黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶

1、黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)-淀粉酶前言：-淀粉酶能隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，所得產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖單位碳原子為構(gòu)型，同時(shí)該酶能使淀粉漿的粘度下降，因此又稱為液化酶。耐酸性-淀粉酶是在酸性條件下水解淀粉的酶類(lèi)，其最適pH在4.0左右。自從日本研究者 YasujiMinoda等人用黑曲霉生產(chǎn)耐酸性-淀粉酶以來(lái)，各國(guó)都對(duì)耐酸性-淀粉酶進(jìn)行了研究。通過(guò)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)-淀粉酶的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，熟悉發(fā)酵罐的構(gòu)造和使用方法。初步了解發(fā)酵生產(chǎn)的原理和常規(guī)發(fā)酵參數(shù)的檢測(cè)方法。整個(gè)實(shí)驗(yàn)按照“菌種的培養(yǎng) 空消 實(shí)消接種 發(fā)酵 放罐”的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行。在整個(gè)發(fā)酵的過(guò)程中，每隔6h取一次發(fā)酵液樣品

2、檢測(cè)其pH值、酶活、殘?zhí)橇考吧锪克膫€(gè)生理指標(biāo)。最后將所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，可以得出整個(gè)發(fā)酵過(guò)程各物質(zhì)的生成和消耗的變化規(guī)律以及如何調(diào)整培養(yǎng)條件來(lái)提高發(fā)酵生產(chǎn)的效率，對(duì)大工業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。正文：一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解發(fā)酵罐的幾大系統(tǒng)組成，即空氣系統(tǒng)、蒸汽系統(tǒng)、補(bǔ)料系統(tǒng)、進(jìn)出料系統(tǒng)、溫度系統(tǒng)、在線控制系統(tǒng)。2掌握發(fā)酵罐空消的具體方法及步驟3掌握發(fā)酵罐進(jìn)料及實(shí)消的具體方法及步驟4掌握發(fā)酵罐各系統(tǒng)的控制操作方法二、 實(shí)驗(yàn)原理1. 蒸汽系統(tǒng)：蒸汽發(fā)生器：主要用于滅菌，分為自動(dòng)加水和手動(dòng)加水兩種方式。2. 溫度系統(tǒng)：(1) 夾套升溫：蒸汽通入夾套。(2) 夾套降溫：冷水通入夾套，下進(jìn)水，上出水

3、。(3) 發(fā)酵過(guò)程自動(dòng)控溫系統(tǒng)3. 空氣系統(tǒng)：空氣除菌設(shè)備：空壓機(jī) 貯氣罐 油水分離器 空氣流量計(jì) 空氣過(guò)濾器 發(fā)酵罐4. 補(bǔ)料系統(tǒng)：補(bǔ)加培養(yǎng)基、消泡劑、酸堿等。5. 在線控制系統(tǒng)6. 進(jìn)出料系統(tǒng)：進(jìn)料口（接種口）、出料口（取樣口）7. 管道：包括水流通管道和氣流通管道水流通：冷卻用水：水經(jīng)過(guò)進(jìn)水管道 發(fā)酵罐夾套 出水口 保溫用水：關(guān)閉進(jìn)出水管道閥門(mén)（水注滿后） 加熱保溫 進(jìn)入夾套氣流通：蒸汽發(fā)生器 蒸汽管道 空氣過(guò)濾器/發(fā)酵罐 進(jìn)入罐內(nèi)空氣：空壓機(jī) 貯氣罐 油水分離器 空氣流量計(jì) 空氣過(guò)濾器 發(fā)酵罐三方法與注意事項(xiàng)原則1. 通蒸汽前先關(guān)閉所有閥門(mén)2粗過(guò)濾器不空消也不實(shí)消，要定期處理，所以必須

