第五章-固相析出分離法

1、2021/2/61第五章 固相析出分離法2021/2/62目的目的:(濃縮濃縮; ;(初步純化初步純化 ; ;(將已純化的將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài), ,加以保存或進(jìn)一步處理。加以保存或進(jìn)一步處理。固相析出法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法固相析出法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法, ,但目前仍但目前仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實(shí)驗(yàn)室中。廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實(shí)驗(yàn)室中。概述n固相析出分離法:生化物質(zhì)目的物經(jīng)常作為溶質(zhì)存在于溶液中,改變?nèi)芤簵l件,使它以固體形式從溶液中分離的操作技術(shù)。2021/2/63n 固相析出操作常在發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾和離心（除固相析出操作常在發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾和離心（除

2、去不溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后進(jìn)行去不溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后進(jìn)行, ,得到的沉析得到的沉析物可直接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純物可直接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純, ,如透析、如透析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。固相析出法不僅用于實(shí)驗(yàn)室中固相析出法不僅用于實(shí)驗(yàn)室中,因其不需專門設(shè)備因其不需專門設(shè)備,且易且易于放大于放大,也廣泛用于生產(chǎn)的制備過(guò)程也廣泛用于生產(chǎn)的制備過(guò)程,是分離純化生物大分子是分離純化生物大分子,特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。用的方法。2021/2/64 鹽析法 有機(jī)溶劑沉淀法固相析出法 等電點(diǎn)沉淀法 結(jié)晶法

3、 其它多種沉淀法n結(jié)晶法:析出物為晶體。n沉淀法:析出物為無(wú)定形固體。固相析出法分類固相析出法分類2021/2/65n第一節(jié) 鹽析法n第二節(jié) 有機(jī)溶劑沉淀法n第三節(jié) 其它沉淀方法n第四節(jié) 結(jié)晶2021/2/66第一節(jié) 鹽析法n一、基本原理n二、影響因素n三、鹽析操作2021/2/67定義定義: :鹽析法是利用各種生物分鹽析法是利用各種生物分子子在濃鹽溶液中溶解度的差在濃鹽溶液中溶解度的差異異, ,通過(guò)向溶液中引入一定數(shù)通過(guò)向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽量的中性鹽, ,使使目的物目的物或或雜蛋雜蛋白白以沉淀以沉淀析出析出, ,達(dá)到純化目的達(dá)到純化目的的方法。的方法。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、較少變

4、性簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、較少變性缺點(diǎn)缺點(diǎn): :分辨率不高分辨率不高; ;沉淀含大量沉淀含大量鹽析劑鹽析劑, ,要除鹽要除鹽; ;產(chǎn)生氨的惡產(chǎn)生氨的惡臭臭72021/2/68兩種現(xiàn)象兩種現(xiàn)象: :鹽溶鹽溶: :低鹽情況低鹽情況, ,鹽鹽離子強(qiáng)度的增高離子強(qiáng)度的增高, ,蛋白質(zhì)溶解度增蛋白質(zhì)溶解度增大大鹽析鹽析: :高鹽高鹽, ,鹽離子鹽離子強(qiáng)度增加強(qiáng)度增加, ,蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶解度減小溶解度減小82021/2/692021-9-8南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院92021/2/6102021-9-8南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院102021/2/611一、基本原理一、基

5、本原理112021/2/612鹽析作用（salting out）原理n破壞雙電層:q在高鹽溶液中,帶大量電荷的鹽離子能中和蛋白質(zhì)表面的電荷,使蛋白質(zhì)分子之間電排斥作用相互減弱而能相互聚集起來(lái)。n破壞水化層:q中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大,鹽離子在水中發(fā)生水化而使蛋白質(zhì)脫去了水化膜,暴露出疏水區(qū)域,由于疏水區(qū)域的相互作用,使其沉淀。2021/2/613loglogS S= = - -K Ks s S S蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)溶解度,g/L;,g/L; 鹽離子強(qiáng)度鹽離子強(qiáng)度, , C Ci ii i離子濃度離子濃度, ,mol/Lmol/L; ;Z Zi ii i離子化合價(jià)離子化合價(jià); ; 常數(shù)常數(shù), ,

6、為縱坐標(biāo)上的截距為縱坐標(biāo)上的截距; ;K Ks s鹽析常數(shù)鹽析常數(shù)。132.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0 鹽析和鹽析和K KS S鹽析鹽析右圖示:鹽離子濃度與蛋白質(zhì)溶解度關(guān)系曲線,在鹽析區(qū),符合公式2021/2/614n兩種類型兩種類型: :（1 1）在一定的）在一定的pHpH和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析進(jìn)行鹽析, ,稱作稱作KsKs鹽析法鹽析法。 由于蛋白質(zhì)對(duì)離子強(qiáng)度的變化非常敏感由于蛋白質(zhì)對(duì)離子強(qiáng)度的變化非常敏感, ,易產(chǎn)生共易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象沉淀現(xiàn)象, ,因此常用于提取液的前處理。因此常用于提

