基因工程18265

1、精品文檔 你我共享 知識(shí)改變命運(yùn) 基因工程 1、名詞解釋 基因：一段可以編碼具有某種生物學(xué)功能物質(zhì)的核苷酸序列。 移動(dòng)基因：又稱為轉(zhuǎn)位因子，由于它可以從染色體基因組上的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置，甚至在不同的染色 體之間躍遷，因此又叫做跳躍基因。它又分為插入序列、轉(zhuǎn)位子、逆轉(zhuǎn)座子。 斷裂基因：是指編碼序列不連續(xù)的間斷基因，最初在腺病毒中發(fā)現(xiàn)。 假基因：類似于基因但不表達(dá)的DNA序列。不表現(xiàn)任何功能，是基因的退化形式。 管家基因和奢侈基因：具有相同遺傳信息的同一個(gè)體細(xì)胞間其所利用的基因并不相同，有的基因活動(dòng)是維持細(xì) 胞基本代謝所必須的，而有的基因則在一些分化細(xì)胞中活動(dòng)，這正是細(xì)胞分化、生物發(fā) 育的

2、基礎(chǔ)。前者稱為管家基因，而后者被稱為奢侈基因。 基因工程:也叫基因操作、遺傳工程、重組體DNA技術(shù)。指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子, 構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞中內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定的繁殖。 克?。菏侵敢粋€(gè)祖先通過(guò)無(wú)性繁殖方式產(chǎn)生的后代，或具有相同遺傳性狀的DNA分子、細(xì)胞或個(gè)體所組成的特 殊的生命群體。 2、重復(fù)基因 不重復(fù)的唯一序列（只有一個(gè)拷貝）：包括大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和基因間間隔序列 低度重復(fù)序列（V 10個(gè)拷貝） 中度重復(fù)序列（10到幾百個(gè)拷貝） 特點(diǎn)：、重復(fù)單位序列相似，但不完全一樣 、散在分布于基因組中 、序列的長(zhǎng)度和拷貝數(shù)非

3、常不均一 、中度重復(fù)序列一般具有種屬特異性，可作為DNA標(biāo)記 高度重復(fù)序列（幾百個(gè)拷貝到幾百萬(wàn)個(gè)拷貝）：衛(wèi)星DNA（Satellite DNA） 3、重疊基因或嵌套基因類型 一個(gè)基因的核苷酸序列完全包含在另一個(gè)核苷酸序列中。由于它們的讀碼結(jié)構(gòu)互不相同，因此編碼著不 同的蛋白質(zhì)。 2個(gè)基因的核苷酸序列之末端密碼子相互重疊。 4、基因的特點(diǎn) I、基因是可以切割的 、多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系 、基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代 工業(yè)牛物發(fā)酵技術(shù)和現(xiàn)代生 、不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ) 、基因是可以轉(zhuǎn)移的 、遺傳密碼是通用的 5、生物技術(shù)可以分為傳統(tǒng)生物技術(shù) 現(xiàn)代生物技術(shù)包括基因工程、蛋白質(zhì)工程

4、、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等五大工程技術(shù) 6、基因工程的特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn) 特點(diǎn)：分子水平上的操作，細(xì)胞水平上的表達(dá)。 優(yōu)點(diǎn)：打破了常規(guī)育種難以突破的物種界限，可以使原核生物與真核生物之間、動(dòng)物與植物之間、甚至人與 其他生物之間的遺傳信息進(jìn)行重組和轉(zhuǎn)移。 7、基因工程誕生的技術(shù)基礎(chǔ) 質(zhì)粒作為基因工程載體 瓊脂糖凝膠電泳和 Southern轉(zhuǎn)移雜交技術(shù) 、 、 、DNA分子的體外切割和連接技術(shù) 、大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立 8、基因工程研究的步驟（基本技術(shù)路線） PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。 、從復(fù)雜的生物體基因組中，經(jīng)酶切消化或 精品文檔你我共享 、在體外，將帶有目的基因的外源DN

5、A片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇性標(biāo)記的載體分子上，形成 重組DNA分子。 、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，并與之一起增殖。 、從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。 、從篩選出的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究之用。 、將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需 要的物質(zhì)。 9、基因工程研究的主要內(nèi)容 基礎(chǔ)研究、 、 應(yīng)用研究 基因工程藥物研究 、 基因工程克隆載體的研究 基因工程工具酶的研究 、基因工程受體系統(tǒng)的研究 、基因工程新技術(shù)研究 、目的基因的研究 、 、 10、實(shí)驗(yàn)室

