小鼠成纖維細胞原代培養(yǎng)

1、-作者xxxx-日期xxxx小鼠成纖維細胞原代培養(yǎng)【精品文檔】實驗-小鼠成纖維細胞的原代培養(yǎng)1掌握哺乳動物細胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)中的取材、消化及無菌操作等基本實驗技術和操作過程。2熟悉在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)和生長狀況的方法。3了解細胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的原理和方法。自17世紀下半葉Robert Hooke提出“細胞”概念直至20世紀中葉，細胞培養(yǎng)（Cell culture）才逐漸發(fā)展起來?，F代生命科學以及相關領域的研究前提是細胞的維持和增殖，因此，細胞培養(yǎng)不僅是細胞生物學的密不可分的組成部分，而且已經成為生物化學、生物物理學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、生理學、分子生物學和神經科學、

2、甚至臨床醫(yī)學的重要內容。細胞培養(yǎng)也是細胞生物學延伸至相關學科的一條主要途徑。如今，細胞培養(yǎng)已經成為生命科學和醫(yī)學研究最常用的基礎技術之一。細胞培養(yǎng)是模擬機體內生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下，使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。細胞培養(yǎng)的直接目的是維持或擴增細胞數量。依據取材于動物組織或培養(yǎng)細胞，細胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。1原代培養(yǎng)（primary culture）是從供體取得組織或細胞后在體外進行首次培養(yǎng)直至成功地進行首次傳代之前的培養(yǎng)。但實際上通常把第一代至第十代以內的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)是建立細胞系的第一步，其最基

3、本的方法有兩種：組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。組織塊培養(yǎng)法是指直接從機體取下組織和器官，通過組織塊直接長出單層細胞，該培養(yǎng)法是最常用的原代培養(yǎng)方法，其將剛剛離體的、生長活力旺盛的組織剪成小塊接種在培養(yǎng)瓶中作為實驗材料，一天后細胞可從貼壁的組織塊四周游出并生長。組織塊培養(yǎng)法操作過程簡便、易行，培養(yǎng)的細胞較易存活，適用于一些來源有限、數量較少的組織的原代培養(yǎng)。消化培養(yǎng)法利用酶或機械方法將組織分散成單個細胞后，在不加任何粘附劑的情況下，直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基立即進行培養(yǎng)的方法。該方法主要使用生物化學手段將較小體積的動物組織中妨礙細胞生長的間質加以分解、消化，使組織中結合緊密的細胞連接松散、相互

4、分離，細胞失去與間質的連接，活細胞從組織中釋放出來形成含單細胞或細胞團的懸液，分散的細胞易與外界進行新陳代謝互動，在短時間內即可貼壁生長成片。胰蛋白酶主要適用于一些間質少、較軟的組織如上皮、肝、腎和胚胎等，膠原酶主要適用于纖維組織、一些較硬的癌組織等的消化中。原代培養(yǎng)最大的優(yōu)點是，組織和細胞剛剛離體，細胞保持原有細胞的基本性質，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，一定程度上更接近于生物體內的生活狀態(tài)，可為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段。一般說來，幼稚狀態(tài)的組織和細胞，如動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養(yǎng)。2傳代培養(yǎng) （subculture）是原代培養(yǎng)細胞或細胞株在體外獲得穩(wěn)定大量

5、同種細胞并維持細胞種延續(xù)的過程。當原代培養(yǎng)成功后，培養(yǎng)的細胞通過增殖達到一定數量后，必需對細胞從原培養(yǎng)瓶中加以分離，經稀釋后再接種于新的培養(yǎng)瓶中，這一過程即為傳代培養(yǎng)，亦稱為繼代培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)。如果原代細胞是正常細胞，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，形成的單層細胞匯合，細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另外，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，加之代謝物積累也不利于細胞生長或發(fā)生中毒。此時，就需要將將培養(yǎng)細胞從原培養(yǎng)器中取出，加以分離，以12或13以上比率轉移到另外培養(yǎng)器皿（瓶）內擴大培養(yǎng)，此過程稱為傳代（passage）。原代培養(yǎng)細胞經首次傳代成功后即成為細胞系，

6、由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系組成。細胞傳代后一般經三個階段：游離期；指數增生期和停止期。培養(yǎng)細胞的“一代”是指傳代培養(yǎng)的累積次數，其與細胞世代或倍增不同，細胞轉移擴大培養(yǎng)的1代中，細胞約能倍增36次。細胞增殖的旺盛程度通常用細胞分裂指數表示，即細胞群的分裂相數100個細胞。一般細胞分裂指數介于0.20.5，腫瘤細胞可達35。細胞接種23d時分裂增殖旺盛，是活力最好時期，稱指數增生期（對數生長期），適宜進行各種試驗。體外培養(yǎng)細胞和生長類型不同，傳代培養(yǎng)的方法也不同。貼附型生長的細胞要先進行消化，制成細胞懸液再傳代；而懸浮型生長的細胞可直接傳代，或離心后傳代。3細胞活力測定：在標準化培養(yǎng)和實

