞產(chǎn)生原來不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，獲得新功能，或阻遏宿不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，獲得新功能，或阻遏宿主細(xì)胞基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等，抑制其

56、主細(xì)胞基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等，抑制其功能，甚至殺死宿主細(xì)胞，即功能，甚至殺死宿主細(xì)胞，即。另一類是另一類是利用微生物、動(dòng)植物細(xì)胞或酶生產(chǎn)利用微生物、動(dòng)植物細(xì)胞或酶生產(chǎn)的非上述藥品，通過的非上述藥品，通過篩選篩選可獲得這類新藥的可獲得這類新藥的NCENCE的的先異物先異物(Lead compound)(Lead compound)。這類藥物種。這類藥物種類繁多，包括傳統(tǒng)的利用發(fā)酵工程生產(chǎn)的藥類繁多，包括傳統(tǒng)的利用發(fā)酵工程生產(chǎn)的藥物和直接從動(dòng)植物中提取的天然藥品等。物和直接從動(dòng)植物中提取的天然藥品等。(1) (1) 確定研究計(jì)劃確定研究計(jì)劃 要綜合考慮醫(yī)療、市場、要綜合考慮醫(yī)療、市場、化學(xué)的評估

57、化學(xué)的評估, ,文獻(xiàn)狀況文獻(xiàn)狀況, ,專利的檢索專利的檢索, ,結(jié)構(gòu)的選結(jié)構(gòu)的選擇，合成的前景等因素。擇，合成的前景等因素。(2) (2) 準(zhǔn)備化合物準(zhǔn)備化合物 文獻(xiàn)研究文獻(xiàn)研究, ,合成或分離合成或分離, ,結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)鑒定鑒定, ,標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化, ,專利申請專利申請, ,對研究目標(biāo)的復(fù)核等。對研究目標(biāo)的復(fù)核等。以上兩個(gè)環(huán)節(jié)需占用以上兩個(gè)環(huán)節(jié)需占用l l2 2年的時(shí)間，需準(zhǔn)備年的時(shí)間，需準(zhǔn)備6000600080008000個(gè)化合物供篩選。個(gè)化合物供篩選。(3) (3) 藥理篩選藥理篩選。(4) (4) 化學(xué)試驗(yàn)化學(xué)試驗(yàn) 活性成分的分析。活性成分的分析。(5) (5) 臨床前臨床前期期(Precl

58、inical I) (Preclinical I) 進(jìn)一步藥進(jìn)一步藥理研究包括毒性理研究包括毒性(2(2種動(dòng)物種動(dòng)物) )及活性成分的穩(wěn)及活性成分的穩(wěn)定性。定性。(6) (6) 臨床前臨床前期期(Preclinical ) (Preclinical ) 進(jìn)一步藥進(jìn)一步藥理研究包括亞急性毒性理研究包括亞急性毒性(2(2種動(dòng)物種動(dòng)物) )、畸胎學(xué)、畸胎學(xué)研究、藥物動(dòng)力學(xué)、動(dòng)物體內(nèi)的吸收和排泄、研究、藥物動(dòng)力學(xué)、動(dòng)物體內(nèi)的吸收和排泄、劑型的研究與開發(fā)、包裝與保存期的研究。劑型的研究與開發(fā)、包裝與保存期的研究。以上幾個(gè)環(huán)節(jié)占用以上幾個(gè)環(huán)節(jié)占用2 23 3年的時(shí)間，化合物分年的時(shí)間，化合物分別剩下大約別

59、剩下大約2020個(gè)以下或更少。個(gè)以下或更少。(10) (10) 注冊申請上市注冊申請上市 經(jīng)政府藥政部門批準(zhǔn)后經(jīng)政府藥政部門批準(zhǔn)后提供治療應(yīng)用。這一過程需提供治療應(yīng)用。這一過程需2 23 3年。年。(11) (11) 售后監(jiān)測售后監(jiān)測(Post(Postmarketing marketing surveillance) surveillance) 據(jù)情況進(jìn)行藥理試驗(yàn)、毒性據(jù)情況進(jìn)行藥理試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、特殊試驗(yàn)和藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)；對副作試驗(yàn)、特殊試驗(yàn)和藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)；對副作用的報(bào)告進(jìn)行收集、評價(jià)和鑒別；對藥品生用的報(bào)告進(jìn)行收集、評價(jià)和鑒別；對藥品生產(chǎn)進(jìn)行質(zhì)量控制，制劑的生產(chǎn)和包裝。產(chǎn)進(jìn)行質(zhì)量控制，

60、制劑的生產(chǎn)和包裝。一個(gè)新藥的問世要提供一個(gè)新藥的問世要提供6000600080008000個(gè)化學(xué)物個(gè)化學(xué)物質(zhì)。經(jīng)歷質(zhì)。經(jīng)歷9 91313年的時(shí)間，耗資約年的時(shí)間，耗資約2.32.3億美元。億美元。系統(tǒng)性從縱的方面看主要是若干個(gè)環(huán)節(jié)緊密系統(tǒng)性從縱的方面看主要是若干個(gè)環(huán)節(jié)緊密的銜接和重疊，橫的方向主要表現(xiàn)為多種學(xué)的銜接和重疊，橫的方向主要表現(xiàn)為多種學(xué)科相互之間的滲透性和協(xié)同性?？葡嗷ブg的滲透性和協(xié)同性。在整個(gè)新藥的研究和開發(fā)中，先導(dǎo)化合物的在整個(gè)新藥的研究和開發(fā)中，先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)是決定以后研究與開發(fā)的首要因素，要發(fā)現(xiàn)是決定以后研究與開發(fā)的首要因素，要找到一個(gè)好的先導(dǎo)化合物，需要建立好的找到一個(gè)