6、的物理安全分 4級(jí)：P1P4級(jí)。實(shí)驗(yàn)室的生物安全分 、用于提高奶酪產(chǎn)量 、基因治療研究、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物 、其他方面的應(yīng)用 3級(jí)（大腸桿菌）：EK1EK3級(jí) 第二章、基因工程操作的主要技術(shù)原理 名稱解釋 PCR技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故稱基因的體外擴(kuò)增法。 核酸的分子雜交：將帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或 RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段就會(huì)退火 形成雙鏈結(jié)構(gòu)的技術(shù)稱為核酸的分子雜交。如果退火的核酸來(lái)自不同的生物有機(jī)體，所形 成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。 印漬技術(shù)：指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印漬）到固定化介質(zhì)并加以檢測(cè)分析的技術(shù)

7、，目前廣泛應(yīng) 用于DNA、RNA、和蛋白質(zhì)的檢測(cè) 。 NC膜 探針：一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在 上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 原位雜交：也叫菌落或噬菌斑雜交，指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位 結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的DNA或RNA探針雜交。 平臺(tái)效應(yīng)：PCR擴(kuò)增過(guò)程后期會(huì)出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。 基因操作的主要技術(shù)：凝膠電泳、PCR技術(shù)、核酸分子雜交、 DNA的提取與純化、核酸序列分析 濃度越高，孔隙越小, 凝膠的分辨能力 凝膠的分辨能力與凝

8、膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小， 其分辨能力就越強(qiáng)。濃度越低，孔隙越大，其分辨能力越弱。 、瓊脂糖凝膠分辨 DNA片段的范圍為 0.250kbp之間、聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為11000bp之間 注：凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（EtBr ）染料對(duì)核酸分子進(jìn)行染色 4、PCR技術(shù)、原理及其基本過(guò)程 PCR技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故稱基因的體外擴(kuò)增法。 原理：PCR技術(shù)基本原理類似于 DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 由變性一退火一延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成 基本過(guò)程： 、模板DNA的變性

9、（95C）:模板DNA經(jīng)加熱至95C左右一定時(shí)間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增 形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合 、模板DNA與引物的退火（復(fù)性）（55C）:模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物 與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合 、引物的延伸（72C）： DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序 列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。 注：每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 精品文檔 你我共享 5、 6、 PCR 體系基本成分 模板 DNA 特

10、異性引物 dNTP 耐熱的 DNA 聚合酶（ Taq 酶） 緩沖溶液 PCR 引物設(shè)計(jì)原則 引物長(zhǎng)度約為1630 bp ;常用為20bP左右。 引物擴(kuò)增跨度： 以 200-500bp 為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至 引物的解鏈溫度：兩個(gè)引物之間的 Tm 避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補(bǔ)序列 的形成。 G+C 含量： 盡量控制在 40%至 60%之間， 10kb 的片段。 值差異最好在2-5 C 。 （3 個(gè)堿基），從而減少引物二聚體的形成以及引物內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu) 4 種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列。 PCR 7、 引物的 3末端特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因

11、末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致 失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 隆很有好處。 Taq DNA 聚合酶特點(diǎn) 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克 、 Taq DNA 聚合酶活性：具有較高的熱穩(wěn)定性。 特性： 、57 3方向的聚合活性； 、逆轉(zhuǎn)錄酶活性; 、缺乏3 7 5 方向的外切酶活性， 、5 7 3方向的外切酶活性； 、較弱的非模板依賴性； 因而無(wú)校正功能。 Taq DNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，出錯(cuò)率大約是1X 10-5/bp 、無(wú)機(jī)離子和抑制劑 Taq DNA聚合酶的活性對(duì) Mg2+濃度和單價(jià)離子（K+或NH）的性質(zhì)和濃度較敏感。 、保真性 8、重要的 P

12、CR 衍生技術(shù)：反轉(zhuǎn)錄 PCR 技術(shù)、原位 PCR 技術(shù)、實(shí)時(shí) PCR 技術(shù) 9、 PCR的主要用途：、目的基因的克隆、基因的體外突變、DNA的微量分析： 10 、印漬技術(shù)的類別及應(yīng)用 1）.DNA印漬技術(shù)：基因組DNA重組質(zhì)粒和噬菌體的分析 2）.RNA印漬技術(shù):mRNA的分析 12、分離核酸原則： 1 ）、溫度不要過(guò)高； 3）、保持一定離子強(qiáng)度 ; 13、防止核酸的生物降解方法 、 DNA 酶抑制劑 、金屬離子螯合劑： DNA 酶需要金屬二價(jià)離子 3）. 蛋白質(zhì)的印漬分析 : 蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究 2）、控制 pH 值范圍 （pH 值 5-9）; 4）、減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切