7、驗條件下，細胞數目及活力測定極其重要。1983年Mosmann首次應用MTT比色法檢測培養(yǎng)細胞活力。MTT的化學名稱為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍。其具有接受氫原子而發(fā)生顯色反應。檢測原理為，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使琥珀酸脫氫，脫下的H通過受氫體傳遞，能使外源性染料MTT還原為不溶性的藍紫色結晶物，并沉積在細胞中。細胞中的藍紫色結晶物可以溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，并表現為一定的色度。用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，并根據光吸收值的高低判斷活細胞數量。在一定細胞數范圍內，光吸收值與活細胞數成正比。死細胞內酶失去活性，故無

8、此功能。該檢測方法靈敏度高、重復性好、操作簡便、經濟安全，具有良好的相關性。廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。1材料：乳鼠、HeLa細胞（人宮頸癌細胞）。2器材：超凈工作臺、解剖器材、酒精燈、離心管、移液管、吸管、燒杯、大平皿、96孔培養(yǎng)板、不銹鋼濾網（100目、200目）、水浴箱、血細胞計數板、培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、離心機、蓋玻片，擦鏡紙，香柏油、倒置相差顯微鏡、顯微鏡、全自動酶標儀（bio-rad550型）。3試劑：（1）75乙醇（2）PBS液（pH7.2）配方：Nacl 8g、Kcl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、K

9、H2PO4 0.24g調pH 7.4定容1L（3）無鈣、鎂離子PBS液（4）D-HanK液（無鈣、鎂離子的HanK液）（5）消化液（0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA各1份）（6）0.25胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶0.25g、D-Hanks液100ml,pH7.4）（7）0.4%臺盼藍、（8）培養(yǎng)液：EMEM培養(yǎng)液（Eagles Minimum Essential Medium Eagle氏最低要求培養(yǎng)基）：EMEM85份，小牛血清15份，加入青霉素、鏈霉素貯存液1份，使青霉素、鏈霉素的最終濃度分別為100單位及100 ng/ml。EMEM培養(yǎng)基可選用各種商品供應之粉末培養(yǎng)基，按生產廠商提供資

10、料配制并除茵。4冰箱貯存。DMEM（Dulbeccos Modification of Eagles Medium）：RPMI1640培養(yǎng)液（90%RPMI 1640、10%胎牛血清、雙抗（青霉素,鏈霉素）100單位/ml 7.4%NaHCO3調pH至7.0）RPMI1640維持液（5%胎牛血清、余同上）（9）0.5%MTT 溶液（5mg/ml）、m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4 避光保存兩周內有效。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。最好現用現配。（10）二甲基亞砜（11）碘伏 原代培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)法:1動物處死取新生大鼠（出生23天）一只，用頸椎脫臼法處死；為避免過多血細胞的干擾，

11、也可采用剪斷頸動脈放血的方法處死。然后，把新生大鼠浸入盛有75乙醇的燒杯中2-3秒，取出后放在大平皿中攜入超凈工作臺。2取材用碘酒和75乙醇再次消毒一次，打開消毒器械包 用鑷子新生大鼠腹部皮膚,用解剖剪開腹腔,充分暴露腹腔；用另一鑷子輕輕夾起腸管,翻置一側,充分暴露位于腹腔背壁脊柱兩側的腎臟（右腎略低）；取下雙側腎臟,放入消毒培養(yǎng)皿中。（或取出肝組織置于培養(yǎng)皿中。）3剪切剪開腎膜，剝向腎門，去除腎膜及脂肪；用吸管吸取滅菌PBS（或Hanks液）將腎臟清洗3次，去除血污；將腎臟移入另一平皿中，沿縱軸剪開腎臟，剪去腎盂，用眼科剪將腎組織反復剪碎，直到剪成0.51mm3組織塊；用吸管加23滴培養(yǎng)液輕

12、輕吹打，使組織塊懸浮在培養(yǎng)液中。（或肝組織用Hanks液反復沖洗，以除去血細胞，將肝組織移入另一個培養(yǎng)皿中，用吸管吸取0.5ml培養(yǎng)基置于肝組織上，用另一眼科剪將其剪成0.51mm3組織塊。）4接種：用彎頭吸管小心分次吸取組織塊，使組織塊吸在吸管端部，要避免吸得過高，組織塊粘附于吸管壁而丟失。將組織塊均勻排布在培養(yǎng)瓶底部，控制組織塊間距在0.5cm左右，每25ml培養(yǎng)瓶底可擺布1520塊。輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，使瓶底向上，翻瓶時勿使組織塊流動，加入23ml培養(yǎng)液（液層厚約15mm），塞好瓶塞，置CO2培養(yǎng)箱37培養(yǎng)23h,（勿超過4h）。此時組織塊略干燥，能貼附于瓶壁上。5. 培養(yǎng)：慢慢翻轉培養(yǎng)瓶，