7、取液的前處理。（2 2）在一定離子強(qiáng)度下僅改變）在一定離子強(qiáng)度下僅改變pHpH和溫度進(jìn)行鹽析和溫度進(jìn)行鹽析, ,稱作稱作鹽析法鹽析法。 由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢, ,且變化幅度小且變化幅度小, ,因此分因此分辨率更高辨率更高, ,后期分離（結(jié)晶）后期分離（結(jié)晶）142021/2/615二、影響鹽析的因素二、影響鹽析的因素1.無(wú)機(jī)鹽的種類在相同離子強(qiáng)度下在相同離子強(qiáng)度下, ,鹽的種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響有一鹽的種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異定差異, ,一般的規(guī)律為一般的規(guī)律為: :半徑小的高價(jià)離子的鹽析作用較半徑小的高價(jià)離子的鹽析作用較強(qiáng)強(qiáng), ,半徑大的低價(jià)離子作用較弱半

8、徑大的低價(jià)離子作用較弱陰離子鹽析效果陰離子鹽析效果 : :檸檬酸檸檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42-2- CHCH3 3COOCOO- - ClCl- - NONO3 3- -SCNSCN- -陽(yáng)離子鹽析效果陽(yáng)離子鹽析效果: :NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + 高價(jià)陽(yáng)離子高價(jià)陽(yáng)離子陰離子的影響大于陽(yáng)離子陰離子的影響大于陽(yáng)離子2021/2/616l鹽析用鹽的選擇2021/2/617鹽析中常用的鹽鹽析中常用的鹽: :硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑n（1 1） 價(jià)廉價(jià)廉 ; ;

9、n（2 2） 溶解度大溶解度大, ,溫度系數(shù)小溫度系數(shù)小, ,許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來(lái)許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來(lái); ;n（3 3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好, ,n（4 4）不易引起蛋白質(zhì)變性。）不易引起蛋白質(zhì)變性。n缺點(diǎn):n（1）水解變酸;n（2）高pH 釋氨,腐蝕;n（3）殘留產(chǎn)品有影響。2021/2/618n不同種類蛋白質(zhì)所需的無(wú)機(jī)鹽量不同n先后加入不同量無(wú)機(jī)鹽分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)2.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類:Ks、血 纖 維蛋 白 原碳 氧 血紅 蛋 白血 清 白蛋 白擬 球 蛋 白碳 氧 肌紅 蛋 白0.500-0.50-1.000 2 4 6 8 10log S

10、不同蛋白溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系2021/2/619鹽析分布曲線鹽析分布曲線192021/2/620n蛋白質(zhì)濃度不同:所需無(wú)機(jī)鹽用量不同n蛋白質(zhì)濃度高:所需無(wú)機(jī)鹽量少n制成品:可適當(dāng)高濃度,但濃度過(guò)高,易共沉淀n重疊蛋白分級(jí):適當(dāng)稀釋,共沉淀小,但回收率降低。3.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）濃度:23%-d dSP10987654321040 50 60 70 80P30g/L 3g/L不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線2021/2/621n無(wú)機(jī)或稀鹽溶液:T蛋白質(zhì)溶解度n高鹽溶液: T蛋白質(zhì)溶解度n蛋白質(zhì):室溫鹽析n對(duì)溫度敏感的酶,0C4C4.溫度:210log S2 3 4 250pH6.6溫度對(duì)溶解度

11、的影響2021/2/6225.pH:nPl鹽析n注意高鹽下pl的偏移:與負(fù)離子結(jié)合向低pH偏移,與正離子結(jié)合向高pH偏移n利用蛋白質(zhì)pl的不同:可分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)卵清蛋白碳氧血紅蛋白765432103 4 5 6 7 8pH2021/2/623三、鹽析操作三、鹽析操作1.鹽析用鹽的濃度表示硫酸銨的加入有以下幾種方法硫酸銨的加入有以下幾種方法: :1 1）加入固體鹽法）加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況; ;工工業(yè)上常采用這種方法業(yè)上常采用這種方法, ,加入速度不能太快加入速度不能太快, ,應(yīng)分批加入應(yīng)分批加入, ,并充分?jǐn)嚢璨⒊浞謹(jǐn)嚢?