13、力 Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑，可抑制 DNA 酶活性。 、陰離于型表面活性劑：SDS 、 RNA 酶（ RNAase） 抑制劑： RNAase 分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 、皂土（ bentonite ） 作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase,使其失活。 、DEPC（二乙基焦碳酸鹽）（C2H5OCOOCOOC 2H 5）:粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。 作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中 His結(jié)合使蛋白變性。 使用注意： 1）、 2）、 3）、 4）、 精品文檔 DEPC 也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。 容易降解，保存在 4 C或液氮中；

14、 提 RNA 時(shí)， 劇毒。 0.1% DEPC 浸泡器皿 37 C 、肝素 、 RNase 阻抑蛋白 14 、細(xì)胞的破碎方法 、高速組織搗碎機(jī)搗碎 、液氮研磨法 、復(fù)合硅酸鹽 、氧釩核糖核苷復(fù)合物 你我共享 但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大 2 h。 (VRC) 、玻璃勻漿器勻漿 、化學(xué)處理法（SDS、LDS、吐溫80等） 、加入濃鹽溶液（如 NaCI） 1001000 倍。 、超聲波處理法 、生化法（溶菌酶、纖維素酶等） 、加入SDS 15、核蛋白的解聚、變性蛋白的去除方法： 16、核酸有機(jī)沉淀劑 乙醇 優(yōu)點(diǎn)：對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。 缺點(diǎn)：需要量大，一般要求

15、低溫操作。 異丙醇 優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的 DNA 樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。 缺點(diǎn)： 易使鹽類、 蔗糖與 DNA 共沉淀 異丙醇難以揮發(fā)除去。 所以， 最后用 70乙醇漂洗數(shù)次。 聚乙二醇（ PEG ） 優(yōu)點(diǎn)：可用不同濃度的 PEG 選擇沉淀不同相對(duì)分子質(zhì)量的 DNA 片段。應(yīng)用 6000相對(duì)分子質(zhì)量 的 PEG 進(jìn)行 DNA 沉淀時(shí)，使用濃度與 DNA 片段的大小成反比。 注意：PEG沉淀一般需加 0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L的MgCl 2。要除去 DNA沉淀中PEG。 精胺：精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀 DNA。 結(jié)合后，使 DNA

16、在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì) 分開(kāi)，達(dá)到純化 DNA 的目的。 0 C冰水，1015min , DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。 、 、 、 、 原理：精胺與 DNA 雜質(zhì)與 DNA 17、核酸沉淀的溫度和時(shí)間：一般使用 18、Sanger 雙脫氧鏈終止法 最大特點(diǎn)是引入了雙脫氧核苷三磷酸（2, ,3 -ddNTP ）作為鏈終止劑，2, ,3 -ddNTP與普通的dNTP不 同之處在于前者的脫氧核糖的3,位又少了個(gè)羥基。它可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸鏈的3,羥基形 成磷酸二酯鍵， 但卻不能再與下一個(gè)核苷酸縮合， 結(jié)果使得多核苷酸鏈的延伸終止。 如果在 DNA 的合成反

17、應(yīng)中， 除了加入4種正常的dNTP外，再加入一種少量的 ddNTP，那么多核苷酸鏈的延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異 的鏈終止展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng)，所以反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的長(zhǎng)短不一的核苷酸鏈。在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入 4種不同的ddNTP，結(jié)果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別終止于每一個(gè)A，每一個(gè)G,每一個(gè)C,每一個(gè)T 的位置上。對(duì)這 4 組核苷酸鏈進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,以區(qū)分長(zhǎng)度差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA ，就可讀出序列。 第三章、分子克隆工具酶 1 、名詞解釋 工具酶：基因工程技術(shù)中能用于 DNA 和 RNA 的合成、連接、切割和修飾的各種酶。 限制：指一定類型的細(xì)菌可以通過(guò)限制酶的作用， 破壞

