細菌的耐藥性的產(chǎn)生及檢測方法

1、細菌的耐藥性的產(chǎn)生及檢測方法 安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胡立芬主要內(nèi)容細菌與人類關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細菌耐藥產(chǎn)生細菌耐藥的檢測細菌定義 廣義定義：是指一大類細胞核無核膜包裹，只存在裸露DNA的原始單細胞生物，包括真細菌和古生菌兩大類群。細菌數(shù)量：所有生物中數(shù)量最多的一類。細菌廣泛存在我們?nèi)祟愺w內(nèi)，人體內(nèi)及表皮上的細菌總數(shù)約是人體細胞總數(shù)的十倍。細菌與人類關(guān)系細菌與人類關(guān)系多次引起世界傳染病大流行17世紀中期開始認識細菌人類受益于細菌細菌結(jié)構(gòu)細菌結(jié)構(gòu)細菌致病性細菌致病性細菌在人體內(nèi)寄生，增殖并引起疾病的特性稱為細菌的致病性侵襲力胞外酶血漿凝固酶游離血漿凝固酶凝聚因子鏈激酶: 激活纖溶酶原或胞漿素原,破

2、壞纖維蛋白屏障透明質(zhì)酸酶：溶解結(jié)締組織透明質(zhì)酸莢膜: 抵抗吞噬其他表面活性物質(zhì): Vi抗原、 K抗原等毒素外毒素主要由革蘭氏陽性菌產(chǎn)生親組織性，選擇性地作用于某些組織和器官。破傷風桿菌毒素麻痹運動神經(jīng)肉毒桿菌毒素造成眼及咽肌的麻痹白喉桿菌引起心肌炎、腎上腺出血及神經(jīng)麻痹等。內(nèi)毒素主要由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生無組織選擇性，引起的病理變化和臨床癥狀大致相同發(fā)熱反應(yīng)糖代謝紊亂影響血管舒縮機能彌漫性血管內(nèi)凝血細菌侵入途徑、數(shù)量與感染多數(shù)病原菌只有經(jīng)過特定的門戶侵入，并在特定部位定居繁殖，才能造成感染。 痢疾桿菌必須經(jīng)口侵入，定居于結(jié)腸內(nèi)，才能引起疾病。破傷風桿菌，只有經(jīng)傷口侵入，厭氧條件下，引發(fā)疾病。 病原

3、菌的數(shù)量與致病能力一般成正比。主要內(nèi)容細菌與人類關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細菌耐藥產(chǎn)生細菌耐藥的檢測抗菌藥物產(chǎn)生抗菌藥物的定義 抗菌藥物包括：抗生素由微生物（如細菌、真菌、放線菌）、植物和動物在其生命活動過程中所產(chǎn)生人工半合成、全合成的化學藥物抗菌活性根據(jù)不同特性分為：抑菌劑：速效抑菌劑（四環(huán)素類、林可霉素類、氯霉素與大環(huán)內(nèi)酯類）和慢效抑菌劑（磺胺類）殺菌劑：繁殖期殺菌劑（青霉菌素類及頭孢菌素類）和靜止期殺菌劑（喹諾酮類、氨基糖苷類、多粘菌素類）活性評價指標最低抑菌濃度（MIC）指能夠抑制培養(yǎng)基內(nèi)細菌生長的最低濃度最低殺菌濃度(MBC）指能夠殺滅培養(yǎng)基內(nèi)細菌生長的最低濃度抗菌藥物分類(1)-內(nèi)酰胺類：青

