提RNA+逆轉(zhuǎn)錄+qRT-PCR步驟

1、提 RNA+逆轉(zhuǎn)錄 +qRT-PCR步驟【一、提 RNA】一、實驗準(zhǔn)備：1、試劑：75%乙醇、 Trizol 、1.5mL 進口 EP管、 氯仿、異丙醇、進口槍頭 （RNA專用） 、2、配 75%乙醇（DEPC水+無水乙醇 ） ，放-20 冰 箱預(yù)冷；3、預(yù)冷離心機 （1.5mL EP 管用的） ；4、清潔桌面，酒精噴過之后擦干，新手套、兩 層口罩；二、操作步驟： 01、棄上清（不回收，直接倒去） ； 02、 1mL/孔 PBS 洗兩遍（不回收，直接倒去， 隨后用 200L 槍吸盡 PBS）； 03、每孔加 500L Trizol ，輕晃，隨后室溫放 置 2min 左右； 04、槍頭吹打，吸出

2、放入 1.5mL 進口 EP管； 05、加入 100L氯仿（即1/5 體積的 trizol） ； 06、4離心機， 12000g， 15min； 07、吸 200L（可減少 ）上清放入新的 1.5mL 進 口 EP 管中（注意：只能吸到上清） ； 08、加入等體積異丙醇，充分混勻，常溫放置 10-30min（15min） ；09、4離心機， 12000g， 10min； 10、倒掉液體，加入 1mL預(yù)冷的 75%乙醇劇烈混 勻；11、12、13、14、4離心機， 7500g，5min； 倒掉上清， 加入 1mL預(yù)冷的 75%乙醇，混勻； 4離心機， 7500g，5min； 倒掉上清，倒扣在餐巾

3、紙上， 5-10min ，用 針頭或者 200 微升槍頭去掉管壁上的水珠； 15、每管中加入 40L(40 -60 L)的 DEPC水， 吹打溶解；16、 水、測濃度(先知樓 21 樓測 RNA濃度，帶 DEP 滅菌的 dd水、 10 微升槍和槍頭)； 注意事項01、如果當(dāng)時不測 RNA濃度，可暫時把 RNA放在 -20 冰箱。但長時間 (24h) 保存，需要放在 -80 冰箱； 02、異丙醇作用是沉淀 RNA，作用比乙醇好； 03、 04、 05、 06、 07、08、09、【二、測 RNA濃度】一、實驗準(zhǔn)備：01、先知樓 21樓-2109 教室，一個冰盒 +DEPC水 +10微升槍、滅菌

4、dd H2O、10L 槍頭（RNA專用） 、 本子+筆；二、操作步驟：01、登記；02、打開電腦 =打開“N”軟件 =點擊“Nucleic acid ” =選擇“ OK” =選擇“ RNA”； 03、滅菌 dd H2O清洗 2-3 遍，擦干； 04、 DEPC水 校零：即加 DEPC水一滴，點擊“ Blank ”，擦干；05、測 RNA：加樣品一滴，點擊“ measure”，擦 干，隨后加下一個樣品； 06、記錄數(shù)據(jù)，包括 RNA濃度（ 0.1 。（請注意，這個值跟儀器 無關(guān)，核酸的吸光度必需大于 0.1 ，其值才有效和可靠，因為樣品中的雜質(zhì)和顆粒這些不純物 的干擾通常會對光有一定吸收，其值

5、0.1 ）；2. A280nm、 A270nm 是蛋白最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA 的A260/A280 比值為 1.8 ，純 RNA為 2.0 。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污 染，需要純化樣品。比值 =1.5 相當(dāng)于 50蛋白質(zhì) /DNA溶液 . 酚的最大吸收峰在 270nm。3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長， 比值可進行核酸樣品純度評估： 純 DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值為 2.5 。若比值小于 2.0 標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類） 、鹽類或有機溶劑污 染，需要純化樣品。 A230 產(chǎn)生負值主要是由于在

6、很低 DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾 所導(dǎo)致的。在下一個測定中，需要降低樣品的稀釋度，A230 的負值會被校正。4. A320nm 或 A340nm 為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應(yīng)該接近0.0 。如果不是，標(biāo)明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。純樣品的 A320 一般是 0。5. A260/A280 和 A260/A230 是核酸純度的指示值。純度好的DNA或 RNA，在 pH7-8.5 下 A260 /A280 的比值應(yīng)該在 2.0 或 2.5 。純凈的樣品比值大于 1.8 （ DNA）或者 2.0 （ RNA）。如果比值低 于 1.8 或者 2.0 ，表示存在蛋白質(zhì)或者酚

7、類物質(zhì)的影響。 A230 表示樣品中存在一些污染物，如 碳水化合物、鹽（胍鹽）等，較純凈的核酸 A260/A230 的比值大于 2.0 。當(dāng) 0.5 BSA蛋白質(zhì)污 染時，蛋白污染會導(dǎo)致 260 和 280 的數(shù)值都下降，其凈結(jié)果是 260/280 比值下降，但 260/280 的比值變化并不顯著，正如分子克隆 3 所說。但蛋白殘留會導(dǎo)致 230 的數(shù)值顯著上升，顯著影 響 260/230 的比值。也就是說，如果 RNA樣品的 260/280 1.7 ，260 /230 0.5 ，那么就應(yīng)該考 慮污染原因不是胍鹽殘留，而是蛋白殘留 .用分光光度計測量 RNA時，用水而不是用 TE 緩沖液 稀釋