18、入侵的噬菌體 DNA ，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。 限制作用：實(shí)際就是限制性內(nèi)切酶降解外源 DNA ，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。 修飾：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過(guò)甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭自身 限制性酶的破壞。 修飾作用：宿主細(xì)胞通過(guò)甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的目的。 限制性核酸內(nèi)切酶： 是一類能夠識(shí)別雙鏈 DNA 分子中的某種特定核苷酸序列， 并由此切割 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的 核酸水解酶。 ,降低酶切反應(yīng)的特 星活性： 在極端非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下， 限制性核酸內(nèi)切酶能切割與特異識(shí)別序列相似的序列 異性 ，這種改變的特殊性稱為限制性核酸內(nèi)切

19、酶的星活性。 同裂酶：不同來(lái)源的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別與切割相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。 精品文檔 你我共享 同尾酶：不同來(lái)源的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別與切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端, 這類酶稱為同尾酶。 20 a L反應(yīng)液中反應(yīng)1h，使1卩g標(biāo)準(zhǔn)DNA 1個(gè)單位限制性核酸內(nèi)切酶：在建議使用的緩沖液及溫度下，在 完全消化所需的酶量。 2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則 （小寫(xiě)，斜體）代 、限制性核酸內(nèi)切酶第一個(gè)字母（大寫(xiě)，斜體）代表該酶的宿主菌屬名；第二、三個(gè)字母 表宿主菌種名。 、第四個(gè)字母代表宿主菌的株或型（strain）。 、若從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內(nèi)切

20、酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。 3、限制性核酸內(nèi)切酶的分類及其主要特性 表一：限制性核酸內(nèi)切酶的分類及其主要特性 一分類 主要特性_ I型 n型 川型 限制修飾 多功能 單功能 雙功能 蛋白結(jié)構(gòu) 異源三聚體 同源三聚體 異源二聚體 輔助因子 ATP、Mg2+、SAM Mg 2+ ATP、Mg2+ 識(shí)別序列 距識(shí)別序列1kb處 4-6bP回文序列 距識(shí)別序列下游 24-26bP 處 切割位點(diǎn) 隨機(jī)性切割 識(shí)別序列內(nèi) 或附近特異切割 隨機(jī)性切割 4、星活性產(chǎn)生的原因 、反應(yīng)體系中甘油的濃度大于5%。 、酶用量過(guò)大，大于 100U/微克DNA。 、低離子強(qiáng)度，小于 25mmol/L。

21、 、高pH,大于8.0。 、含有機(jī)劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等。 、Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價(jià)離子的存在。 5、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 、DNA羊品的純度 DNA樣中混有蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA SDS NaCI等，都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： 加大酶的用量，1卩g DNA用10U酶 加大反應(yīng)總體積 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 、DNA樣品的甲基化程度 大腸桿菌中的dam甲基化酶在5 GATC3序列中的腺嘌呤 N6位引入甲基，受其影響的酶有 Bel I Mbol等, 但 BamHL Bglll、Sau3A I 不受影響。 大腸桿

22、菌中的dem甲基化酶在5 CCAGG3或5 CCTGG3序列中的胞嘧啶 C5位上引入甲基，受其影響的 酶有EeoRII等，但Bgll、Kpnl不受影響。 采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來(lái)制備質(zhì)粒DNA可防止DNA的甲基化。 、酶切反應(yīng)的溫度 多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是 37C，女0 SmaI為25C或30C , SfiI為50C。 反應(yīng)溫度過(guò)度或過(guò)低都會(huì)影響酶活性，甚至導(dǎo)致酶失活 、DNA分子結(jié)構(gòu) 表二：DNA聚合酶的特性 聚合酶的名稱 3/7 5/核酸外 切酶活性 5 / 7 3 /核酸 外切酶活性 聚合反應(yīng)速率 持續(xù)合成能力 E.coli DNA聚合酶 低 有 中速 低 Klenow大片段酶 低 無(wú)

23、 中速 低 反轉(zhuǎn)錄酶 無(wú) 無(wú) 低速 中 T4DNA聚合酶 高 無(wú) 中速 低 天然的 T7DNA聚合酶 高 無(wú) 快速 高 化學(xué)修飾的 T7DNA聚合酶 低 無(wú) 快速 高 遺傳修飾的 T7DNA聚合酶 無(wú) 無(wú) 快速 高 Taq DNA聚合酶 無(wú) 有 快速 高 精品文檔 某些酶切割超螺旋質(zhì)粒 DNA時(shí)，酶量比切割線性 點(diǎn)，其切割效率也不同。 、核酸內(nèi)切酶的緩沖液 高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端 低特異性，即所謂的“星活性”現(xiàn)象。 DNA聚合酶 你我共享 DNA時(shí)高出多倍，可高達(dá) 20倍。在同一分子內(nèi)不同位 pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生 Klenow酶的基本性質(zhì) 、大腸