12、 ,使使其完全溶解和防止局部濃度過(guò)高其完全溶解和防止局部濃度過(guò)高; ;2 2）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法 用于要求飽和度不高而原來(lái)溶液體積不大的情用于要求飽和度不高而原來(lái)溶液體積不大的情況況; ;它可防止局部過(guò)濃它可防止局部過(guò)濃, ,但加量較多時(shí)但加量較多時(shí), ,料液會(huì)被稀釋。料液會(huì)被稀釋。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先將鹽析的樣品裝于透析袋中先將鹽析的樣品裝于透析袋中, ,然后浸入飽和硫酸銨然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析中進(jìn)行透析, ,袋內(nèi)飽和度逐漸提高袋內(nèi)飽和度逐漸提高, ,達(dá)到設(shè)定濃度后達(dá)到設(shè)定濃度后, ,目的蛋白析出。目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性該法優(yōu)點(diǎn)在于硫

13、酸銨濃度變化有連續(xù)性, ,鹽析效果好鹽析效果好, ,但程序煩瑣但程序煩瑣, ,故故多用于結(jié)晶。多用于結(jié)晶。2021/2/624鹽析用鹽量的鹽析用鹽量的表征表征- - -飽和度飽和度: :u目標(biāo)蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前目標(biāo)蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前, ,所需的硫酸銨濃度所需的硫酸銨濃度或飽和濃度可通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定?；蝻柡蜐舛瓤赏ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)確定。u對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì), ,當(dāng)達(dá)到當(dāng)達(dá)到85%85%飽和度時(shí)飽和度時(shí), ,溶解度都小于溶解度都小于 0.l mg0.l mgL L, ,通常為兼顧收率與純度通常為兼顧收率與純度, ,飽和度的操作范飽和度的操作范圍在圍在40%-60%40%-60%之間。之間。20

14、21/2/625調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表2021/2/626n鹽析方法:l1）分步鹽析法(不同的鹽濃度)l2）重復(fù)鹽析法l高蛋白質(zhì)濃度下共沉淀重復(fù)鹽析提高純度l3）反抽提法(相同鹽濃度)2、鹽析方法和注意事項(xiàng)2021/2/627n分級(jí)鹽析法n不斷提高鹽濃度:不同蛋白質(zhì)分級(jí)沉淀n低飽和度:除雜蛋白,高飽和度:沉淀目的物血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 450%50%飽和度飽和度飽和飽和析出析出析出析出2021/2/628單酶鹽析曲線雙酶鹽析曲線2021/2/629n反抽提法n共沉淀較低濃度鹽溶液溶雜蛋白大腸桿菌RNA聚合酶的制備

15、2021/2/630n防止“局部過(guò)濃”:慢加,攪拌n溫度:不宜過(guò)低,室溫1025C,易失活:010Cn時(shí)間:沉淀需經(jīng)一段老化時(shí)間（1小時(shí)）后分離注意事項(xiàng):2021/2/631第二節(jié) 有機(jī)溶劑沉淀法一、基本原理二、影響沉淀效果的因素2021/2/632l有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用, ,是較早使是較早使用的沉淀方法之一。用的沉淀方法之一。2021/2/633l優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :l1 1）分辨能力比鹽析法高）分辨能力比鹽析法高, ,即蛋白質(zhì)等只在一個(gè)比較窄即蛋白質(zhì)等只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶

16、劑濃度下沉淀的有機(jī)溶劑濃度下沉淀; ;l2 2）溶劑易除去）溶劑易除去l3 3）沉淀不用脫鹽）沉淀不用脫鹽, ,過(guò)濾較為容易過(guò)濾較為容易; ;l缺點(diǎn)缺點(diǎn): :l1 1）對(duì)具有生物活性的大分子容易引起變性失活）對(duì)具有生物活性的大分子容易引起變性失活, ,l2 2）操作要求在低溫下進(jìn)行。）操作要求在低溫下進(jìn)行。l3 3）成本高）成本高, ,需需防火防爆防火防爆l總體來(lái)說(shuō)總體來(lái)說(shuō), ,蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。鹽析法普遍。2021/2/634一、基本原理n1、降低了介質(zhì)的介電常數(shù),使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加,聚集形成沉淀。n 2、水溶性有機(jī)溶劑本身的水

17、合作用降低了自由水的濃度,壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度,降低了它的親水性,導(dǎo)致脫水凝集。 n脫水作用比靜電作用強(qiáng)2021/2/635一些溶劑的介電常數(shù)一些溶劑的介電常數(shù) 352021/2/636二、影響沉淀效果的因素1.有機(jī)溶劑種類及用量n能與水無(wú)限混溶n介電常數(shù)小、沉淀強(qiáng)n變性小n毒性小,揮發(fā)性適中2021/2/637常用:乙醇、丙酮（揮發(fā)肝毒性著火點(diǎn)低）和甲醇（口服毒性） 介電常數(shù):無(wú)水乙醇24,甲醇33,丙酮22乙醇:沉析作用強(qiáng),揮發(fā)性適中,無(wú)毒,常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析;丙酮:沉析作用更強(qiáng),用量省,但毒性大,應(yīng)用范圍不廣;用量:（了解）2021/2/6382