13、使培養(yǎng)液浸泡附于瓶底的組織塊，置培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。操作過程中動作一定要輕，減少振動，使培養(yǎng)液慢慢覆蓋組織塊，否則會使組織塊脫落，影響貼壁培養(yǎng)。6觀察24小時后取出觀察，移動培養(yǎng)瓶時要盡量使培養(yǎng)液震蕩撞擊組織塊。在顯微鏡下觀察已貼壁的組織塊有無細胞長出。消化培養(yǎng)法:1處死動物、取材及剪切：與組織塊培養(yǎng)法相同。剪切后的組織塊再用滅菌的PBS（或Hanks液）清洗數次，直到PBS澄清為止。移入無菌離心管中，靜置數分鐘，使組織塊自然沉到管底，棄上清。2消化及分散組織塊按組織塊體積510倍量，吸取0.25胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液加到含組織塊的無菌離心管中，與組織塊混勻后，加蓋無菌塞子密封，

14、置37水浴中消化1020min，其間每5min搖動一次，使組織塊散開并與消化液充分接觸。當組織塊變得疏松、顏色略白時，從水浴中取出離心管，在超凈工作臺內靜置后吸去含胰蛋白酶的上清（此步驟可以在8001000rpm離心35min去除含胰蛋白酶的上清），加入23ml培養(yǎng)液，終止消化。用吸管反復吹打，直到大部分組織塊分散成單細胞或細胞團狀態(tài)為止。最后將此細胞懸液用100目、200目的不銹鋼濾網過濾至燒杯中。3計數及稀釋：從過濾的細胞懸液中取1ml，用血細胞計數板計數。根據計數結果，用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的細胞密度以51051106為宜。4接種培養(yǎng)：將稀釋好的細胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中，一般25ml小方瓶分

15、裝45ml,青霉素瓶分裝1ml。培養(yǎng)瓶上做好標記，培養(yǎng)瓶蓋旋緊后再松半個螺旋，置CO2培養(yǎng)箱在37培養(yǎng)。5觀察：接種培養(yǎng)后要每日觀察培養(yǎng)液是否污染、顏色變化及細胞生長狀況。培養(yǎng)液黃色且混濁表示污染，紫紅色表明細胞生長不良，桔紅色表明細胞生長良好。傳代培養(yǎng)貼壁細胞的傳代培養(yǎng):1準備從培養(yǎng)箱中取出原代培養(yǎng)細胞，在顯微鏡下觀察，確認已長成致密單層、生長良好，適宜傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶連同所需實驗用品備齊，放入超凈工作臺內，所有實驗操作均在超凈工作臺內進行。2.消化棄去原代培養(yǎng)瓶內的舊培養(yǎng)液，加入適量無鈣、鎂離子PBS液（或Hanks液），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，清洗殘留在細胞表面培養(yǎng)液和碎片，棄去清洗液。在培養(yǎng)

16、瓶內加入消化液（0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA各1份）約23ml,以液面蓋滿細胞為宜。培養(yǎng)瓶置室溫或培養(yǎng)箱內23min后，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中的細胞，當發(fā)現細胞胞質回縮、細胞間間隙增大時，或翻轉培養(yǎng)瓶肉眼觀察，細胞單層出現針孔大小的縫隙，則快速棄去消化液；如未出現縫隙，則繼續(xù)消化，直到出現縫隙。向培養(yǎng)瓶中加入PBS液（或Hanks液），輕轉培養(yǎng)瓶清洗殘留的消化液后倒掉PBS液（或Hanks液）。3分裝在培養(yǎng)瓶內加入新配制的培養(yǎng)液約3ml，并用吸管反復吹打瓶壁，至細胞層全部脫落，再輕輕吹打細胞懸液，使細胞散開。吹打時應按一定的順序進行，即從培養(yǎng)瓶底部的一側開始吹打至另一側結束，盡量