4、霉素類和頭孢菌素類的分子結(jié)構(gòu)中含有- 內(nèi)酰胺環(huán)。(2) 氨基糖苷類：包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉 素、丁胺卡那霉素、新霉素等。(3) 四環(huán)素類：包括四環(huán)素、土霉素、金霉素及強力霉素等。(4) 氯霉素類：包括氯霉素、甲砜霉素等。(5) 大環(huán)內(nèi)脂類：紅霉素、白霉素、乙酰螺旋霉素、麥迪霉素、 阿奇霉素等。(6) 糖肽類抗生素：萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧。(7) 喹諾酮類：諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙 星、加替沙星等。抗菌藥物分類(8)硝基咪唑類：包括甲硝唑、替硝唑、奧硝唑等。(9)作用于G-菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、環(huán)絲氨 酸、利福平等。(10)作用于G+細菌的其它

5、抗生素：林可霉素、氯林可霉素、 桿菌肽等.(11)抗真菌抗生素：多烯類、咪唑類、三唑類 用于真菌細胞膜上麥角甾醇的抗真菌藥物、烯丙胺類、 氮唑類。(12)抗結(jié)核菌類：利福平、異煙肼、吡嗪酰胺等。(13)具有免疫抑制作用的抗生素如環(huán)孢霉素。 抗菌藥物作用機理 針對細菌結(jié)構(gòu)，抗菌藥主要有5類作用機理： 阻礙細菌細胞壁的合成，導致細菌在低滲透壓環(huán)境下膨脹破裂死亡，哺乳動物的細胞沒有細胞壁，不受這類藥物的影響。 抗菌藥物作用機理 與細菌細胞膜相互作用，增強細菌細胞膜的通透性、打開膜上的離子通道，讓細菌內(nèi)部的有用物質(zhì)漏出或電解質(zhì)平衡失調(diào)而死亡 阻礙細菌DNA的復制和轉(zhuǎn)錄，導致細菌分裂繁殖受阻。 影響葉酸

6、代謝 抑制細菌葉酸代謝過程中的二氫葉酸合成酶和二氫葉酸還原酶。導致核酸合成受阻，從而抑制細菌生長繁殖。 與細菌核糖體或其反應(yīng)底物相互作用，抑制蛋白質(zhì)的合成抗菌藥物作用機理主要內(nèi)容細菌與人類關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細菌耐藥性產(chǎn)生細菌耐藥的檢測細菌耐藥性產(chǎn)生 青霉素的廣泛使用后耐藥性很快產(chǎn)生(-內(nèi)酰胺環(huán)被破壞后，青霉素的抗菌活性也隨之而消失)，隨后由于抗菌藥物大量使用的壓力，針對各種抗菌藥物的耐藥性逐漸產(chǎn)生。細菌耐藥性又稱抗藥性，系指細菌對于抗菌藥物作用的耐受性，耐藥性一旦產(chǎn)生，藥物的化療作用就明顯下降。耐藥性根據(jù)其發(fā)生原因可分為獲得耐藥性和天然耐藥性。自然界中的病原體，如細菌的某一株也可存在天然耐藥性。

7、當長期應(yīng)用抗生素時，占多數(shù)的敏感菌株不斷被殺滅，耐藥菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使細菌對該種藥物的耐藥率不斷升高。細菌耐藥性20 世紀30 年代末磺胺藥上市， 40 年代臨床廣泛使用磺胺藥后，50 年代日本報道80%90%的志賀痢疾桿菌對磺胺藥耐藥了。 20世紀40年代青霉素剛使用不久即出現(xiàn)耐青霉素金葡菌，50年代發(fā)現(xiàn)金葡菌能產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶滅活青霉素，1961年,甲氧西林問世并投入臨床應(yīng)用(抗金葡菌產(chǎn)生的青霉酶)，從甲氧西林使用10余年后，出現(xiàn)耐甲氧西林金葡菌(MRSA) 報道。細菌耐藥性 6070 年代，細菌耐藥性主要表現(xiàn)為金黃色葡萄球菌和一般腸道陰性桿菌由于能產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶使青霉素類和