8、 RNA樣品會造成 A260/A280 比值下降。原因是低離子強度和低 pH溶液會增加 280 nm 處的 光吸收值。加氯仿離心后取上清的時候千萬不要貪多，那樣就很容易被蛋白污染，所以現(xiàn)在一 般取 400ul 左右。6. 當(dāng) 260/23085.0 5s=4.0 60min；04、4冰箱保存；三、注意事項01、加液盡量無氣泡，槍不要打到底；02、嚴(yán)格冰上操作，防止 RNA降解；【qRT-PCR】一、實驗準(zhǔn)備：01、試劑： Roche的 SyBr Green(rox)02、1.5mL EP 管、 0.2mL EP 管、96 孔板/ 八連 冠； 10L、20L、100L、200L、 2.5 L、

9、1000L 槍；03 、冰盒一個、 Rox 化凍 ( 避光 ) 、引物化凍(GAPD)H、cDNA、DEPC水；二、操作步驟：01、 Rox 10 L；+ dd H 2O 6 L；+ P1(F) 1+ P2(R) 1+ cDNA 220L 體系02、計算：每個樣， X 個抗體(至少包括 GAPDH-內(nèi)參,還有目的 ) ，三個副孔。即 如 果 六 個 樣 ， 2 個 抗 體(GAPDH,PLK1，) 三個副孔。6*1*3=18 20(PLK1)，6*1*3=18 20(GAPDH；)1234567891011126/PLK16/ PLK16/ PLK15/PLK15/PLK15/LK1P6/GA

10、P6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5 /GAP4/ PLK14/ PLK14/ PLK13/PLK13/PLK13/PLK12/PLK12/ PLK12/ PLK11/PLK11/PLK11/LK1P4/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/GAP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1 /GAPPLK1Rox： 10*20=200LDEPC 水： 6*20=120L F：1*20=20 LR：1*20=20 LGAPDHRox： 10*20=200LDEPC 水： 6*20=120L F：1*20=20 LR：1*20=20 L03、稀釋 cDNA 10倍(

11、18L DEPC水+2L)=配置 Mix( Rox+ DEPC水+F+R)=加樣( 一橫排先 加 18 L mix(GAPDH)， 隨 后 加 入 18 L mix(PLK1) 。隨后六個孔加同一個 cDNA； 06、去除氣泡：加好樣后，觀察有無氣泡。如果 有氣泡，彈開，隨后2000rpm離心，時間不定 (5s 即可)；07、上機 +設(shè)置程序：A 、 雙 擊 打 開 程 序 “ StepOne Software v2.1 ” =點擊“ OK ” =點擊“ Ignore & Continue Startup ” = 點 擊 “ Advanced Setup ” =進入“ Experment Pr

12、operties界面”；B、Experment Properties 界面 ：將 Expriment Name 從 Untitled 修改為 “日期，如 2015-12-17 ”，將 User Name(Optional) 修改為“ CZL”；Which instrument are you using to run the experiment ? 中選擇“ 96 wells ”，一般無 需修改；What type of experiment do you want to setup ?中選擇“ Quantitation-Comparative CT( CT) ”；Which reagent

13、s do you want to use to detect the target sequence ?中選擇“ SYBGreen Reagents ”；Which ramp speed do you want to use in the instrument run ? 中選擇“ Fast( 40 minutes to complete a run) ”；C、Plate Setup 界面 -Define Targets and Samples界面：Define Targets 欄中：如果有 GAPD、H PLK1、Akt 、PI3K 三個引物， 則點擊“ Add New Target ”三下

14、，出現(xiàn)“ Target1 、 Target2 、 Target3 、 Target4 ”三個 =將其重命名；Define Samples 欄中：如果有 6 個樣品 (N;1.5;3;6;9;12) ， 則 點 擊 “ Add New Sample ”，出現(xiàn)“ Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6”六個 =將 其重命名；Plate Setup 界面 - Assign Targets and Samples 界面：GAP/1GAP/1GAP/1GAP/2GAP/2GAP/2GAP/3GAP/3GAP/3GAP/4GAP/4GAP

15、/4Plk1 /1Plk1 /1Plk1 /1Plk1 /2Plk1 /2Plk1 /2Plk1 /3Plk1 /3Plk1 /3Plk1 /4Plk1 /4Plk1 /4Akt/1Akt/1Akt/1Akt/2Akt/2Akt/2Akt/3Akt /3Akt /3Akt/4Akt/4Akt/4PI3K/1PI3K/1PI3K/1PI3K/2PI3K/2PI3K/2PI3K/3PI3K/3PI3K/3PI3K/4PI3K/4PI3K/4GAP/5GAP/5GAP/5GAP/6GAP/6GAP/6Plk1 /5Plk1 /5Plk1 /5Plk1 /6Plk1 /6Plk1 /6Akt/5Akt/5Akt/5Akt/6Akt/6Akt/6PI3K/5PI