18、.pH的影響nPl附近、穩(wěn)定性n控制溶液pH時(shí)務(wù)必使溶液中大多數(shù)蛋白質(zhì)分子帶有相同電荷,勿使目的物與雜質(zhì)帶異電荷導(dǎo)致共沉淀。2021/2/639n嚴(yán)格控制低溫 有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)q預(yù)冷（有機(jī)溶劑-10以下,蛋白質(zhì)0左右）,q在冰鹽浴中進(jìn)行,q加入有機(jī)溶劑時(shí)必須緩慢且不斷攪拌以免局部過(guò)濃變性,并散熱。n溫度影響有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀能力,一般溫度越低,沉淀越完全。3.溫度2021/2/640n低濃度緩沖液（0.01-0.05mol/L）,0.2mol/L）:鹽溶,增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑水溶液中的溶解度,會(huì)增加溶媒用量,沉淀物中可能夾帶鹽,需除鹽q常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。

19、 4.無(wú)機(jī)鹽的含量2021/2/6415.某些金屬離子的助沉淀作用nZn、Cu等與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,而活性不變,有助于沉淀,降低有機(jī)溶劑用量。n胰島素精制胰島素精制: :2021/2/6426.樣品濃度n較稀:溶劑量,收率,稀釋變性n較高:共沉淀,分辨率,溶劑量,回收率,變性小n蛋白質(zhì)初濃度:0.5%2%n粘多糖:12%2021/2/643 舉例舉例:固體發(fā)酵生產(chǎn)固體發(fā)酵生產(chǎn)-淀粉酶的提取工藝研究淀粉酶的提取工藝研究 -淀粉酶（米曲霉）菌體淀粉酶（米曲霉）菌體 + 水水 過(guò)濾過(guò)濾 水抽提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）攪拌）攪拌 -淀粉酶淀粉酶 * pH影響影響 收率收率

20、% 酶活酶活 收率收率 酶活酶活 6.5 pH * 適宜的適宜的pH 5.6 6.0 * 溫度影響溫度影響 收率收率% 酶活酶活 酶活酶活 收率收率 10 20 T * 適宜的溫度適宜的溫度10 20 2021/2/644第三節(jié) 其它沉淀方法n一、等電點(diǎn)沉淀n二、成鹽沉淀法n三、親和沉淀n四、高分子聚合物沉淀法n五、表面活性劑沉淀法2021/2/645一、等電點(diǎn)沉淀法原理:nPl時(shí)分子表面靜電荷為零,雙電層及水化膜的削弱或破壞,分子間引力增加,溶解度降低。2021/2/646n常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用。n主要:去除雜蛋白,而不用于沉淀目的物。2021/2/647二、成

21、鹽沉淀法n1.金屬離子沉淀n所用的金屬離子,包括MnMn2+2+、FeFe2+2+、CoCo2+2+、NiNi2+2+、ZnZn2+2+、CaCa2+2+、BaBa2+2+、MgMg2+2+等。 n蛋白質(zhì)和酶分子中因?yàn)楹辛u基、氨基、咪唑基和硫氫基等,均可以和上述金屬離子作用形成鹽復(fù)合物。n分離沉淀復(fù)合物分解除金屬離子（離子交換或金屬螯合劑EDTA）2021/2/648n應(yīng)用: 目的蛋白分離,去雜質(zhì)n缺點(diǎn):有時(shí)復(fù)合物分解較困難,蛋白質(zhì)易變性2021/2/6492.有機(jī)酸類復(fù)合鹽 含氮有機(jī)酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能夠與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。 工業(yè)上用此法制備蛋白質(zhì)時(shí),需采取

22、較溫和的條件,有時(shí)還加入一定的穩(wěn)定劑,以防止蛋白質(zhì)變性。2021/2/650n單寧:結(jié)合后牢固,競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法分解n雷凡諾:不影響蛋白質(zhì)活性n三氯乙酸（TCA）:變性,除雜蛋白2021/2/651雷凡諾雷凡諾 2021/2/652豬心提取液豬心提取液 洗脫液洗脫液 上清液上清液 上清上清 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C C 沉淀（去除）沉淀（去除）吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸銨沉淀TCA透析2021/2/653三、親和沉淀法n配基+可溶性載體偶聯(lián)成載體-配基復(fù)合物（親和沉淀劑）n可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀出來(lái)u它是利用蛋白質(zhì)與特定的生物合成分子（免疫配它是利用蛋白質(zhì)與特定的生物合成分子（免疫配位體、基質(zhì)、

23、輔酶等）之間高度專一的相互作用位體、基質(zhì)、輔酶等）之間高度專一的相互作用而設(shè)計(jì)出來(lái)的一種特殊選擇性的分離技術(shù)。而設(shè)計(jì)出來(lái)的一種特殊選擇性的分離技術(shù)。u所以所以其沉淀原理不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異其沉淀原理不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異,而而是依據(jù)是依據(jù)“吸附吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小。的大小。2021/2/654親親 和和 沉沉 淀淀 過(guò)程過(guò)程n親和過(guò)程提供了一個(gè)從復(fù)雜混合物中分離提取單親和過(guò)程提供了一個(gè)從復(fù)雜混合物中分離提取單一產(chǎn)品的有效方法。一產(chǎn)品的有效方法。初始階段初始階段, ,將一個(gè)目標(biāo)將一個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載體與鍵合在可溶性載體上的