8、一代頭孢菌素抗菌作用下降。 80 年代后，G-桿菌產(chǎn)生的超廣譜-內(nèi)酰胺酶和AmpC酶，三代頭孢菌素在內(nèi)的多種抗生素耐藥的多重耐藥革蘭陰性桿菌出現(xiàn)。 近年來，出現(xiàn)了萬古霉素中介金葡菌，2002年以來,美國已先后報道了3株對萬古霉素完全耐藥的金葡菌。1990年就有耐亞胺培南的一株陰溝腸桿菌報道，但在隨后10年期間并未有更多耐碳青霉烯類抗生素腸桿菌報道，直到2000年后有關(guān) CRE的報道不斷增多，一種新抗生素從研制到臨床應(yīng)用一般需要510年，而產(chǎn)生細菌耐藥僅需要2 年。細菌多重耐藥多重耐藥：指細菌對常用抗菌藥物主要分類的3類或以上藥物耐藥。泛耐藥細菌：指對所有分類的常用抗菌藥物全部耐藥，革蘭氏陰性桿

9、菌對包括多黏菌素和替加環(huán)素在內(nèi)的全部抗菌藥物耐藥，革蘭氏陽性球菌對包括糖肽類和利奈唑胺在內(nèi)的全部抗菌藥物耐藥。超級細菌超級細菌 超級細菌超級細菌, 目前引起特別關(guān)注的超級細菌主要有：耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬古霉素腸球菌（VRE）、耐多藥肺炎鏈球菌（MDRSP）、多重耐藥性結(jié)核桿菌（MDR-TB）、最近新發(fā)現(xiàn)的攜帶有NDM-1基因的大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌以及多重耐藥鮑曼不動桿菌（MRAB）等。超級細菌并非新事物，它們一直存在并且隨著人類濫用抗生素而進化出強大耐藥性。 “超級細菌”的出現(xiàn)，一度引起了世界的恐慌。在青霉素被發(fā)現(xiàn)后的半個世紀，人類走了一圈又回到了原地，來到了多年前

10、有人預測的“后抗生素時代”。我國是世界上濫用抗生素較為嚴重的國家,耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù),已占到住院感染患者總?cè)藬?shù)的30 %左右。因此有專家預言,我國有可能率先進入“后抗生素時代”，即回到抗生素發(fā)現(xiàn)之前的時代。細菌多重耐藥 為此2011 年世界衛(wèi)生組織（WHO）提出了“遏制細菌耐藥，今天不采取行動，明天就無藥可用”的口號，細菌耐藥已成為一個極其重要的公共衛(wèi)生安全問題。細菌耐藥基礎(chǔ) 固有耐藥性：是由細菌染色體基因決定、代代相傳，不會改變的，如鏈球菌對氨基糖苷類抗生素天然耐藥；腸道G-桿菌對青霉素天然耐藥；銅綠假單胞菌及嗜麥芽窄食單胞菌對多數(shù)抗生素均不敏感。 獲得性耐藥性：細菌與抗生素接觸后，在

11、抗菌藥物選擇性壓力存在下經(jīng)過基因突變、潛伏基因的表達,或細菌在生長過程中通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導獲得抗性基因,或通過移動因子包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子轉(zhuǎn)移和傳播耐藥基因而獲得的耐藥表型,通過改變自身的代謝途徑，使其不被抗生素殺滅。如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生過多-內(nèi)酰胺酶或過度表達mecA基因而耐藥。細菌的獲得性耐藥可因不再接觸抗生素而消失，也可由質(zhì)粒將耐藥基因轉(zhuǎn)移個染色體而代代相傳，成為固有耐藥。獲得性耐藥性 獲得性耐藥機制更容易將耐藥基因通過水平或垂直傳播方式在不同菌株或不同菌種間傳播，加速了細菌耐藥蔓延的速度，導致耐藥菌株越來越多，細菌耐藥性迅速上升，使臨床上不斷出現(xiàn)多重耐藥株、泛耐藥株甚至“超級細菌”的出