4、關(guān)閉通向粗過(guò)濾器的閥門(mén)。3活蒸汽，滅過(guò)頭，即尾汽不能關(guān)死，要保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分壓。4罐體排汽口排汽，并保持罐內(nèi)正壓。5空氣過(guò)濾系統(tǒng)只空消，不實(shí)消，以免罐中物料沖入過(guò)濾器內(nèi)。但空消一結(jié)束，即要通入無(wú)菌空氣吹干管路并保壓，避免染菌。6進(jìn)蒸汽時(shí)順著蒸汽管路開(kāi)閥門(mén)，結(jié)束時(shí)逆著進(jìn)路關(guān)閥門(mén)，先開(kāi)尾閥后開(kāi)主閥，結(jié)束時(shí)先關(guān)主閥后關(guān)尾閥。8蒸汽一停，即由無(wú)菌空氣充入保持罐內(nèi)正壓。 空消先開(kāi)啟蒸汽發(fā)生器，自有蒸汽產(chǎn)生并排掉管路中冷凝水后，按以下步驟進(jìn)行：1先關(guān)閉所有閥門(mén)，檢查處是否關(guān)緊密封，打開(kāi)罐上方排氣口。2蒸汽先進(jìn)空氣系統(tǒng)，蒸汽蒸汽過(guò)濾器分過(guò)濾器，無(wú)論蒸汽走到哪一路得先放尾閥，放出冷凝水，排

5、掉冷空氣，待有蒸汽沖出后調(diào)小，打開(kāi)主閥。3再進(jìn)罐體：由主路進(jìn)罐，然后通入取料管路，再入補(bǔ)料系統(tǒng)（兩邊）。4罐壓升至所需溫度（121）時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，保溫保壓30min。保壓方式：（1）調(diào)節(jié)主汽路進(jìn)汽閥門(mén)控制進(jìn)汽量；（2）調(diào)節(jié)排氣口排氣量大小或尾閥放汽量。5結(jié)束空消：（1）逆著蒸汽進(jìn)路關(guān)，先關(guān)近罐閥。（2）同時(shí)準(zhǔn)備好壓縮空氣確保蒸汽一停即充入無(wú)菌壓縮空氣以維持空氣系統(tǒng)及罐內(nèi)的正壓。近罐空氣閥的尾閥要一直微開(kāi)啟。注意：空消前應(yīng)檢查夾套中是否殘留了冷水，若有，影響罐體升溫，須自?shī)A套出水口將水放出。 種子制備：接種黑曲霉于PDA液體培養(yǎng)基中，液體搖瓶培養(yǎng)。 培養(yǎng)基配制、實(shí)消發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉200

6、 g，檸檬酸氫二銨100 g，KH2PO4 15 g，CaCl2 0.5 g，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.05 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，加水定容至5 L，pH5.0，消泡劑（植物油）5 mL。關(guān)閉氣路入罐閥，主汽路進(jìn)汽補(bǔ)料口進(jìn)汽（方法同空消）罐壓升至0.12Mpa（121），保壓、保溫30分鐘實(shí)消結(jié)束。 冷卻接種與發(fā)酵待培養(yǎng)基冷卻至28左右時(shí)，在加料口周?chē)乓蝗凭耷颍c(diǎn)燃，在無(wú)菌條件下打開(kāi)進(jìn)料口，迅速接種。將溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等參數(shù)設(shè)定好后，進(jìn)行發(fā)酵。參數(shù)監(jiān)測(cè)每隔6 h取一次樣，檢測(cè)其pH、生物量、酶活及殘?zhí)呛康戎笜?biāo)。. pH的測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)pH計(jì)后，測(cè)定樣品pH值。.