24、上的親合配位體親合配位體絡(luò)和形成沉淀絡(luò)和形成沉淀; ;所得沉淀物用一種適當(dāng)?shù)木彌_溶液進(jìn)行洗滌所得沉淀物用一種適當(dāng)?shù)木彌_溶液進(jìn)行洗滌, ,洗去洗去可能存在的可能存在的雜質(zhì)雜質(zhì); ;用一種適當(dāng)?shù)脑噭⒂靡环N適當(dāng)?shù)脑噭⒛繕?biāo)蛋白質(zhì)目標(biāo)蛋白質(zhì)從配位體中離解從配位體中離解出來(lái)。出來(lái)。2021/2/655四、高分子聚合物沉淀法n水溶性非離子型高分子聚合物能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。nPEG、壬苯乙烯化氮（NPEO)、葡聚糖n雙水相或單高聚物q其中應(yīng)用最多的是聚乙二醇。n無(wú)毒,對(duì)產(chǎn)品的影響小,但不易除去2021/2/656562021/2/657五、表面活性劑沉淀法nCTAB （十六烷基三甲基季胺溴化

25、物） 、CPC (十六烷基氯化吡啶) :沉淀酸性多糖n與多糖上的陰離子形成形成季銨絡(luò)合物,降低離子強(qiáng)度,絡(luò)合物析出。nSDS:分離胰蛋白或核蛋白q目的是使核酸和蛋白質(zhì)分離,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸則存在于水溶液中。2021/2/658討論:咸鴨蛋煮熟了,蛋黃里會(huì)有油,這是什么緣故?n熟鴨蛋蛋黃中脂肪的含量高達(dá)熟鴨蛋蛋黃中脂肪的含量高達(dá)3131, ,為什么看為什么看不到一點(diǎn)油不到一點(diǎn)油? ?可是在熟咸蛋的蛋黃中可是在熟咸蛋的蛋黃中, ,卻經(jīng)常可卻經(jīng)?？梢钥吹近S色的油滴往外流以看到黃色的油滴往外流? ?2021/2/659n蛋黃中除了脂肪以外蛋黃中除了脂肪以外, ,還含有豐富的蛋白質(zhì)還含有豐富的蛋白質(zhì)

26、, ,蛋白質(zhì)就蛋白質(zhì)就是一種高明的乳化劑是一種高明的乳化劑, ,它能夠把蛋黃中的脂肪分散成它能夠把蛋黃中的脂肪分散成很小的油滴很小的油滴, ,這樣就騙過(guò)了我們的眼睛和舌頭。這樣就騙過(guò)了我們的眼睛和舌頭。n在鹽漬過(guò)程中在鹽漬過(guò)程中,作為乳化劑的蛋白質(zhì)被鹽析出來(lái)作為乳化劑的蛋白質(zhì)被鹽析出來(lái),乳濁乳濁液被破壞了液被破壞了,那些原來(lái)分散成極小的油滴那些原來(lái)分散成極小的油滴,彼此就互相彼此就互相聚集起來(lái)聚集起來(lái),變成大油液變成大油液,使得整個(gè)蛋黃變成油滋滋的使得整個(gè)蛋黃變成油滋滋的,甚甚至流出油來(lái)了。至流出油來(lái)了。2021/2/660第四節(jié) 結(jié)晶n定義:溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成

27、晶體。q只有同類分子或離子才能排列成晶體,因此結(jié)晶過(guò)程有良好的選擇性。q通過(guò)結(jié)晶,溶液中的大部分雜質(zhì)會(huì)留在母液中,經(jīng)過(guò)濾、洗滌可得到純度高的晶體。 2021/2/661 一、結(jié)晶過(guò)程 二、過(guò)飽和溶液的形成 三、提高晶體質(zhì)量的途徑2021/2/662n飽和溶液:當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時(shí),該溶液稱為飽和溶液;n過(guò)飽和溶液:溶質(zhì)濃度超過(guò)飽和溶解度時(shí),該溶液稱之為過(guò)飽和溶液;n溶質(zhì)只有在過(guò)飽和溶液中才能析出;一、結(jié)晶過(guò)程1.概念2021/2/663n推動(dòng)力:q形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此,溶液濃度達(dá)到飽和溶解度時(shí),晶體尚不能析出,只有當(dāng)溶質(zhì)濃度超過(guò)飽和溶解度后

