浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定課件

1、浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的SDSSDSPAGEPAGE檢測分析及蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定檢測分析及蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定實驗五實驗五浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定一、實驗目的和要求一、實驗目的和要求1 1、學習、學習SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)PAGE)的基本原理和操作方法的基本原理和操作方法2 2、蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的SDSSDSPAGEPAGE檢測分析檢測分析3 3、學習測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、學習測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量(Mr)(Mr)的方法的方法

2、浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定二、實驗基本原理二、實驗基本原理1 1、電泳、電泳 是帶電顆粒在電場作用下，作定向運動即向著與其電荷相反的電極移是帶電顆粒在電場作用下，作定向運動即向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。動的現(xiàn)象。2 2、電泳法分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的、電泳法分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小分子大小和和形狀形狀以及以及所帶凈電荷多少所帶凈電荷多少等因素所產(chǎn)生的電泳遷移率的差別。等因素所產(chǎn)生的電泳遷移率的差別。 3 3、區(qū)帶電泳：是樣品物質(zhì)在一惰性支持物上進行電泳、區(qū)帶電泳：是樣品物質(zhì)在一惰性支持物上進行電泳,

3、,因電泳后，樣品不同組因電泳后，樣品不同組分形成帶狀區(qū)間，故稱區(qū)帶電泳。分形成帶狀區(qū)間，故稱區(qū)帶電泳。4 4、聚丙烯酰胺凝膠（、聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel,polyacrylamide gel,簡稱簡稱PAG) PAG) 是由丙烯酰胺（是由丙烯酰胺（Acr)Acr)和交和交聯(lián)試劑聯(lián)試劑N,NN,N- -甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(Bis)(Bis)在有引發(fā)劑（如過硫酸銨或核黃素）和增速在有引發(fā)劑（如過硫酸銨或核黃素）和增速劑（如劑（如N,N,N,NN,N,N,N- -四甲基乙二胺，四甲基乙二胺，TEMEDTEMED）的情況下聚合而成的。）的情況下聚合而成的。 丙烯酰

4、胺丙烯酰胺N,NN,N- -甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定 聚丙烯酰胺凝膠三維結(jié)構(gòu)聚丙烯酰胺凝膠三維結(jié)構(gòu)浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定 5 5、聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(PAGE) 是在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中來分離蛋白質(zhì)，這主要是是在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中來分離蛋白質(zhì)，這主要是由蛋白質(zhì)樣品由蛋白質(zhì)樣品所帶的所帶的電荷和分子質(zhì)量電荷和分子質(zhì)量的差異性進行分離；在電泳過程中的差異性進行分離；在電泳過程中仍保持仍保持蛋白質(zhì)的天然蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、亞基之間的相互作用及其生物活性。構(gòu)象、亞基之間

5、的相互作用及其生物活性。 6 6、聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為：、聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為： 連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng) 凝膠緩沖液的凝膠緩沖液的pHpH值及凝膠濃度不變。該電泳系統(tǒng)具有值及凝膠濃度不變。該電泳系統(tǒng)具有電荷效應電荷效應、分子篩效應分子篩效應； 不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng) 凝膠緩沖離子成分、凝膠緩沖離子成分、pHpH值、凝膠濃度、電位梯度不連續(xù)，由值、凝膠濃度、電位梯度不連續(xù)，由濃縮膠和分離膠組成。由于濃縮膠的堆積（濃縮）作用，可使樣品（即使是稀濃縮膠和分離膠組成。由于濃縮膠的堆積（濃縮）作用，可使樣品（即使是稀釋樣品）在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度（或一釋樣品）在濃縮膠和分

6、離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度（或一定濃度梯度）的凝膠上進行分離。該電泳系統(tǒng)具有定濃度梯度）的凝膠上進行分離。該電泳系統(tǒng)具有濃縮效應、電荷效應、分子濃縮效應、電荷效應、分子篩效應篩效應。 浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定7 7、SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) (SDS-PAGE) 以以PAGPAG為支持物的電泳，由于各種蛋白質(zhì)所帶靜電荷、分子量大小和形狀為支持物的電泳，由于各種蛋白質(zhì)所帶靜電荷、分子量大小和形狀不同而有不同的遷移率。為消除靜電荷對遷移率的影響，在整個電泳體系中不同而有不同的遷移率。為消除靜電荷對遷移率的影響

7、，在整個電泳體系中加入一定量的加入一定量的陰離子去污劑陰離子去污劑“十二烷基硫酸鈉（簡稱十二烷基硫酸鈉（簡稱SDSSDS）”和和“強還原劑強還原劑（巰基乙醇）（巰基乙醇）”后，后，蛋白質(zhì)樣品就會與蛋白質(zhì)樣品就會與SDSSDS結(jié)合形成帶結(jié)合形成帶負電荷負電荷復合物復合物，而，而SDSSDS作為一種作為一種變性劑變性劑和助溶劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的非共價鍵，并和助溶劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的非共價鍵，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二級和三級結(jié)構(gòu)，結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二級和三級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性而改變原有的空間構(gòu)象。另外，使蛋

