小鼠成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)

1、-作者xxxx-日期xxxx小鼠成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)【精品文檔】實驗-小鼠成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)1掌握哺乳動物細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)中的取材、消化及無菌操作等基本實驗技術(shù)和操作過程。2熟悉在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況的方法。3了解細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的原理和方法。自17世紀(jì)下半葉Robert Hooke提出“細(xì)胞”概念直至20世紀(jì)中葉，細(xì)胞培養(yǎng)（Cell culture）才逐漸發(fā)展起來?，F(xiàn)代生命科學(xué)以及相關(guān)領(lǐng)域的研究前提是細(xì)胞的維持和增殖，因此，細(xì)胞培養(yǎng)不僅是細(xì)胞生物學(xué)的密不可分的組成部分，而且已經(jīng)成為生物化學(xué)、生物物理學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)、

2、甚至臨床醫(yī)學(xué)的重要內(nèi)容。細(xì)胞培養(yǎng)也是細(xì)胞生物學(xué)延伸至相關(guān)學(xué)科的一條主要途徑。如今，細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究最常用的基礎(chǔ)技術(shù)之一。細(xì)胞培養(yǎng)是模擬機(jī)體內(nèi)生理條件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下，使其生存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。細(xì)胞培養(yǎng)的直接目的是維持或擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量。依據(jù)取材于動物組織或培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。1原代培養(yǎng)（primary culture）是從供體取得組織或細(xì)胞后在體外進(jìn)行首次培養(yǎng)直至成功地進(jìn)行首次傳代之前的培養(yǎng)。但實際上通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)是建立細(xì)胞系的第一步，其最基

3、本的方法有兩種：組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。組織塊培養(yǎng)法是指直接從機(jī)體取下組織和器官，通過組織塊直接長出單層細(xì)胞，該培養(yǎng)法是最常用的原代培養(yǎng)方法，其將剛剛離體的、生長活力旺盛的組織剪成小塊接種在培養(yǎng)瓶中作為實驗材料，一天后細(xì)胞可從貼壁的組織塊四周游出并生長。組織塊培養(yǎng)法操作過程簡便、易行，培養(yǎng)的細(xì)胞較易存活，適用于一些來源有限、數(shù)量較少的組織的原代培養(yǎng)。消化培養(yǎng)法利用酶或機(jī)械方法將組織分散成單個細(xì)胞后，在不加任何粘附劑的情況下，直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基立即進(jìn)行培養(yǎng)的方法。該方法主要使用生物化學(xué)手段將較小體積的動物組織中妨礙細(xì)胞生長的間質(zhì)加以分解、消化，使組織中結(jié)合緊密的細(xì)胞連接松散、相互

4、分離，細(xì)胞失去與間質(zhì)的連接，活細(xì)胞從組織中釋放出來形成含單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的懸液，分散的細(xì)胞易與外界進(jìn)行新陳代謝互動，在短時間內(nèi)即可貼壁生長成片。胰蛋白酶主要適用于一些間質(zhì)少、較軟的組織如上皮、肝、腎和胚胎等，膠原酶主要適用于纖維組織、一些較硬的癌組織等的消化中。原代培養(yǎng)最大的優(yōu)點是，組織和細(xì)胞剛剛離體，細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，一定程度上更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)，可為研究生物體細(xì)胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段。一般說來，幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞，如動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng)。2傳代培養(yǎng) （subculture）是原代培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞株在體外獲得穩(wěn)定大量

5、同種細(xì)胞并維持細(xì)胞種延續(xù)的過程。當(dāng)原代培養(yǎng)成功后，培養(yǎng)的細(xì)胞通過增殖達(dá)到一定數(shù)量后，必需對細(xì)胞從原培養(yǎng)瓶中加以分離，經(jīng)稀釋后再接種于新的培養(yǎng)瓶中，這一過程即為傳代培養(yǎng)，亦稱為繼代培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)。如果原代細(xì)胞是正常細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞不斷分裂，形成的單層細(xì)胞匯合，細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另外，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，加之代謝物積累也不利于細(xì)胞生長或發(fā)生中毒。此時，就需要將將培養(yǎng)細(xì)胞從原培養(yǎng)器中取出，加以分離，以12或13以上比率轉(zhuǎn)移到另外培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)，此過程稱為傳代（passage）。原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后即成為細(xì)胞系，