17、使每個部位的細胞都能被吹到。吹打時不能太用力，盡量不產生氣泡，避免損傷細胞。在倒置顯微鏡下觀察細胞，當貼壁細胞均已懸浮于培養(yǎng)液中，且細胞已分散單細胞或細胞團時，終止吹打。取細胞懸液計數并用臺盼藍染色，計算細胞密度及細胞活力，據此對細胞懸液補加適量培養(yǎng)液稀釋，調整細胞密度為11051106 /ml，將其分裝到2瓶或多瓶中。原代培養(yǎng)的細胞首次傳代時，細胞密度宜大些，以使細胞盡快適應新的環(huán)境，利于細胞生存和增殖。如原培養(yǎng)瓶為5ml培養(yǎng)液，分裝2瓶時，則需補加培養(yǎng)液到10ml，混勻后分一半到另一培養(yǎng)瓶中。在分裝好的培養(yǎng)瓶上標明日期、細胞代號等標志。4培養(yǎng)與觀察輕輕搖動分裝好的培養(yǎng)瓶，置CO2培養(yǎng)箱37

18、培養(yǎng)。接種后要每日觀察培養(yǎng)液的顏色及細胞生長狀況，通常，細胞傳代培養(yǎng)2h左右，細胞即能貼壁生長，24h可形成單層。培養(yǎng)過程中，可通過0.5%臺盼藍染色了解培養(yǎng)細胞中死、活細胞的比例。懸浮細胞的傳代培養(yǎng):少數細胞，如某些癌細胞、血液中白細胞，體外培養(yǎng)時為懸浮生長、不貼壁，其傳代培養(yǎng)的方法不同于貼壁生長的細胞，可通過離心收集細胞后傳代或直接傳代。1離心傳代超凈工作臺內用吸管將培養(yǎng)瓶內的細胞吹打均勻，如有半貼壁的細胞應將其吹打下來。將細胞懸液轉移到無菌離心管中，平衡后8001000/min離心5min，棄上清，加適量新配制的培養(yǎng)液打勻成細胞懸液。細胞計數，按1：2或1：3的比例將細胞懸液稀釋，分裝于

19、新的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)及觀察等操作同貼壁細胞的傳代培養(yǎng)。2直接傳代讓懸浮細胞慢慢沉淀到瓶底，棄去上清液1/21/3后，用吸管吹打成細胞懸液，其后的操作同上。培養(yǎng)細胞活力測定1接種細胞：用0.25%胰蛋白酶消化HeLa細胞，并用培養(yǎng)基制成單個細胞懸液，以5104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200l，5%CO2、37培養(yǎng)天。整個實驗分為3個組：加藥實驗組、不加藥對照組及不接種細胞也不加藥的空白組。每組8個復孔。培養(yǎng)24h實驗組加藥處理。繼續(xù)培養(yǎng)至72h。2染色：每孔加入20l 0.5%MTT 溶液（5mg/ml），若實驗組所加藥物能與MTT反應，應先離心棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，

20、再加入含MTT的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)4h。3離心：與另一96孔板平衡后，1000r/min，離心10min ，用力甩去上清。4溶解：每孔加入200l二甲基亞砜，避光振蕩10min，以溶解紫色結晶。5測定：用全自動酶標儀（bio-rad550型）測定波長570nm（490nm?）處各孔的吸光值（OD值）。實驗組和對照組OD值以空白組OD值調零。6計算實驗組細胞存活率、抑制率：細胞存活率越小，說明實驗組藥物的作用強度越大；抑制率越大，說明實驗組藥物的作用強度越大。計算公式如下：細胞存活率=（實驗組OD值/對照組OD值）100%抑制率=（對照組OD值一實驗組OD值）/對照組OD值100%1組織塊法培養(yǎng)細

21、胞的觀察培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下可觀察到組織塊周圍開始有少量的細胞。一般最先長出形態(tài)不規(guī)則的游走細胞，接著長出成纖維細胞或上皮細胞，隨著細胞的延長，組織塊周圍形成較大的生長暈，以后細胞生長加快，呈放射狀向外擴展逐漸連成一片（圖7-1）。即有少量細胞從組織塊周圍游離而出，當細胞從組織塊游出量增時，應根據培養(yǎng)液顏色，補加或更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)液表面如有漂浮的組織塊，要及時吸棄。細胞生長良好時，1015天可長成致密單層，需傳代培養(yǎng)。圖7-1 組織塊周圍細胞呈放射狀向外擴展2胰蛋白酶消化法培養(yǎng)細胞的觀察正常情況下，倒置顯微鏡下可觀察剛接種的細胞均呈圓形懸浮于培養(yǎng)液中，接種24h后可見許多細胞貼壁，細胞由圓形懸浮狀態(tài)伸展成梭形（圖7-2，圖7-3）；若細胞生長不良或培養(yǎng)液變紅，應在無菌條件下，更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)34d時，細胞增殖旺盛，數量增多，細胞透明，顆粒少，界限清楚，可見細胞島形成；此時若培養(yǎng)液變黃、澄清，表明細胞生長，但營養(yǎng)成分不足，代謝產物堆積，CO2增多，可更換