8、白質(zhì)變性而改變原有的空間構(gòu)象。另外，SDSSDS蛋白質(zhì)復合物在蛋白質(zhì)復合物在強還原劑強還原劑（巰基乙醇）（巰基乙醇）存在下，可打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)或肽鏈間的二硫鍵，并能避免重存在下，可打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)或肽鏈間的二硫鍵，并能避免重新氧化，這樣分離出的譜帶即為新氧化，這樣分離出的譜帶即為蛋白質(zhì)亞基蛋白質(zhì)亞基。蛋白質(zhì)亞基的電泳的遷移率主。蛋白質(zhì)亞基的電泳的遷移率主要取決于亞基的相對分子質(zhì)量大小，而電荷的因素可以忽略。要取決于亞基的相對分子質(zhì)量大小，而電荷的因素可以忽略。 浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定8 8、蛋白質(zhì)亞基相對分子質(zhì)量的測方法、蛋白質(zhì)亞基相對分子質(zhì)量的測方法 在聚丙烯

9、酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的SDSSDS時，時，蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)SDSSDS復合物復合物在在水溶液中的形狀，水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長橢圓棒近似于雪茄煙形的長橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的。不同蛋白質(zhì)的SDSSDS復合物的短復合物的短軸長度都一樣，約為軸長度都一樣，約為1.8nm1.8nm，而長軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比變化。這樣的，而長軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比變化。這樣的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS-SDS復合物在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，復合物在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只主要取決于它的橢圓棒的長度即蛋白質(zhì)的相對分子

10、質(zhì)量的大小，而其他而只主要取決于它的橢圓棒的長度即蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的大小，而其他因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計。由于蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量不因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計。由于蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同，所形成復合物的相對分子質(zhì)量不同，在電泳中反映出不同的遷移率。當同，所形成復合物的相對分子質(zhì)量不同，在電泳中反映出不同的遷移率。當?shù)鞍踪|(zhì)或亞基的相對分子質(zhì)量在蛋白質(zhì)或亞基的相對分子質(zhì)量在15,00015,000200,000200,000之間時，電泳遷移率與相對之間時，電泳遷移率與相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈直線關系，符合下列方程式：分子質(zhì)量的對數(shù)呈直線關系，符合下列方程式： lgMr=

11、KlgMr=KbRfbRf式中式中MrMr代表相對分子質(zhì)量，代表相對分子質(zhì)量，K K代表常數(shù)，代表常數(shù)，b b代表斜率，代表斜率，RfRf代表遷移率。代表遷移率。 若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量的對數(shù)作圖，可獲得一若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量的對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可條標準曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。在標準曲線上求得蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定三、實驗材料和試劑三、實驗材料和試劑1 1、實驗材料：

12、、實驗材料： 蔗糖酶樣品（樣品蔗糖酶樣品（樣品、） 2 2、實驗試劑：、實驗試劑：(1) 30.8%(1) 30.8%凝膠貯液：丙烯酰胺凝膠貯液：丙烯酰胺(Acr) 30g(Acr) 30g，甲叉雙丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.8g(Bis)0.8g，加水，加水溶解，并加水定容到溶解，并加水定容到100ml100ml，過濾。貯于棕色瓶，可在，過濾。貯于棕色瓶，可在44保存一個月。丙烯保存一個月。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體及溶液是中樞神經(jīng)毒物，要小心操作。酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體及溶液是中樞神經(jīng)毒物，要小心操作。(2) (2) 分離膠緩沖液：分離膠緩沖液：3mol/L Tris-HCl

13、 pH8.93mol/L Tris-HCl pH8.9(3) (3) 濃縮膠緩沖液：濃縮膠緩沖液：0.5mol/L Tris-HCl pH6.70.5mol/L Tris-HCl pH6.7(4) 10% SDS(4) 10% SDS(5) TEMED(N,N,N(5) TEMED(N,N,N,N,N四甲基乙二胺）四甲基乙二胺） ( (增速劑）增速劑）(6) 10%(6) 10%過硫酸銨（引發(fā)劑）過硫酸銨（引發(fā)劑）(7) (7) 電泳緩沖液（電泳緩沖液（pH8.3pH8.3）：）： Tris 6gTris 6g，甘氨酸甘氨酸 28.8g28.8g，SDS 2gSDS 2g，用蒸餾水溶，用蒸餾水