6、由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系組成。細(xì)胞傳代后一般經(jīng)三個階段：游離期；指數(shù)增生期和停止期。培養(yǎng)細(xì)胞的“一代”是指傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)，其與細(xì)胞世代或倍增不同，細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)大培養(yǎng)的1代中，細(xì)胞約能倍增36次。細(xì)胞增殖的旺盛程度通常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)100個細(xì)胞。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.20.5，腫瘤細(xì)胞可達(dá)35。細(xì)胞接種23d時分裂增殖旺盛，是活力最好時期，稱指數(shù)增生期（對數(shù)生長期），適宜進(jìn)行各種試驗。體外培養(yǎng)細(xì)胞和生長類型不同，傳代培養(yǎng)的方法也不同。貼附型生長的細(xì)胞要先進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液再傳代；而懸浮型生長的細(xì)胞可直接傳代，或離心后傳代。3細(xì)胞活力測定：在標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)和實

7、驗條件下，細(xì)胞數(shù)目及活力測定極其重要。1983年Mosmann首次應(yīng)用MTT比色法檢測培養(yǎng)細(xì)胞活力。MTT的化學(xué)名稱為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍(lán)。其具有接受氫原子而發(fā)生顯色反應(yīng)。檢測原理為，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使琥珀酸脫氫，脫下的H通過受氫體傳遞，能使外源性染料MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，并沉積在細(xì)胞中。細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物可以溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，并表現(xiàn)為一定的色度。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，并根據(jù)光吸收值的高低判斷活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，光吸收值與活細(xì)胞數(shù)成正比。死細(xì)胞內(nèi)酶失去活性，故無

8、此功能。該檢測方法靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便、經(jīng)濟(jì)安全，具有良好的相關(guān)性。廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。1材料：乳鼠、HeLa細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）。2器材：超凈工作臺、解剖器材、酒精燈、離心管、移液管、吸管、燒杯、大平皿、96孔培養(yǎng)板、不銹鋼濾網(wǎng)（100目、200目）、水浴箱、血細(xì)胞計數(shù)板、培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、蓋玻片，擦鏡紙，香柏油、倒置相差顯微鏡、顯微鏡、全自動酶標(biāo)儀（bio-rad550型）。3試劑：（1）75乙醇（2）PBS液（pH7.2）配方：Nacl 8g、Kcl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、K

9、H2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4定容1L（3）無鈣、鎂離子PBS液（4）D-HanK液（無鈣、鎂離子的HanK液）（5）消化液（0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA各1份）（6）0.25胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶0.25g、D-Hanks液100ml,pH7.4）（7）0.4%臺盼藍(lán)、（8）培養(yǎng)液：EMEM培養(yǎng)液（Eagles Minimum Essential Medium Eagle氏最低要求培養(yǎng)基）：EMEM85份，小牛血清15份，加入青霉素、鏈霉素貯存液1份，使青霉素、鏈霉素的最終濃度分別為100單位及100 ng/ml。EMEM培養(yǎng)基可選用各種商品供應(yīng)之粉末培養(yǎng)基，按生產(chǎn)廠商提供資

10、料配制并除茵。4冰箱貯存。DMEM（Dulbeccos Modification of Eagles Medium）：RPMI1640培養(yǎng)液（90%RPMI 1640、10%胎牛血清、雙抗（青霉素,鏈霉素）100單位/ml 7.4%NaHCO3調(diào)pH至7.0）RPMI1640維持液（5%胎牛血清、余同上）（9）0.5%MTT 溶液（5mg/ml）、m濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4 避光保存兩周內(nèi)有效。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。最好現(xiàn)用現(xiàn)配。（10）二甲基亞砜（11）碘伏 原代培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)法:1動物處死取新生大鼠（出生23天）一只，用頸椎脫臼法處死；為避免過多血細(xì)胞的干擾，