24、桿菌 DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即Klenow酶。 、Klenow酶仍擁有53，的DNA聚合酶活性和 3,5，的核酸外切酶活性，但失去了5 3，的 核酸外切酶活性。 8、 Klenow酶的基本用途 ? 補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的 5 /粘性凹出末端 ? 抹平DNA的 3/粘性凸出末端 ? DNA片段的同位素末端標(biāo)記 ? cDNA第二鏈的合成 ? 雙脫氧末端終止法測(cè)定 DNA序列 T4 DNA聚合酶的基本用途 ? 切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的 3 /粘性末端 ? DNA片段的同位素末端標(biāo)記 10、T4 DNA連接酶的作用機(jī)制 、ATP+DNA ligase（E）E-AM

25、P+PPi。 、E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的 5磷酸根上，使其活化，釋放出酶。 AMP 、活化的5磷酸根與相鄰的3 羥基形成3, 5磷酸二酯鍵，并釋放出 11、提高平頭末端連接效率的方法 、加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）。 、加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)。 、加入10%PEG800（X聚凝劑），促進(jìn)大分子之間的有效作用。 、加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCI）,最終濃度150-200 mmol/L。 精品文檔你我共享 12、基因工程中常用的工具酶 表三：基因工程中常用的工具酶 工具酶 功能 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異序列，切割 DNA DNA連接酶 催化DNA中相鄰的5磷

26、酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵， 使DNA切 口封合或使兩個(gè) DNA分子或片段連接 DNA聚合酶I 、合成雙鏈cDNA分子或片段連接、缺口平移制作高比活探針 、DNA序列分析、填補(bǔ)3 末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶1大片段，具有完整DNA聚合酶1的5/t 3聚合、j 5外切活性， 而無(wú)5J 3外卜切活性。常用于 cDNA第二鏈合成，雙鏈 DNA 3末端標(biāo)記等 反轉(zhuǎn)錄酶 、合成cDNA 、替代DNA聚合酶1進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或 DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針 末端轉(zhuǎn)移酶 在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 第四章、基

27、因工程載體 1、名詞解釋 載體：是指將外源DNA或基因攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。 克隆載體：是指用于擴(kuò)增或保存外源DNA片段而設(shè)計(jì)的載體。 質(zhì)粒：獨(dú)立于染色體外能夠進(jìn)行自我復(fù)制的雙鏈DNA分子。作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。 質(zhì)粒的不相容性：又稱質(zhì)粒的不親和性。指兩種不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。 （親緣關(guān)系密切的，野生型和其衍生質(zhì)粒） 質(zhì)粒的拷貝數(shù)：是指每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量。 LacZ a -互補(bǔ)。 入噬菌體DNA a -互補(bǔ)：是指3 -半乳糖苷酶基因（LacZ）上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的 基因的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，從而產(chǎn)生

28、具有3-半乳糖苷酶學(xué)活性的蛋白，這種現(xiàn)象就稱為 cos位點(diǎn)：入噬菌體DNA的兩個(gè)5 末端為12bp的單鏈，兩端序列互補(bǔ)成為天然的粘性末端”。 進(jìn)入宿主菌體后，通過(guò)兩個(gè)末端互補(bǔ)結(jié)合而形成粘性末端位點(diǎn)，使整個(gè)DNA分子環(huán)化。 插入失活：在質(zhì)粒 P BR322的抗四環(huán)素基因上插入一個(gè)外源基因后，導(dǎo)致抗四環(huán)素基因失活，變成只對(duì)氨芐青霉 素有抗性，這樣就可通過(guò)對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來(lái)篩選是否有外源基因片段插入到載體中，這種篩 選方法稱為插入失活。 人工染色體載體：利用染色體的復(fù)制元件來(lái)驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體。 表達(dá)載體：在克隆載體基礎(chǔ)上，為使插入的外源DNA片段有效轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽，裝有強(qiáng)化外源基因