28、,才可能有晶體析出。n晶核:q最先析出的微小顆粒是以后晶體的中心,稱為晶核。q首先形成晶核,微小的晶核具有較大的溶解度。實(shí)質(zhì)上,在飽和溶液中,晶核是處于一種形成溶解再形成的動(dòng)態(tài)平衡之中,只有達(dá)到一定的過(guò)飽和度以后,晶核才能夠穩(wěn)定存在。2.晶體的形成結(jié)晶是指溶質(zhì)自動(dòng)從過(guò)飽和溶液中析出,形成新相的過(guò)程。條件:2021/2/664過(guò)程:n形成過(guò)飽和溶液n晶核形成n晶體生長(zhǎng)2021/2/6653.結(jié)晶曲線n穩(wěn)定態(tài):不沉淀結(jié)晶n亞穩(wěn)定態(tài):不自動(dòng)生產(chǎn)結(jié)晶,加入晶體能誘導(dǎo)結(jié)晶?？刂茥l件,讓晶體緩慢長(zhǎng)大。n不穩(wěn)定態(tài):自動(dòng)沉淀結(jié)晶,大量細(xì)小結(jié)晶結(jié)晶操作通常都在亞穩(wěn)區(qū)中進(jìn)行結(jié)晶操作通常都在亞穩(wěn)區(qū)中進(jìn)行2021/2

29、/6664.起晶方法自然起晶自然起晶 把溶液蒸發(fā)把溶液蒸發(fā)濃縮至過(guò)飽濃縮至過(guò)飽和區(qū)（不穩(wěn)和區(qū)（不穩(wěn)定區(qū)）定區(qū)）,則有則有大量晶核自大量晶核自然形成。然形成。但晶核數(shù)量但晶核數(shù)量難以控制難以控制,晶晶粒小。粒小。 2021/2/667刺激起晶刺激起晶n把溶液蒸發(fā)至接近過(guò)飽和把溶液蒸發(fā)至接近過(guò)飽和線后把溶液放出線后把溶液放出,使溶液突使溶液突然冷卻然冷卻,進(jìn)入過(guò)飽和區(qū)形成進(jìn)入過(guò)飽和區(qū)形成大量晶核。大量晶核。n當(dāng)晶核達(dá)到一定數(shù)量后當(dāng)晶核達(dá)到一定數(shù)量后,回回升溫度升溫度,使溶液進(jìn)入介穩(wěn)區(qū)使溶液進(jìn)入介穩(wěn)區(qū),停止晶核產(chǎn)生停止晶核產(chǎn)生,然后再慢慢然后再慢慢冷卻冷卻,同時(shí)攪拌同時(shí)攪拌,使晶核長(zhǎng)大。使晶核長(zhǎng)大。

30、 2021/2/668晶種起晶晶種起晶n將溶液濃縮到介穩(wěn)定區(qū)將溶液濃縮到介穩(wěn)定區(qū)的飽和濃度后的飽和濃度后,加入一加入一定大小和數(shù)量的晶種定大小和數(shù)量的晶種,同時(shí)均勻攪拌同時(shí)均勻攪拌,使晶體使晶體長(zhǎng)大。長(zhǎng)大。n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):控制方便控制方便,產(chǎn)品晶產(chǎn)品晶體大小均勻。體大小均勻。 2021/2/669二、過(guò)飽和溶液的形成（結(jié)晶方法）1.蒸發(fā)法q蒸發(fā)除去部分溶劑,在常壓或減壓下加熱除去一部分溶劑,以達(dá)到或維持過(guò)飽和度。q適用于小分子化合物的結(jié)晶,受熱變性的蛋白質(zhì)或酶類不宜采用。2021/2/6702.溫度誘導(dǎo)法n通過(guò)升高或降低溫度,使溶液逐漸達(dá)到飽和,可緩慢析出晶體。n熱盒技術(shù)n耐熱生化物質(zhì)高溫溶解溫度

31、逐漸下降析出晶體2021/2/6713.鹽析結(jié)晶法n固體鹽粉末、飽和鹽溶液（中性鹽）n蛋白質(zhì)及酶類藥物制備中常用方法2021/2/6724.透析結(jié)晶法72使溶解度的變化連續(xù)又緩慢2021/2/6735.有機(jī)溶劑結(jié)晶 常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、異丙醇、乙腈、2、4二甲基戊二醇（MPO）等。 蛋白質(zhì)變性 溶劑回收6.等電點(diǎn)結(jié)晶2021/2/6747.微量擴(kuò)散法n通過(guò)氣相擴(kuò)散使樣品中溶質(zhì)達(dá)到飽和晶體2021/2/6758.化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法n調(diào)pH或加反應(yīng)劑生成新物質(zhì)結(jié)晶其實(shí)質(zhì)是利用化學(xué)反應(yīng),對(duì)待結(jié)晶的物質(zhì)進(jìn)行修飾,一方面可以調(diào)節(jié)其溶解特性,同時(shí)也可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù);2021/2/6769