7、 生物量的測(cè)定：每次取20-30mL的發(fā)酵液，先用大離心機(jī)(5000 rpm, 3-5 min)離心，收集上清液用來(lái)測(cè)酶活，沉淀用水清洗幾次后再離心，然后將所得沉淀放入100烘箱中，烘干（2 h左右），然后測(cè)其干重，取平均值。. 酶活：試劑：（1）碘液：稱取0.5g I2 和5.0gKI 研磨溶解于少量蒸餾水，定容至100ml，于褐色試劑瓶?jī)?nèi)保存，避免陽(yáng)光直射。（2）稀碘液：取原碘液1ml稀釋100倍。此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用（3）0.5%淀粉液：稱取干燥過(guò)的可溶性淀粉0.5克，加5ml緩沖液，攪拌混和，再徐徐傾入70毫升煮沸的緩沖液中。繼續(xù)煮沸2分鐘，冷卻至室溫，定容至100mL。此溶液需要當(dāng)天配制(

8、4) 磷酸緩沖液（pH 6.0）：0.2 mol/L K2HPO4 (12.3mL)+0.2 mol/L KH2PO4(87.7mL)方法：取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40水浴中預(yù)熱10 min，然后加入適當(dāng)稀釋(6.0的磷酸鹽稀釋緩沖液)的酶液0.5ml，反應(yīng)5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4 終止反應(yīng)。取0.5 ml 反應(yīng)液與5 ml 碘液顯色，在620 nm處測(cè)光密度。以0.5 ml水代替0.5 ml反應(yīng)液為空白，以不加酶液（加同樣體積的緩沖液）的管為對(duì)照（即取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40水浴中預(yù)熱10 min，然后加入6.0的磷酸鹽稀釋緩沖液0

9、.5ml，反應(yīng)5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4 終止反應(yīng)。取0.5 ml 反應(yīng)液與5 ml 碘液顯色）。酶活力根據(jù)下式計(jì)算：酶活力（u/ml）(R0-R)/R050D，式中R0，R分別表示對(duì)照和反應(yīng)液的光密度，D為酶的稀釋倍數(shù)。調(diào)整D使(R0-R)/R0在0.2-0.7之間。確定在40、5 min 內(nèi)水解1 mg淀粉的酶量為一個(gè)活力單位。. 殘?zhí)橇康臏y(cè)定：硫酸-蒽酮法測(cè)殘?zhí)呛浚?）原理糖類(lèi)與濃硫酸脫水生成糖醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生顏色物質(zhì)，反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色，于620 nm處有最大吸收，顯色與多糖含量有線性關(guān)系。（2）試劑蒽酮試劑。溶解0.2 g蒽酮于濃硫酸（A.

10、 R. 95.5 %）100 ml中，當(dāng)日配制試用。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)視樣品分?jǐn)?shù)多少來(lái)準(zhǔn)備蒽酮試劑的配置量。比如實(shí)測(cè)樣品有50份，為了保證結(jié)果的可靠性，安排個(gè)份樣品試驗(yàn)重復(fù)數(shù)為3。因?yàn)槊總€(gè)試驗(yàn)點(diǎn)實(shí)測(cè)需要4 ml蒽酮試劑，所以至少應(yīng)配置的體積為4350600 ml。此時(shí)還應(yīng)考慮預(yù)實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)差錯(cuò)所消耗蒽酮試劑量。標(biāo)準(zhǔn)糖試劑。葡萄糖溶液（可加數(shù)滴甲苯防腐）（3）操作及其注意事項(xiàng)分別取0.1 g/l的葡萄糖溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80 ml，用蒸餾水補(bǔ)到1.00 ml，分別加入4.00 ml蒽酮試劑，迅速進(jìn)入冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加蓋

11、玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸開(kāi)始計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確煮沸10 min，冷卻后進(jìn)行比色。以光密度為縱坐標(biāo)，糖的含量微克數(shù)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。或使用計(jì)算器進(jìn)行一元回歸得出計(jì)算式，以便于計(jì)算使用。（4）樣品含量測(cè)定取糖濃度為50g/ml左右的樣品溶液1.00ml，一式3份分別置于不同試管中，對(duì)照加入1.0ml蒸餾水，然后給各管加入蒽酮試劑，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行比色定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計(jì)算含量。色氨酸含量較高的蛋白質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)有一定的干擾。此外，試管在加入蒽酮試劑過(guò)程中，移液管尖端在試管中所停留的高度對(duì)于加入蒽酮試劑的速度影響較大，而且對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生顏色的深淺都會(huì)產(chǎn)生一定的影響。因此，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)該注意。