29、表達(dá)的強(qiáng)啟 動(dòng)子以及利于表達(dá)產(chǎn)物分泌、分離和純化的元件，這種載體稱為表達(dá)載體。 融合蛋白：是指通過(guò)將兩個(gè)或多個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框按一定順序連接在一起并通過(guò)表達(dá)而形成的雜合蛋白。 融合基因：是指應(yīng)用DNA體外重組技術(shù)，構(gòu)建的一類含兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同基因序列的雜合基因。 開(kāi)放閱讀框（ORF：起始于AUG止于UAA UGA UAG的連續(xù)的密碼子區(qū)域，是潛在的編碼區(qū)。 穿梭載體：能夠在兩類不同宿主細(xì)胞中復(fù)制、增殖和選擇的質(zhì)載體，裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子和篩選標(biāo) 記基因，便于基因克隆。 2、載體的分類及功能 分類： ? 按功能：克隆載體和表達(dá)載體，表達(dá)載體又分胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)載體。 ? 按工作方式

30、：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、人工染色體載體等。 ? 按受體細(xì)胞：原核細(xì)胞載體和真核細(xì)胞載體。 功能： ? 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。 ? 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力。 ? 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。 3、 克隆載體具備的條件 、載體都能攜帶外源 DNA片段（基因）進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)制，或整合到染色體 DNA上, 隨著染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。 、 、 、 載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)。 載體都具有合適的遺傳標(biāo)記基因。 載體都必須是安全的，不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物 細(xì)胞

31、，尤其是人的細(xì)胞。 、載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。 、載體在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。 、載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。 、載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。 4、克隆載體和表達(dá)載體的區(qū)別 克隆載體：主要是對(duì)目的基因克隆，建立DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，其上有復(fù)制子即可； 表達(dá)載體：能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強(qiáng)啟動(dòng)子； 標(biāo)記基因的分類及其作用 選擇標(biāo)記基因：用于鑒別目的載體的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)。 篩選標(biāo)記基因：用于區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，可將攜帶了外

32、源DNA片段的重組質(zhì)粒挑選出來(lái)。 6、 7、 8、 9、 PSC101質(zhì)粒載體：、是野生型的，沒(méi)有經(jīng)人工修飾的、是第一個(gè)真核生物的克隆載體、最先應(yīng)用 PBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) 、具有較小的分子量； 、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。 、具有較高的拷貝數(shù)。 天然DNA質(zhì)粒具有3種構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)狀 （cccDNA）、開(kāi)環(huán)（ocDNA）和線性（IDNA）構(gòu)型。 PUC18/19質(zhì)粒載體的組成、優(yōu)點(diǎn) 組成： ? 含有PBR322完整的Ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。 ? 含有大腸桿菌 艮半乳糖酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼 a-肽鏈的DNA序列，即lacZ 基因。 ? 在lacZ 基因

33、中靠近 5端的一段有 MCS區(qū)段，但并不破壞該基因的功能。 優(yōu)點(diǎn)： ? 具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，平均每個(gè)細(xì)胞可達(dá)500-700個(gè)拷貝。 ? 適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體,有來(lái)自大腸桿菌lac操縱子的lacZ 基因，所編碼的 a-肽鏈可參與 a-互補(bǔ)作用，在IPTG誘導(dǎo)和底物X-gal存在下，形成藍(lán)色和白色菌落篩選重組體。 ? 具有MCS區(qū)段，便于具有不同粘性末端的外源基因的插入。 10、質(zhì)?？寺≥d體用途 ? 用于保存和擴(kuò)增片段小于 2kb的目的基因。 ? 構(gòu)建基因組文庫(kù)和 cDNA文庫(kù)。 ? 可用于目的基因的測(cè)序。 ? 作為核酸雜交時(shí)探針的來(lái)源。 11、 、 、 入-DNA載體的

34、構(gòu)建、類型及其優(yōu)點(diǎn) 縮短長(zhǎng)度、刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) 加裝選擇標(biāo)記 、加裝選擇標(biāo)記imm434 、加裝選擇標(biāo)記lacZ 12、大腸桿菌基因表達(dá)載體的組成基因元件及常見(jiàn)表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌基因表達(dá)載體所需的主要元件： 、啟動(dòng)子 、SD序列 、篩選標(biāo)記 、其它調(diào)控基因 、終止子 、復(fù)制原點(diǎn)（7）、MCS 常見(jiàn)表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌 - 釀酒酵母穿梭載體 第五章、目的基因的克隆與鑒定 1、名詞解釋 基因庫(kù):特定生物體全基因組的集合（天然存在） 。 基因文庫(kù):從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建） 注:基因文庫(kù)分為:基因組文庫(kù)（含有全部基因） cDNA文庫(kù)（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)