11、也可采用剪斷頸動脈放血的方法處死。然后，把新生大鼠浸入盛有75乙醇的燒杯中2-3秒，取出后放在大平皿中攜入超凈工作臺。2取材用碘酒和75乙醇再次消毒一次，打開消毒器械包 用鑷子新生大鼠腹部皮膚,用解剖剪開腹腔,充分暴露腹腔；用另一鑷子輕輕夾起腸管,翻置一側(cè),充分暴露位于腹腔背壁脊柱兩側(cè)的腎臟（右腎略低）；取下雙側(cè)腎臟,放入消毒培養(yǎng)皿中。（或取出肝組織置于培養(yǎng)皿中。）3剪切剪開腎膜，剝向腎門，去除腎膜及脂肪；用吸管吸取滅菌PBS（或Hanks液）將腎臟清洗3次，去除血污；將腎臟移入另一平皿中，沿縱軸剪開腎臟，剪去腎盂，用眼科剪將腎組織反復(fù)剪碎，直到剪成0.51mm3組織塊；用吸管加23滴培養(yǎng)液輕

12、輕吹打，使組織塊懸浮在培養(yǎng)液中。（或肝組織用Hanks液反復(fù)沖洗，以除去血細(xì)胞，將肝組織移入另一個培養(yǎng)皿中，用吸管吸取0.5ml培養(yǎng)基置于肝組織上，用另一眼科剪將其剪成0.51mm3組織塊。）4接種：用彎頭吸管小心分次吸取組織塊，使組織塊吸在吸管端部，要避免吸得過高，組織塊粘附于吸管壁而丟失。將組織塊均勻排布在培養(yǎng)瓶底部，控制組織塊間距在0.5cm左右，每25ml培養(yǎng)瓶底可擺布1520塊。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底向上，翻瓶時勿使組織塊流動，加入23ml培養(yǎng)液（液層厚約15mm），塞好瓶塞，置CO2培養(yǎng)箱37培養(yǎng)23h,（勿超過4h）。此時組織塊略干燥，能貼附于瓶壁上。5. 培養(yǎng)：慢慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，

13、使培養(yǎng)液浸泡附于瓶底的組織塊，置培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。操作過程中動作一定要輕，減少振動，使培養(yǎng)液慢慢覆蓋組織塊，否則會使組織塊脫落，影響貼壁培養(yǎng)。6觀察24小時后取出觀察，移動培養(yǎng)瓶時要盡量使培養(yǎng)液震蕩撞擊組織塊。在顯微鏡下觀察已貼壁的組織塊有無細(xì)胞長出。消化培養(yǎng)法:1處死動物、取材及剪切：與組織塊培養(yǎng)法相同。剪切后的組織塊再用滅菌的PBS（或Hanks液）清洗數(shù)次，直到PBS澄清為止。移入無菌離心管中，靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉到管底，棄上清。2消化及分散組織塊按組織塊體積510倍量，吸取0.25胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液加到含組織塊的無菌離心管中，與組織塊混勻后，加蓋無菌塞子密封，

14、置37水浴中消化1020min，其間每5min搖動一次，使組織塊散開并與消化液充分接觸。當(dāng)組織塊變得疏松、顏色略白時，從水浴中取出離心管，在超凈工作臺內(nèi)靜置后吸去含胰蛋白酶的上清（此步驟可以在8001000rpm離心35min去除含胰蛋白酶的上清），加入23ml培養(yǎng)液，終止消化。用吸管反復(fù)吹打，直到大部分組織塊分散成單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)狀態(tài)為止。最后將此細(xì)胞懸液用100目、200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾至燒杯中。3計數(shù)及稀釋：從過濾的細(xì)胞懸液中取1ml，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的細(xì)胞密度以51051106為宜。4接種培養(yǎng)：將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中，一般25ml小方瓶分