12、現(xiàn)。在上世紀5060年代，全世界每年死于感染性疾病的人數(shù)約700萬，而現(xiàn)在這個數(shù)字上升到了2 000萬。死于敗血癥的人數(shù)上升了89%，大部分人死于超級細菌帶來的用藥困難。細菌耐藥機制細菌耐藥機制 -內(nèi)酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)及其N-?；苌锓肿又?內(nèi)酰胺環(huán)酰胺鍵的滅活酶。細菌通過產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶降解是-內(nèi)酰胺類抗生素是最常見的耐藥方式(80%病原菌耐藥方式之一,至今-內(nèi)酰胺酶數(shù)量已超過350余種) Ambler等根據(jù)-內(nèi)酰胺酶分子結(jié)構(gòu)中氨基酸序列差異分為A，B，C,D。1995年Bush等提出功能分類方案，依據(jù)酶的底物和酶的抑制物不同，

13、主要分為青霉素酶,頭孢菌素酶，廣譜酶和超廣譜酶四種A型-內(nèi)酰胺酶 A型-內(nèi)酰胺酶按Bush分類法屬2群，向下又分為8個亞群(2a,2b,2c,2d,2e,2f,2be,2br)，因此，A型-內(nèi)酰胺酶在底物動力學性質(zhì)上顯示多樣性。大多數(shù)青霉素類抗生素都是A型-內(nèi)酰胺酶的良好底物，如氨芐西林、羧芐西林、苯唑西林和甲氧西林等。從整體上看，A型-內(nèi)酰胺酶對青霉素類的水解率較頭孢菌素類為高，可引起氨曲南和碳青霉烯類耐藥。此類酶的活性可被克拉維酸等酶抑制劑所抑制，而EDTA不能抑制，引起臨床關(guān)注和危害較大的腸桿菌科細菌A類碳青霉烯酶主要是KPC酶。B型-內(nèi)酰胺酶 發(fā)現(xiàn)于20世紀60年，依賴金屬離子發(fā)揮催化

14、活性，主要為Zn2+，此酶不被棒酸抑制，被EDTA抑制，其主要特征是除單氨類抗生素（如氨曲南）以外，可水解碳青霉烯酶類等各種 -內(nèi)酰胺類抗生素，主要包括 NDM-1、IMP、VIM、KHM-1、GIM-1 和 SIM-1。對于產(chǎn) B 類酶的菌株的尚無很好的治療手段，值得重視的是對該種酶的檢測，以防止其爆發(fā)流行。C型-內(nèi)酰酶 C型-內(nèi)酰酶通常被稱為頭孢菌素酶1989首次發(fā)現(xiàn)，按Bush分類法屬1群。第1代頭孢菌素是C型-內(nèi)酰胺酶的良好底物，第2、3代頭孢菌素一般對C型-內(nèi)酰胺酶不敏感。亞胺培南和氨曲南則表現(xiàn)出對C型-內(nèi)酰胺酶的抑制作用。主要包括CMY、FOX、MOX、LAT、ACT、ACC、MI

15、R和DHAD型-內(nèi)酰胺酶 D型-內(nèi)酰胺酶Bush分類屬2d群，它們對苯唑西林和氯唑西林的水解速度明顯大于芐青霉素，因此，它們又被稱為“苯唑西林酶”，其中OXA-48 在碳青霉烯類耐藥中顯示出了日趨重要的碳青霉烯酶的活性。超廣譜-內(nèi)酰胺酶 ESBLs是一大類基于TEM-1、TEM-2和 SHV-1型內(nèi)酰胺酶基礎(chǔ)上經(jīng)突變而成的多種-內(nèi)酰胺酶，水解青霉素、廣譜青霉素、頭孢菌素、單環(huán)類、第四代頭孢菌素，但不能水解碳青霉烯類、頭霉素類。除了對內(nèi)酰胺類抗生素耐藥外，經(jīng)常伴隨對氨基糖苷類等其他抗生素的耐藥性。 準確區(qū)分ESBLs和非ESBLs菌株，不僅可指導臨床合理用藥，以免延誤病情和增加醫(yī)療費用，而且有利