35、基因） 感受態(tài):細(xì)胞處于能吸收周?chē)h(huán)境中 DNA 分子的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)。 轉(zhuǎn)化率：是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。 2、獲取目的基因的方法 、鳥(niǎo)槍法、cDNA法 、PCR法、化學(xué)合成法 、基因文庫(kù)的構(gòu)建 3、基因文庫(kù)的完備性 N之間的關(guān)系可用下式表示: 指：在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概率，它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù) N = ln （ 1P ） ln （ 1 f ） 其中：卩=任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸?kù)中）的概率 f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小 4、 基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因文庫(kù)

36、應(yīng)具備下列條件： 重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大 以減輕篩選工作的壓力 載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度 避免基因被分隔克隆 克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域以利克隆排序 克隆片段易于從載體分子上完整卸下 重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選 5、重組率 重組率=含有外源 DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù) 在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為2575% DNA重組的后續(xù)操作。 重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡(jiǎn)化 6、提高重組率方法 、提高外源 DNA片段與載體的分子比、載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)、加裝同聚尾末端 、 、 、 、 、 、 7、 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 限制性缺

37、陷型 ,能使重組 DNA 穩(wěn)定存在外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷 重組整合缺陷型，重組DNA和宿主染色體間不發(fā)生同源重組用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型 ， 便于重組體的篩選 感染寄生缺陷型 ， 安全性高，無(wú)治病性防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外 選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞利于外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累 8、轉(zhuǎn)化率的影響因素 、載體及DNA重組分子方面: 、載體本身的性質(zhì)： 、載體的空間構(gòu)象： 、插入片段的大?。?、受體細(xì)胞方面： 受體細(xì)胞必須與載體相匹配， 例如： pBR322 株的轉(zhuǎn)化率則較高 、轉(zhuǎn)化方法方面： 受體細(xì)胞的預(yù)處理：

38、影響最大 供受體的比例： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化方法： C孑+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 入-DNA轉(zhuǎn)染 電穿孔轉(zhuǎn)化 、 、 、 不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞， 質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高， 其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí) 對(duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低 其轉(zhuǎn)化率不同 經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM83 株，轉(zhuǎn)化率很低； 但對(duì)大腸桿菌 ED8767 0.1 ml 感受態(tài)細(xì)胞 109 個(gè)原生質(zhì)體 50 ng DNA 50 ng DNA 106 107/ mg DNA 105106 / mg DNA 107 108/mg DN

39、A 106 109/mg DNA 第六章、克隆基因的表達(dá) 1、名詞解釋 核糖體結(jié)合位點(diǎn) : 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上 還與mRNA勺翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的 翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA羽譯的起始效率主要由其 5 端的 結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS） SD序列：位于翻譯起始密碼子上游的 6-8個(gè)核苷酸序列（5 UAAGGAGG3 ） 遺傳背景清楚，便于基因操作 表達(dá)水平高，遺傳較穩(wěn)定 優(yōu)良的工業(yè)性能：繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便 被美國(guó) FDA 認(rèn)定為安全的重組藥

40、物生產(chǎn)系統(tǒng) 2、 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 、 、 、 、 缺點(diǎn)： 、缺乏翻譯后修飾加工系統(tǒng)（不能表達(dá)糖基化蛋白、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白等） 、胞內(nèi)缺乏高效的表達(dá)產(chǎn)物折疊機(jī)制（形成包涵體），分泌機(jī)制不完善 、細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素 3、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)原理 I、表達(dá)載體的基本元件 、目的基因：編碼外源蛋白的結(jié)構(gòu)基因 、轉(zhuǎn)錄元件：?jiǎn)?dòng)子、終止子 、翻譯元件：核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn) 、克隆元件：克隆位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因 、翻譯后元件（非必須）：信號(hào)肽、融合肽 n、啟動(dòng)子與外源基因表達(dá) 知識(shí)改變命運(yùn) 、 、 、 精品文檔 你我共享 啟動(dòng)子是最強(qiáng)的表達(dá)調(diào)控元件，啟動(dòng)子的強(qiáng)弱對(duì)