12、數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)報(bào)告（前言、材料、結(jié)果、討論等）罐體清洗四:結(jié)果及分析酶活變化：時(shí)間（h）0612182430364248546066酶活03484567681150123513512886743696281116612980殘?zhí)呛孔兓簳r(shí)間（h）0612182430364248546066殘?zhí)呛?.141.9011.5281.151.4122.2010.6481.3751.9461.4391.2310.802Ph值；時(shí)間（h）0612182430364248546066pH值 5.085.094.724.994.684.684.54.274.234.174.043.96生物量（g）時(shí)間（h

13、）0612182430364248546066生物量(g)00.0260.0410.1880.03580.05090.07650.06980.07020.12870.06070.1161實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：1、a-淀粉酶的活力總體上是呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵初期，由于菌種的代謝慢，總量少，所以0-36h內(nèi)酶活測(cè)定數(shù)值比較小，上升幅度也較小，此后，由于菌種達(dá)到對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期黑曲霉的產(chǎn)酶能力加強(qiáng)，酶活不斷升高，且上升幅度也大大提高，；從總體上看酶活值的變化是越來(lái)越大,在開(kāi)始的一段時(shí)間內(nèi)酶活值的變化幅度不大,這是因?yàn)閯傞_(kāi)始黑曲霉接種到發(fā)酵罐里,有一段時(shí)間的延滯期,盡管時(shí)間不長(zhǎng);而且剛開(kāi)始黑曲霉的數(shù)量相對(duì)于發(fā)酵罐

14、中的培養(yǎng)基的量而言畢竟是少的，因此導(dǎo)致曲線開(kāi)始階段變化較緩慢，以后的時(shí)間里黑曲霉大量增殖，數(shù)量增加以后產(chǎn)生的酶量便不斷增加。 2、殘?zhí)堑淖兓碚撋蠎?yīng)該是越來(lái)越小，但是實(shí)驗(yàn)中殘?zhí)堑牟▌?dòng)比較大，歸結(jié)原因可能如下： 試驗(yàn)中所使用的蒽酮和淀粉溶液雖是現(xiàn)配現(xiàn)用，但是由于操作不是很嫻熟，淀粉溶液時(shí)間稍長(zhǎng)就會(huì)出現(xiàn)沉淀，這是結(jié)果波動(dòng)性變化大的最主要的原因； 操作不規(guī)范，稀釋倍數(shù)不合理，也可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)波動(dòng)性較大3、pH值大體上是呈下降趨勢(shì)，但變動(dòng)的幅度不大，這可能是接入的的黑曲霉量較少，以致黑曲霉在發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的CO2及酸性物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)基的影響較小。0-12h變化幅度不大，基本上維持在5.1左右，此時(shí)是由于黑曲霉在發(fā)酵罐中的延遲效應(yīng)，菌種代謝不旺盛，故pH的變化不大，隨后隨著菌種的活化，菌種新陳代謝的旺盛，CO2的釋放以及糖濃度的降低使得發(fā)酵液的pH值逐漸下降，發(fā)酵后期，菌種的活力下降，溶液的各理化性質(zhì)趨于穩(wěn)定pH保持在4.5左右。4、生物量變化 理論上其變化是隨著時(shí)間的推移而逐漸增加的，但由于取樣后實(shí)驗(yàn)操作的失誤導(dǎo)致結(jié)果的波動(dòng)性很大。 實(shí)驗(yàn)感受：通過(guò)本次試驗(yàn)我們直觀地觀察了微生物發(fā)酵的過(guò)程