16、于對ESBL菌株的管理，控制其傳播，防止爆發(fā)流行，對提高治療效果和控制醫(yī)院院內(nèi)感染均有重要意義。AmpC酶 G-桿菌產(chǎn)生的不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶組成的一個酶家族,屬于-內(nèi)酰胺酶分子分類中的C類。產(chǎn)AmpC酶的耐藥菌幾乎對所有的-內(nèi)酰胺類藥物耐藥,對第4代頭孢菌素如頭孢吡肟敏感,對碳青霉烯類如亞胺培南、美羅培南有高度的活性。 AmpC酶可分為質(zhì)粒介導型和染色體介導型。質(zhì)粒AmpC基因來源于幾種腸桿菌科細菌染色體AmpC基因,其AmpC沒有調(diào)控基因,呈持續(xù)高表達,且質(zhì)粒編碼常同時攜帶有其他的耐藥基因,因而導致多重耐藥,并且傳播很快,主要在大腸埃希菌、肺炎克雷白桿菌、沙門菌屬和志賀菌屬中出現(xiàn)。

17、染色體介導的AmpC酶能水解第3代頭孢菌素等-內(nèi)酰胺類抗生素,其高水平表達與調(diào)節(jié)基因突變有關(guān) ,當AmpD基因突變產(chǎn)生有缺陷的AmpD蛋白時,可引起AmpC過度表達,使產(chǎn)酶量大增引起耐藥,多見于陰溝腸桿菌。氨基糖苷修飾酶 乙酰基轉(zhuǎn)移化酶(AAC)、磷酸轉(zhuǎn)化酶 (APH)和腺苷酸轉(zhuǎn)化酶(ANT)。 人們一直認為耐藥菌株產(chǎn)生的氨基糖苷類修飾酶是主要的耐藥機制，但臨床分離致病菌株16S rRNA甲基化酶的發(fā)現(xiàn)改變了人們的觀點。此酶可由質(zhì)粒介導進行垂直和或水平播散，使細菌對氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生多藥交叉耐藥及高水平耐藥，給臨床醫(yī)生治療革蘭氏陰性桿菌感染帶來更加嚴峻的挑戰(zhàn)?？股刈饔玫陌形稽c發(fā)生突變 細菌

18、通過對特定位點的突變，改變了與抗菌藥物結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)，或產(chǎn)生了新的不能與抗生素結(jié)合的替代物質(zhì)，或產(chǎn)生了保護性的物質(zhì)阻止了抗生素的結(jié)合而逃避抗生素的作用。 鏈霉素 結(jié)合部位是30S亞基上的SI2蛋白,若SI2蛋白的構(gòu)型改變,使鏈霉素不能與其結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性； 紅霉素 靶部位是50S亞基的L4或L12蛋白,當染色體上的ery基因突變,使L4或L12蛋白構(gòu)型改變,便會出現(xiàn)對紅霉素的耐藥性； 利福平 作用點是RNA聚合酶的基因,當其突變時,就產(chǎn)生了耐藥性； 青霉素 靶部位是細胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白(PBPs),PBPs具有酶活性,參與細胞壁的合成,是-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位,細菌改變了PBPs的結(jié)構(gòu)

19、,可導致耐藥性； 喹諾酮類藥物 靶部位是DNA旋轉(zhuǎn)酶,當基因突變引起酶結(jié)構(gòu)的改變,阻止喹諾酮類藥物進入靶位,可造成喹諾酮類所有藥物的交叉耐藥。外膜通透性改變 一些具有高滲透性外膜、對抗菌藥物原來敏感的細菌,可以通過降低外膜的滲透性而出現(xiàn)耐藥性。如原來允許某種抗菌藥物通過的孔蛋白通道由于細菌發(fā)生突變而使該孔蛋白通道關(guān)閉或消失，細菌就會對該抗菌藥物產(chǎn)生很高的耐藥性。 此種耐藥機制往往對抗菌藥物特異性較差，具有多重耐藥性，銅綠假單胞菌的外膜對多種抗菌藥物如內(nèi)酰胺類、酶抑制劑、四環(huán)素、氯霉素和喹諾酮類的通透性極低，而導致先天耐藥。主動外排作用 主動外排作用是微生物對藥物產(chǎn)生耐藥性的一個重要機制，源于2