41、表達(dá)水平有決定性影響。 據(jù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式分組成型和誘導(dǎo)型 Plac、 Ptrp 、 Ptac、 PL/ PR 2類 、 PT7 是最常用的啟動(dòng)子 川、其它元件與外源基因表達(dá) 、終止子 、核糖體結(jié)合位點(diǎn) 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：、能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作、能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 缺點(diǎn)：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過(guò)有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到 具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，但這也是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子 中的 Cys 殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^(guò)30% 。 包涵體及其形成原因

42、 包涵體：在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包 裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（IB）。 形成原因：胞內(nèi)新合成肽的折疊效率跟不上合成速度。 鹽酸胍和尿素為什么能溶解包涵體？ 鹽酸胍和尿素能拆開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。能有效促 進(jìn)包涵體溶解變性 以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：、目的蛋白穩(wěn)定性高、目的蛋白易于分離、目的蛋白末端完整 缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn) 行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率

43、通常要比包涵體方式低很多，因此目前用 于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。 以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：、目的蛋白穩(wěn)定性高、目的蛋白易于分離 、目的蛋白表達(dá)率高、目的蛋白溶解性好 缺點(diǎn)：、融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲目的蛋白。 、在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段。 試舉出常用Tag，并加以簡(jiǎn)單說(shuō)明 His6 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（ GST） 硫氧化還原蛋白（ TrxA ） 麥芽糖結(jié)合蛋白（ MBP ） Strep.Tag（8）-streptavidin 外膜蛋白（ OmpF ） b-半乳糖苷酶（LacZ） 泛素蛋白（ Ubi） 、質(zhì)?？截悢?shù)（復(fù)制子）

44、、外源基因 4、 5、 6、 7、 8、 9、 易于親和層析、不影響目的蛋白結(jié)構(gòu)、無(wú)免疫原性 維持良好空間構(gòu)象 維持良好空間構(gòu)象 pTrxFus 促進(jìn)分泌 高親和力，溫和洗脫，效果好 促進(jìn)分泌 免疫親和層析 維持良好空間構(gòu)象 10、寡聚型異源蛋白表達(dá)法的優(yōu)缺點(diǎn) 、目的蛋白高效表達(dá)、穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽 11、 芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)、缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 、目的產(chǎn)物回收困難 、 、 、 、 、 強(qiáng)大的分泌功能：如蛋白酶、淀粉酶， 不形成包涵體，產(chǎn)物可正確折疊 非病原菌，無(wú)內(nèi)毒素和外毒素，被美國(guó) 容易操作，背景清楚 易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)旺盛 20g/L FDA 認(rèn)定 為 GRAS （總體安全）系統(tǒng) 缺點(diǎn)：同源蛋白

45、表達(dá)高（ g/L） 、異源蛋白低 （mg/L） 知識(shí)改變命運(yùn) 12、芽孢桿菌基因工程轉(zhuǎn)化方法 1）、堿金屬離子誘導(dǎo)法（飽和濃度的K+、CsT） 2 ）、電激法轉(zhuǎn)化 3 ）、接合反應(yīng) 4 ）、原生質(zhì)體法 13、 酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì) 全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便 具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng) 大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉 能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中 含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（ GRAS ） 酵母菌是最簡(jiǎn)單的真核模式生物 1 ）、 2 ）、 3 ）、 4 ）、 5 ）、 6 ）、 1

46、4、人工構(gòu)建酵母質(zhì)粒的共同特點(diǎn) 含有大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制元點(diǎn)，以便克隆操作 含有一定數(shù)量供克隆操作的單一酶切位點(diǎn) 含有在酵母和大腸桿菌中進(jìn)行選擇的雙標(biāo)記 除 、 、 、 、 15、 YEp質(zhì)粒: Yip型質(zhì)粒外均為穿梭載體 *復(fù)制子：2m質(zhì)粒來(lái)源的ori *拷貝數(shù)50-100 *不穩(wěn)定 培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。 YRp質(zhì)粒:*復(fù)制子：染色體來(lái)源的 ARS *拷貝數(shù)50-100 *不穩(wěn)定 培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá) YCp質(zhì)粒： 50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。 在 YRp中引入CEN ； CEN :著絲粒序列，平均分配 *復(fù)制子：染色體來(lái)源的 ARS *拷貝數(shù)：1-5 在YCp中弓I入TEL TEL :端粒，染色體末端序列，利于線性DNA末端穩(wěn)定 穩(wěn)定性：隨著插入 DNA片段的增大而增加 用途：大型基因文庫(kù)