14、溶解并定至解并定至1000ml,1000ml,使用時稀釋使用時稀釋1 1倍。倍。浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定(8) (8) 蛋白質(zhì)樣品溶解液（蛋白質(zhì)樣品溶解液（2 2蛋白質(zhì)樣品溶解液）：蛋白質(zhì)樣品溶解液）： 內(nèi)含內(nèi)含1%SDS1%SDS，1%1%巰基乙醇，巰基乙醇，40%40%蔗糖或蔗糖或20%20%甘油，甘油，0.02%0.02%溴酚藍，溴酚藍，0.01mol/L 0.01mol/L Tris-HCl pH8.0 Tris-HCl pH8.0緩沖液。緩沖液。(9)(9)染色液：染色液： 0.25g0.25g考馬斯亮藍考馬斯亮藍R-250R-250，加，加90.8ml

15、 50%90.8ml 50%甲醇，加甲醇，加9.2ml9.2ml乙酸，溶解混勻后使乙酸，溶解混勻后使用。用。(10)(10)脫色液：脫色液：75ml75ml乙酸，乙酸，50ml50ml甲醇，加蒸餾水甲醇，加蒸餾水875ml875ml，混勻使用。，混勻使用。(11)(11)蛋白質(zhì)分子量標準溶液：蛋白質(zhì)分子量標準溶液： - -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（MW 116,000MW 116,000），）， 牛血清白蛋白牛血清白蛋白(MW66,200)(MW66,200)， 卵清蛋白（卵清蛋白（MW 45,000MW 45,000），）， 乳酸脫氫酶（乳酸脫氫酶（MW 35,000MW 35,000），），

16、 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶Bsp981Bsp981（MW 25MW 25，000000），）， -乳球蛋白（乳球蛋白（MW 18,400MW 18,400）, , 雞蛋清溶菌酶（雞蛋清溶菌酶（MW14,400MW14,400）。）。浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定四、實驗器材四、實驗器材1 1、電泳儀、垂直電泳槽及配件（長短玻璃板各、電泳儀、垂直電泳槽及配件（長短玻璃板各1 1塊、封膠條塊、封膠條2 2條、梳子條、梳子1 1個）個） ；2 2、微量移液器：、微量移液器：10102020200200100010003 3、燒杯、長滴管；、燒杯、長滴管；4 4、微量注射器、微

17、量注射器5050；5 5、恒溫水浴、恒溫水浴100100；6 6、高速臺式離心機；、高速臺式離心機；7 7、離心管（、離心管（1.5ml1.5ml、0.5ml0.5ml）及離心管架；）及離心管架；8 8、15cm15cm培養(yǎng)皿（染色、脫色用）；培養(yǎng)皿（染色、脫色用）；9 9、搖床（染色、脫色用）、搖床（染色、脫色用） 。浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定五、操作步驟五、操作步驟1 1、準備電泳裝置：電泳槽、電泳儀。、準備電泳裝置：電泳槽、電泳儀。2 2、配膠及凝膠的制備、配膠及凝膠的制備（1 1）配制凝膠：）配制凝膠： 不連續(xù)體系不連續(xù)體系SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠配制聚丙

18、烯酰胺凝膠配制注：注：1 1、為去除抑制膠聚合的氧，加入為去除抑制膠聚合的氧，加入APAP前可進行抽氣處理；前可進行抽氣處理；2 2、過硫酸銨和過硫酸銨和TEMEDTEMED的量應根據(jù)室溫或聚合情況而定；的量應根據(jù)室溫或聚合情況而定；12%分離膠所需試劑量(ml)5%濃縮膠所需試劑量(ml)30.8%凝膠貯液3 30.850.853mol/LTris-HCL pH8.9分離膠緩沖液0.950.950.5mol/L Tris-HCL pH6.7濃縮膠緩沖液0.630.6310% SDS0.0750.0750.050.05TEMED0.0050.0050.0050.005蒸餾水3.423.423.

19、453.4510% Ap0.050.050.0250.025總體積總體積(ml)(ml)7.57.55 5浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定、凝膠板的制備、凝膠板的制備 分離膠的制備：分離膠的制備： 按上表配制按上表配制7.5ml7.5ml分離膠，混合均勻后用細長頭滴管將凝膠液加至長、短分離膠，混合均勻后用細長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，再用少許蒸餾水（或水飽和的異丙醇或正丁醇）沿長玻玻璃板間的縫隙內(nèi)，再用少許蒸餾水（或水飽和的異丙醇或正丁醇）沿長玻璃板板壁緩慢注入，約璃板板壁緩慢注入，約5mm5mm高，以封住膠面，以促使聚合并使膠面平直，約高，以封住膠面，以