20、0世紀80年代關(guān)于大腸埃希菌對四環(huán)素耐藥機制的研究,它是由藥物外輸泵來完成的。 藥物外輸泵是一類位于細胞膜上的具有特殊結(jié)構(gòu)的膜轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，其作用機理為當細胞內(nèi)的藥物濃度聚集達到一定數(shù)值時，藥物外輸泵系統(tǒng)相關(guān)mRNA 的表達增加，結(jié)果使細胞膜上外輸泵的數(shù)量增加,使細胞內(nèi)的藥物被泵出。外排系統(tǒng)廣泛存在于G+ 菌、 G-菌、真菌及哺乳類細胞(如癌細胞)中,其與細菌外膜通透性改變在多重耐藥中起重要作用, 愈來愈受到研究者重視。細菌生物膜的作用 細菌生物膜(BF)是指細菌吸附于生物材料或機體腔道表面,分泌多糖蛋白復合物,并將自身包繞其中形成的膜樣物質(zhì)。 細菌在BF的保護下可逃避抗菌藥物的殺傷作用和免疫細

21、胞的吞噬作用。與浮游菌比較,BF細菌對抗生素的抗藥性可提高101000倍,其主要取決于BF多細胞結(jié)構(gòu): BF中的胞外多糖起屏障作用,限制抗生素分子向細菌運輸; BF中微環(huán)境的不同可影響抗生素的活性; BF細菌表面生長可誘導細菌表達出與浮游細菌不同的基因,誘導產(chǎn)生BF特異性表型; 多菌種BF中各菌種的協(xié)同作用。具有生物膜的細菌多見于銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、變異鏈球菌。轉(zhuǎn)座子介導的耐藥性 轉(zhuǎn)座子(Tn)是一種比質(zhì)粒更小的DNA片段, 它能夠隨意地插入或躍出其他DNA分子中, 通常借助細菌的染色體、噬菌體或質(zhì)粒得以復制并插入到新的位點,或?qū)⒆陨韽脑稽c剪切掉再插入到新的位點,從而使宿主

22、細胞失去對抗菌藥物的敏感性。 在細菌對萬古霉素的耐藥性機制研究中發(fā)現(xiàn)VanA 基因存在于Tn1546中,這一轉(zhuǎn)座子含有9個基因,其中有2個編碼萬古霉素耐藥基因的“VanA基因簇”。Tn還可以使位于染色體上和非接合質(zhì)粒上的基因轉(zhuǎn)移到接合質(zhì)粒中,實現(xiàn)細菌間的基因轉(zhuǎn)移或交換。此外,耐藥基因的轉(zhuǎn)移和傳播也可以通過轉(zhuǎn)座子、整合子和質(zhì)粒等可移動的遺傳元件介導。細菌整合子系統(tǒng) 整合子( integron)是近年來發(fā)的新的可移動基因元件,是捕獲外源基因并使之轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄曰虻谋磉_單位。整合子的基本結(jié)構(gòu)由1個編碼整合酶的基因、2個基因重組位點、啟動子和耐藥基因盒組成?；蚝惺菃我坏目梢苿拥腄NA分子, 是由一個