32、.共沸蒸餾結(jié)晶n共沸物的共沸點(diǎn)n真空下共沸點(diǎn)n真空低溫下進(jìn)行共沸蒸餾結(jié)晶n常多種方法綜合應(yīng)用2021/2/677n工業(yè)上通常希望得到工業(yè)上通常希望得到粗大而均勻粗大而均勻的晶體的晶體, ,便于便于過(guò)濾與洗滌。過(guò)濾與洗滌。n晶體質(zhì)量包括三個(gè)方面的內(nèi)容晶體質(zhì)量包括三個(gè)方面的內(nèi)容: :晶體大小、形狀和純度晶體大小、形狀和純度三、提高晶體質(zhì)量的途徑2021/2/678n1）過(guò)飽和度q過(guò)飽和度值應(yīng)大至使結(jié)晶操作控制在過(guò)飽和度值應(yīng)大至使結(jié)晶操作控制在亞穩(wěn)區(qū)亞穩(wěn)區(qū)內(nèi)內(nèi),又又保持較高的晶體生長(zhǎng)速率保持較高的晶體生長(zhǎng)速率,使結(jié)晶高產(chǎn)而優(yōu)質(zhì)。使結(jié)晶高產(chǎn)而優(yōu)質(zhì)。n2）溫度（緩慢冷卻）1.1.晶體大小晶體大小 快速冷

33、卻或蒸發(fā)快速冷卻或蒸發(fā) 大量細(xì)小的晶體大量細(xì)小的晶體 緩慢冷卻或蒸發(fā)緩慢冷卻或蒸發(fā) 大而均勻的晶體大而均勻的晶體 2021/2/679n3）攪拌速度:適當(dāng),不宜太快 攪拌的作用攪拌的作用: : 加速溶液的熱傳導(dǎo)加速溶液的熱傳導(dǎo), ,加快生產(chǎn)過(guò)程。加快生產(chǎn)過(guò)程。 加速溶質(zhì)擴(kuò)散過(guò)程的速率加速溶質(zhì)擴(kuò)散過(guò)程的速率, ,有利于晶體成長(zhǎng)。有利于晶體成長(zhǎng)。 使溶液的溫度均勻使溶液的溫度均勻, ,防止溶液局部濃度不均防止溶液局部濃度不均, ,結(jié)垢等。結(jié)垢等。 使晶核散布均勻使晶核散布均勻, ,防止晶體粘連在一起形成晶簇防止晶體粘連在一起形成晶簇, ,降低產(chǎn)品質(zhì)量降低產(chǎn)品質(zhì)量。n4）晶種:誘導(dǎo)結(jié)晶,控制晶體形狀

34、大小均勻度2021/2/6802.2.晶體形狀晶體形狀n晶體生長(zhǎng)速度n過(guò)飽和度n溶劑npH: pH的變化,可以改變?nèi)苜|(zhì)分子的帶電性質(zhì),是影響溶質(zhì)分子溶解度的一個(gè)重要因素。一般結(jié)晶液所選用的pH 與沉淀大致相同。n雜質(zhì)2021/2/6813.3.晶體純度晶體純度n母液中的雜質(zhì)n晶體越細(xì)小,雜質(zhì)越多n洗滌有利提高純度n結(jié)晶速度過(guò)快,易產(chǎn)生“晶蔟”,包含雜質(zhì) 雜質(zhì)雜質(zhì)對(duì)對(duì)晶體的成長(zhǎng)晶體的成長(zhǎng)速率的影響較為復(fù)雜速率的影響較為復(fù)雜, ,有的雜質(zhì)能抑制晶體的有的雜質(zhì)能抑制晶體的成長(zhǎng)成長(zhǎng), ,有的能促進(jìn)成長(zhǎng)有的能促進(jìn)成長(zhǎng), ,有的能改變晶型。有的能改變晶型。2021/2/6824.4.晶體結(jié)塊晶體結(jié)塊n原因

35、:n粒度不齊、空氣濕度高、溫度高、受壓、貯存時(shí)間增長(zhǎng)n措施:n控制粒度分布、良好外形、干燥密閉容器貯存2021/2/6835.5.重結(jié)晶重結(jié)晶n晶體用合適溶劑溶解后再次結(jié)晶,提高純度n用于生物物質(zhì)重結(jié)晶的溶劑一般有蒸餾水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低級(jí)醇等。2021/2/684n結(jié)晶是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生化產(chǎn)品的結(jié)晶是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生化產(chǎn)品的一種有效手段一種有效手段。變性蛋白質(zhì)不能結(jié)晶。變性蛋白質(zhì)不能結(jié)晶,所以所以凡結(jié)晶狀態(tài)的蛋白質(zhì)都能保持天然狀態(tài)。凡結(jié)晶狀態(tài)的蛋白質(zhì)都能保持天然狀態(tài)。2021-9-8南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院842021-9-884南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南

36、京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2021/2/685 谷氨酸結(jié)晶谷氨酸結(jié)晶2021/2/686固相析出法的應(yīng)用固相析出法的應(yīng)用2021/2/687例例1: 1:尿激酶的沉淀分離尿激酶的沉淀分離n尿激酶尿激酶: :分離方法包括沉淀法、吸附分離方法包括沉淀法、吸附法、層析法法、層析法n沉淀法沉淀法: :q金屬離子形成復(fù)合鹽金屬離子形成復(fù)合鹽q脫鹽脫鹽q鹽析鹽析2021/2/688Zn Zn 離子沉淀尿激酶離子沉淀尿激酶低濃度時(shí)低濃度時(shí),zn 能選擇沉淀尿激酶。能選擇沉淀尿激酶。在在3mM可得可得85-92 回收率回收率,而沉而沉淀物的量并不多淀物的量并不多;加大加大Zn 濃度濃度雖然能提高有限