20、促使聚合并使膠面平直，約30min30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合，傾后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合，傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余的水分。去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余的水分。 濃縮膠的制備：濃縮膠的制備： 按上表配制按上表配制5ml5ml濃縮膠，混勻后用細長頭滴管將濃縮液加到已聚合的分離濃縮膠，混勻后用細長頭滴管將濃縮液加到已聚合的分離膠上方，直至離短玻璃板上得約膠上方，直至離短玻璃板上得約0.5cm0.5cm處，輕輕將樣品槽模板（梳子）插入濃處，輕輕將樣品槽模板（梳子）插入濃縮膠內(nèi)，約縮膠內(nèi)，約30min30m

21、in后凝膠聚合，再放置后凝膠聚合，再放置202030min30min，使凝膠，使凝膠“老化老化”。小心拔。小心拔去樣品槽的槽板（梳子），用濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將電泳緩沖去樣品槽的槽板（梳子），用濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將電泳緩沖液倒入上、下貯槽中，電泳緩沖液應沒過短板約液倒入上、下貯槽中，電泳緩沖液應沒過短板約0.5cm0.5cm以上，即可準備加樣。以上，即可準備加樣。浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定3 3、樣品處理與加樣、樣品處理與加樣樣品制備樣品制備 取蔗糖酶樣品（樣品取蔗糖酶樣品（樣品、）各）各50ul50ul（樣品濃度約（樣品濃度約2 25mg/m

22、l)5mg/ml) ，分別放入分別放入1.5ml1.5ml離心管中，離心管中，10000r/min10000r/min離心離心3min,3min,收集上清為樣品溶液。收集上清為樣品溶液。樣品處理樣品處理 將樣品溶液分別按等體積加入將樣品溶液分別按等體積加入“2 2蛋白質(zhì)樣品溶解液蛋白質(zhì)樣品溶解液”，100100保溫保溫3 3分分鐘，取出冷卻后，鐘，取出冷卻后，10000r/min10000r/min離心離心1min,1min,取上清取上清直接加樣。直接加樣。加樣加樣 用微量注射器向樣品槽內(nèi)注入用微量注射器向樣品槽內(nèi)注入101020l20l樣品混合液樣品混合液( (每孔蛋白質(zhì)上樣量在每孔蛋白質(zhì)上

23、樣量在202040g40g） 。如樣品濃度較低，可適當增加上樣量。如樣品濃度較低，可適當增加上樣量。 蛋白質(zhì)分子量標準溶液加蛋白質(zhì)分子量標準溶液加10l/10l/孔。孔。 浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定4 4、電泳、電泳 在電泳槽中加入電泳緩沖液，上槽（加樣孔端）接負極、下槽接正極，接在電泳槽中加入電泳緩沖液，上槽（加樣孔端）接負極、下槽接正極，接電泳儀電源，電流控制在電泳儀電源，電流控制在2 23mA/3mA/樣品孔，一般樣品進濃縮膠前，電流控制在樣品孔，一般樣品進濃縮膠前，電流控制在101020mA20mA，待樣品進分離膠后，將電流調(diào)到，待樣品進分離膠后，將電流調(diào)到

24、202030mA30mA，保持電流強度不變（恒，保持電流強度不變（恒流），待指示染料遷移至下沿約流），待指示染料遷移至下沿約0.50.51cm1cm處停止電泳。處停止電泳。5 5、剝膠、固定和染色、剝膠、固定和染色 電泳結(jié)束后，取下凝膠模，用專用鏟子撬開短玻璃板，將凝膠一角切下做電泳結(jié)束后，取下凝膠模，用專用鏟子撬開短玻璃板，將凝膠一角切下做一加樣標記，將凝膠板放在一加樣標記，將凝膠板放在15cm15cm培養(yǎng)皿內(nèi)，加入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，固定、染色染色液，固定、染色30min30min左右，左右，6 6、脫色、脫色 棄去染色液，加入蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清棄去染色液，加入蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止。晰為止。浙江大學生物化學甲實驗實驗9氨基移換反應及其產(chǎn)物的鑒定六、實驗結(jié)果六、實驗結(jié)果1 1、計算蛋白質(zhì)樣品相對分子質(zhì)量、計算蛋白質(zhì)樣品相對分子質(zhì)量 將將15cm15cm培養(yǎng)皿放在一張坐標紙上，量出加樣端距溴酚藍區(qū)帶中心間的培養(yǎng)皿放在一張坐標紙上，量出加樣端距溴酚藍區(qū)帶中心間的距離（距離（cmcm）以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端）以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端( (凝膠頂端凝膠頂端) )的距離（的距離（cmcm），），按下式計算相對遷移率按下式計算相對遷移率RfRf 蛋白樣品距加樣端距離蛋白樣品距加樣端距