23、開放閱讀框(ORF基因)和一個反向不完全重復序列即59-堿基(59-be)單元組成,59-be是整合酶的識別位點。只有當基因盒被整合子捕獲并整合到整合子中才能轉(zhuǎn)錄,一個整合子可以捕獲一個或多個基因盒。主要內(nèi)容細菌與人類關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細菌耐藥性產(chǎn)生細菌耐藥的檢測耐藥檢測標準 美國國家臨床實驗室標準化委員會(CLSI) 針對每種細菌CLSI會提供質(zhì)控參考菌株 的MIC，檢測的藥物種類，敏感、中介和耐藥的濃度瓊脂稀釋法(MIC 法) 瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化并冷至50左右的定量MH瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平

24、板所含最低藥物濃度為MIC。紙片擴散法 紙片擴散法又稱瓊脂擴散法，將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC呈負相關(guān)。Etest試驗 金標準的藥敏方法,它的特點是結(jié)合瓊脂擴散法和稀釋法的優(yōu)點,濃度呈連續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料試條向瓊脂中擴散，在試條周

25、圍抑菌濃度范圍內(nèi)受試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。 是用擴散法的原理,塑料條的形式定量讀出MIC值。這比傳統(tǒng)的紙片擴散法測抑菌圈的大小精確可靠。自動分析儀 自動分析儀器 待鑒定細菌 藥敏卡ESBLs檢測紙片確認試驗：CLSI標準，CAZ/CLA，CTX/CLA兩組藥敏紙片確認，結(jié)果抑菌環(huán)直徑差值5mm。E-test法：一端是CAZ(0.5-32ug/ml),另一端是CAZ(0.125-8ug/ml) /CLA(4ug/ml), CAZ與CAZ/CLA的MIC比值4。PCR 方法檢測耐藥基因單重PCR：細菌耐藥性的靈敏性和特異性明顯高于傳統(tǒng)藥敏實驗。最大不足之處在于檢測的指標過于單一。多

26、重PCR方法檢測耐藥基因：多重PCR 可以實現(xiàn)多目標耐藥基因的檢測?；蛐酒谀退幓驒z測 DNA 芯片與多重PCR 結(jié)合, 可用于多種耐藥基因的檢測。臨床革蘭氏陰性細菌, 尤其腸桿菌科細菌中, 由于超廣譜-內(nèi)酰胺酶以及頭孢菌素酶的流行, 導致致病菌對主要的一線常用藥- 內(nèi)酰胺類抗生素高度耐藥。因此對介導這些耐藥的耐藥基因進行檢測, 有很大的臨床意義?；驕y序 Sanger法因為既簡便又快速，并經(jīng)過后續(xù)的不斷改良，成為了迄今為止DNA測序的主流。第二代測序技術(shù)是費用更低、通量更高、速度更快的測序技術(shù)，應(yīng)運而生，二代測序的基本原理是邊合成邊測序。 MRSA 紙片擴散法紙片擴散法:苯唑西林在貯存過

27、程中藥效不易降低，且對不均一耐藥性檢測效果更好，所以國內(nèi)多數(shù)實驗室都采用苯唑西林，苯唑西林含量為1g/片，抑菌圈10 mm為耐藥，13 mm為敏感，1112 mm為中介。 瓊脂稀釋瓊脂稀釋(MIC)法法: MIC4 g/ml為耐藥。濃度梯濃度梯度度(Etest)法法 瓊脂篩選法瓊脂篩選法:即MH培養(yǎng)基加NaCl(40 g/L)加苯唑西林(6 g/ml)，將菌液點種或畫線孵育24 h，只要平皿有菌生長，即使一個菌落也是MRSA，該法敏感度為100%。 PCR技術(shù)技術(shù):金黃色葡萄球菌耐苯唑西林的耐藥水平與mec A基因有較好的相關(guān)性。近3年我院血培養(yǎng)G-細菌情況革蘭陰性細菌名稱株數(shù)（株）構(gòu)成比（%