37、回收雖然能提高有限回收率率,但沉淀物量大但沉淀物量大,純度降低。純度降低。沉淀量沉淀量酶活酶活2021/2/689EDTA 溶出效應(yīng)2021/2/690硫酸銨溶解尿激酶鋅絡(luò)合物n硫酸銨的選用硫酸銨的選用n1) 1)它在低濃度時(shí)可能有鹽溶作用它在低濃度時(shí)可能有鹽溶作用, ,促進(jìn)沉淀蛋促進(jìn)沉淀蛋 白溶解白溶解; ;n2)2)因?yàn)楸旧碛幸驗(yàn)楸旧碛蠳HNH4 4+ +, ,與與Zn Zn 2+2+有絡(luò)合作用有絡(luò)合作用, ,有有 利于沉利于沉淀物溶解淀物溶解; ;n3)3)硫酸銨為鹽析所用硫酸銨為鹽析所用, ,在最終鹽析中在最終鹽析中, ,只需補(bǔ)只需補(bǔ) 加規(guī)定量即可加規(guī)定量即可, ,而不引入其他成分。而

38、不引入其他成分。2021/2/691尿激酶鹽析沉淀尿激酶鹽析沉淀沉淀量沉淀量 回收率回收率 純度純度2021/2/692例例2:檸檬酸的生產(chǎn)檸檬酸的生產(chǎn)n檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸, ,它在食品、醫(yī)藥、化工、它在食品、醫(yī)藥、化工、皮革、環(huán)保等工業(yè)部門都有廣泛的用途。皮革、環(huán)保等工業(yè)部門都有廣泛的用途。n目前檸檬酸極大多數(shù)是通過(guò)微生物發(fā)酵法（黑曲霉）目前檸檬酸極大多數(shù)是通過(guò)微生物發(fā)酵法（黑曲霉）生產(chǎn)生產(chǎn), ,n提取工藝中提取工藝中, ,目前大多通過(guò)沉淀法制備（碳酸鈣沉淀目前大多通過(guò)沉淀法制備（碳酸鈣沉淀及硫酸酸解）及硫酸酸解）2021/2/693標(biāo)準(zhǔn)沉淀法回收檸檬酸流程圖標(biāo)

39、準(zhǔn)沉淀法回收檸檬酸流程圖加熱到加熱到70度度pH1.82.0 過(guò)濾2021/2/694例例3:胰蛋白酶的提取胰蛋白酶的提取從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶工藝從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶工藝n胰蛋白酶原的溶解胰蛋白酶原的溶解: :酸性條件下穩(wěn)定酸性條件下穩(wěn)定n溶解液中含有大量的酸性雜蛋白（溶解液中含有大量的酸性雜蛋白（pI10.8)pI10.8)n濃縮分離胰蛋白酶原（鹽析）濃縮分離胰蛋白酶原（鹽析）n溶解激活（酶原溶解激活（酶原- -酶）酶）n胰蛋白酶的進(jìn)一步分離胰蛋白酶的進(jìn)一步分離: :酶溶液中糜蛋白彈性蛋白等與酶溶液中糜蛋白彈性蛋白等與胰蛋白酶在不同的鹽濃度下溶解度不同胰蛋白酶在不同的鹽濃度下溶解度不

40、同2021/2/695胰蛋白酶的提取胰蛋白酶的提?。ǘ┮鹊鞍酌冈せ睿ǘ┮鹊鞍酌冈せ預(yù).A.濾餅溶解濾餅溶解, , 加入無(wú)水加入無(wú)水CaClCaCl2 2, ,邊加邊攪拌邊加邊攪拌, ,最終含有最終含有0.1M CaCl0.1M CaCl2 2; ;B.B.5MNaOH5MNaOH調(diào)調(diào)pHpH至至8.0,8.0,加極少量胰酶攪拌加極少量胰酶攪拌, ,于室溫下活化于室溫下活化8 81010小時(shí)小時(shí); ; C.C.活化完成活化完成, ,用用2.5M H2.5M H2 2SOSO4 4調(diào)調(diào)pHpH至至2.5-3.02.5-3.0, ,抽濾除去抽濾除去CaSOCaSO4 4沉淀。沉淀。（一）豬胰蛋白酶原的提?。ㄒ唬┴i胰蛋白酶原的提取1.1.胰臟絞碎加入胰臟絞碎加入2 2倍體積冷乙酸倍體積冷乙酸 (pH2.5)(pH2.5)低溫?cái)嚢璧蜏財(cái)嚢?424小時(shí)小時(shí), ,過(guò)濾過(guò)濾; ;2.2.濾液用濾液用2.5M H2.5M H2