15、裝45ml,青霉素瓶分裝1ml。培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，培養(yǎng)瓶蓋旋緊后再松半個螺旋，置CO2培養(yǎng)箱在37培養(yǎng)。5觀察：接種培養(yǎng)后要每日觀察培養(yǎng)液是否污染、顏色變化及細(xì)胞生長狀況。培養(yǎng)液黃色且混濁表示污染，紫紅色表明細(xì)胞生長不良，桔紅色表明細(xì)胞生長良好。傳代培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng):1準(zhǔn)備從培養(yǎng)箱中取出原代培養(yǎng)細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，確認(rèn)已長成致密單層、生長良好，適宜傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶連同所需實驗用品備齊，放入超凈工作臺內(nèi)，所有實驗操作均在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。2.消化棄去原代培養(yǎng)瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液，加入適量無鈣、鎂離子PBS液（或Hanks液），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，清洗殘留在細(xì)胞表面培養(yǎng)液和碎片，棄去清洗液。在培養(yǎng)

16、瓶內(nèi)加入消化液（0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA各1份）約23ml,以液面蓋滿細(xì)胞為宜。培養(yǎng)瓶置室溫或培養(yǎng)箱內(nèi)23min后，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間間隙增大時，或翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶肉眼觀察，細(xì)胞單層出現(xiàn)針孔大小的縫隙，則快速棄去消化液；如未出現(xiàn)縫隙，則繼續(xù)消化，直到出現(xiàn)縫隙。向培養(yǎng)瓶中加入PBS液（或Hanks液），輕轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶清洗殘留的消化液后倒掉PBS液（或Hanks液）。3分裝在培養(yǎng)瓶內(nèi)加入新配制的培養(yǎng)液約3ml，并用吸管反復(fù)吹打瓶壁，至細(xì)胞層全部脫落，再輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞散開。吹打時應(yīng)按一定的順序進(jìn)行，即從培養(yǎng)瓶底部的一側(cè)開始吹打至另一側(cè)結(jié)束，盡量

17、使每個部位的細(xì)胞都能被吹到。吹打時不能太用力，盡量不產(chǎn)生氣泡，避免損傷細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)貼壁細(xì)胞均已懸浮于培養(yǎng)液中，且細(xì)胞已分散單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)時，終止吹打。取細(xì)胞懸液計數(shù)并用臺盼藍(lán)染色，計算細(xì)胞密度及細(xì)胞活力，據(jù)此對細(xì)胞懸液補(bǔ)加適量培養(yǎng)液稀釋，調(diào)整細(xì)胞密度為11051106 /ml，將其分裝到2瓶或多瓶中。原代培養(yǎng)的細(xì)胞首次傳代時，細(xì)胞密度宜大些，以使細(xì)胞盡快適應(yīng)新的環(huán)境，利于細(xì)胞生存和增殖。如原培養(yǎng)瓶為5ml培養(yǎng)液，分裝2瓶時，則需補(bǔ)加培養(yǎng)液到10ml，混勻后分一半到另一培養(yǎng)瓶中。在分裝好的培養(yǎng)瓶上標(biāo)明日期、細(xì)胞代號等標(biāo)志。4培養(yǎng)與觀察輕輕搖動分裝好的培養(yǎng)瓶，置CO2培養(yǎng)箱37