28、）大腸埃希菌13954.3肺炎克雷伯菌3814.84銅綠假單胞菌249.38鮑曼不動桿菌145.47陰溝腸桿菌114.3嗜麥芽食單胞菌51.95傷寒沙門氏菌51.95其他革蘭陰性細菌207.81總計256100近3年我院血培養(yǎng)G-菌耐藥率抗菌藥物大腸埃希菌（n=139）肺炎克雷伯菌 （n=38）銅綠假單胞菌（n=24）鮑曼不動桿菌 （n=14）陰溝腸桿菌（n=11） 阿米卡星15.1%（21）21.1%（8）58.3%（14）64.3%（9）36.4%（4）氨芐青霉素87.1%（121） 100%（38）91.7%（22）100%（14）氨芐青霉素/舒巴坦67.6%（94） 89.5%（34）

29、 83.3%（20）100%（14）氨曲南57.6%（80） 73.7%（28） 79.2%（19）85.7%（12）63.6%（7）頭孢唑啉97.1%（135） 100%（38）100%（24）100%（14）100%（11）頭孢曲松61.2%（85） 73.7%（28） 83.3%（20）85.7%（12）90.9%（10）頭孢他啶59.7%（83） 86.8%（33） 58.3%（14）85.7%（12）72.7%（8）環(huán)丙沙星71.9%（100） 86.8%（33） 87.5%（21）100%（14）90.9%（10）頭孢吡肟20.1%（28） 31.6%（12）85.7%（12）63

30、.6%（7）頭孢呋辛74.1%（103） 78.9%（30）92.9%（13）81.8%（9）近3年我院血培養(yǎng)G-菌耐藥率抗菌藥物大腸埃希菌（n=139）肺炎克雷伯菌（n=38）銅綠假單胞菌（n=24）鮑曼不動桿菌（n=14）陰溝腸桿菌（n=11）磷霉素31.7%（44）42.1%（16）18.2%（2）慶大霉素75.5%（105）84.2%（32）85.7%（12）63.6%（7）亞胺培南4.3%（6）5.3%（2）8.3%（2）42.9%（6）0%（0）左氧氟沙星77.7%（108）92.1%（35）95.8%（23）90.9%（10）美羅培南4.3%（6）5.3%（2）42.9%（6）0

31、%（0）頭孢哌酮/舒巴坦6.5%（9）13.2%（5）50.0%（7）45.5%（5）復方新諾明86.3%（120）97.8%（37）81.8%（9）替加環(huán)素0%（0）0%（0）7.1%（1）0%（0）妥布霉素36.0%（50）55.3%（21）50.0%（12）71.4%（10）45.5%（5）哌拉西林/他唑巴坦 11.5%（16）28.9%（11）41.7%（10）64.3%（9）近3年我院血培養(yǎng)G+性細菌情況細菌種類細菌名稱株數(shù)（株）構(gòu)成比（%）革蘭陽性細菌35155.28表皮葡萄球菌10416.38金黃色葡萄球菌7611.97人葡萄球菌人亞種538.36草綠色溶血性鏈球菌385.98溶

32、血性葡萄球菌314.88腸球菌屬182.83革蘭陽性桿菌60.94其他革蘭陽性細菌253.94近3年我院血培養(yǎng)G+菌耐藥率抗菌藥物表皮葡萄球菌（n=104）金黃色葡萄球菌（n=76）人葡萄球菌人亞種（n=53）草綠色溶血鏈球菌（n=38）溶血性葡萄球菌（n=18）氨芐青霉素66.3%（69）56.6%（43）49.1%（26）55.6%（10）阿莫西林/棒酸 62.5%（65）68.4%（52）60.4%（32）38.9%（7）頭孢曲松31.7%（33）40.8%（31）26.4%（14）18.4%（7） 22.2%（4）克林霉素50.0%（52）58.0%（44）47.2%（25）50.0%（19）27.8%（5）環(huán)丙沙星37.5%（39）52.6%（40）34.0%（18）38.9%（7）紅霉素56.7%（59）53.9%（41）49.1%（26）55.3%（21）72.2%（13）慶大霉素62.5