18、培養(yǎng)。接種后要每日觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞生長狀況，通常，細(xì)胞傳代培養(yǎng)2h左右，細(xì)胞即能貼壁生長，24h可形成單層。培養(yǎng)過程中，可通過0.5%臺盼藍(lán)染色了解培養(yǎng)細(xì)胞中死、活細(xì)胞的比例。懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng):少數(shù)細(xì)胞，如某些癌細(xì)胞、血液中白細(xì)胞，體外培養(yǎng)時為懸浮生長、不貼壁，其傳代培養(yǎng)的方法不同于貼壁生長的細(xì)胞，可通過離心收集細(xì)胞后傳代或直接傳代。1離心傳代超凈工作臺內(nèi)用吸管將培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞吹打均勻，如有半貼壁的細(xì)胞應(yīng)將其吹打下來。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，平衡后8001000/min離心5min，棄上清，加適量新配制的培養(yǎng)液打勻成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)，按1：2或1：3的比例將細(xì)胞懸液稀釋，分裝于

19、新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)及觀察等操作同貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。2直接傳代讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀到瓶底，棄去上清液1/21/3后，用吸管吹打成細(xì)胞懸液，其后的操作同上。培養(yǎng)細(xì)胞活力測定1接種細(xì)胞：用0.25%胰蛋白酶消化HeLa細(xì)胞，并用培養(yǎng)基制成單個細(xì)胞懸液，以5104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200l，5%CO2、37培養(yǎng)天。整個實驗分為3個組：加藥實驗組、不加藥對照組及不接種細(xì)胞也不加藥的空白組。每組8個復(fù)孔。培養(yǎng)24h實驗組加藥處理。繼續(xù)培養(yǎng)至72h。2染色：每孔加入20l 0.5%MTT 溶液（5mg/ml），若實驗組所加藥物能與MTT反應(yīng)，應(yīng)先離心棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，

20、再加入含MTT的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)4h。3離心：與另一96孔板平衡后，1000r/min，離心10min ，用力甩去上清。4溶解：每孔加入200l二甲基亞砜，避光振蕩10min，以溶解紫色結(jié)晶。5測定：用全自動酶標(biāo)儀（bio-rad550型）測定波長570nm（490nm?）處各孔的吸光值（OD值）。實驗組和對照組OD值以空白組OD值調(diào)零。6計算實驗組細(xì)胞存活率、抑制率：細(xì)胞存活率越小，說明實驗組藥物的作用強(qiáng)度越大；抑制率越大，說明實驗組藥物的作用強(qiáng)度越大。計算公式如下：細(xì)胞存活率=（實驗組OD值/對照組OD值）100%抑制率=（對照組OD值一實驗組OD值）/對照組OD值100%1組織塊法培養(yǎng)細(xì)

21、胞的觀察培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下可觀察到組織塊周圍開始有少量的細(xì)胞。一般最先長出形態(tài)不規(guī)則的游走細(xì)胞，接著長出成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞，隨著細(xì)胞的延長，組織塊周圍形成較大的生長暈，以后細(xì)胞生長加快，呈放射狀向外擴(kuò)展逐漸連成一片（圖7-1）。即有少量細(xì)胞從組織塊周圍游離而出，當(dāng)細(xì)胞從組織塊游出量增時，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液顏色，補(bǔ)加或更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)液表面如有漂浮的組織塊，要及時吸棄。細(xì)胞生長良好時，1015天可長成致密單層，需傳代培養(yǎng)。圖7-1 組織塊周圍細(xì)胞呈放射狀向外擴(kuò)展2胰蛋白酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞的觀察正常情況下，倒置顯微鏡下可觀察剛接種的細(xì)胞均呈圓形懸浮于培養(yǎng)液中，接種24h后可見許多細(xì)胞貼壁，細(xì)胞由圓形懸浮狀態(tài)伸展成梭形（圖7-2，圖7-3）；若細(xì)胞生長不良或培養(yǎng)液變紅，應(yīng)在無菌條件下，更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)34d時，細(xì)胞增殖旺盛，數(shù)量增多，細(xì)胞透明，顆粒少，界限清楚，可見細(xì)胞島形成；此時若培養(yǎng)液變黃、澄清，表明細(xì)胞生長，但營養(yǎng)成分不足，代謝產(chǎn)物堆積，CO2增多，可更換